Name: capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل كلية الطب والصحة العامة في جامعة ويسكونسن من برنامج الشراكة في ولاية ويسكونسن (A.I.M.)، وجائزة التطوير الوظيفي لجمعية القلب الأمريكية 19CDA34660169 (A.I.M. ).

أجريت جميع التجارب وفقا لدليل استخدام ورعاية الحيوانات المختبرية وامتثالا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية الطب والصحة العامة في جامعة ويسكونسن ماديسون. تم تنفيذ جميع الأساليب على النوع البري C57BL/6J (B6) وخطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تم الحصول عليها من مختبرات جاكسون.<...

<ol>
	<li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Kikuchi, K., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regenerative+capacity+and+mechanisms.">Cardiac regenerative capacity and mechanisms.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Savarese, G., Lund, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Public+Health+Burden+of+Heart+Failure.">Global Public Health Burden of Heart Failure.</a> Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice.">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).</li><li>Karwowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+infarct+artery+location,+acute+total+coronary+occlusion,+and+mortality+in+STEMI+and+NSTEMI+patients.">Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients.</a> Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).</li><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).</li><li>MAGGIC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survival+of+patients+with+heart+failure+with+preserved+or+reduced+left+ventricular+ejection+fraction:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis.</a> European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).</li><li>Notari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+local+microenvironment+limits+the+regenerative+potential+of+the+mouse+neonatal+heart.">The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart.</a> Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neonatal+and+adult+mammalian+heart+regeneration+by+the+miR-15+family.">Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Collateral+Artery+Development+Program+Promotes+Neonatal+Heart+Regeneration.">A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration.</a> Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+neonatal+cardiac+extracellular+matrix+prevents+widespread+ventricular+remodeling+in+adult+mammals+after+myocardial+infarction.">Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction.</a> Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).</li><li>Mahmoud, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+Regulate+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration.">Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).</li><li>Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+lineage+tracing+methods+and+intestinal+tumors.">Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.</a> Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Phillips, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum:+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease.">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Scientific Reports. 6, 26013 (2016).</li><li>Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+in+Neonatal+Mice,+A+Model+of+Cardiac+Regeneration.">Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).</li><li>Sereti, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+clonal+expansion+during+mouse+heart+development+and+injury.">Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).</li><li>Lepilina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration.">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127 (3), 607-619 (2006).</li><li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair.">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li><li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li></ol>

تفاعلات الخلية بين خلايا القلب والسكان غير myocyte هي عامل حاسم في ما إذا كان القلب سيخضع للتليف أو إصلاح بعد الإصابة. وقد تم إجراء اكتشافات تثبت أن مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الأعصاب14،الخلايا epicardial24،الضامة الباسيمي25، الشرايين12،,<...

منذ فترة طويلة يعتبر القلب أن يكون جهاز ما بعد mitotic، ولكن الأدلة الأخيرة تثبت أن تجديد عضلة القلب يحدث في قلب الإنسان الكبار في حوالي 1٪ في السنة1. ومع ذلك، هذه المعدلات المنخفضة من دوران عضلة القلب غير كافية لتجديد فقدان هائلة من الأنسجة التي تحدث بعد الإصابة. القلب الذي عانى من احتشاء عضلة القلب سوف تفقد حوالي مليار عضلة القلب، وغالبا ما تكون بمثابة مقدمة لفشل القلب والموت القلبي المفاجئ2،3. مع أكثر من 26 مليون شخص يعانون من قصور القلب في جميع أنحاء العالم، هناك حاجة غير ملباة للعلاجات التي يمكن أن تعكس الأضرار الناجمة عن أمراض القلب4.
من أجل سد هذه الفجوة في العلاجات، بدأ العلماء التحقيق في الآليات المحفوظة تطوريا التي تكمن وراء التجديد الذاتي ة بعد الإصابة. نموذج واحد لدراسة تجديد القلب الثدييات هو الفأر الوليدي. في غضون الأسبوع التالي للولادة ، تتمتع الفئران الوليدية باستجابة تجديدية قوية بعد تلف القلب5. لقد أثبتنا سابقا أن الفئران حديثي الولادة يمكن تجديد قلوبهم عن طريق انتشار عضلة القلب بعد استئصال apical5. على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن تثير تجديد القلب في الولدان، فإن الجراحة تفتقر إلى الصلة السريرية لإصابات القلب البشرية. من أجل تقليد إصابة بشرية في نموذج الفأر الوليدي ، قمنا بتطوير تقنية للحث على احتشاء عضلة القلب من خلال انسداد الشريان التاجي6. تتطلب هذه التقنية الربط الجراحي للشريان الأمامي الأيسر التنازلي (LAD) ، وهو مسؤول عن توصيل 40٪ -50٪ من الدم إلى عضلة القلب البطينية اليسرى6،7. وبالتالي ، فإن الجراحة تؤدي إلى احتشاء يؤثر على جزء كبير من جدار البطين الأيسر. هذا الضرر الذي يلحق بعضلة القلب سيحفز انتشار عضلة القلب وتجديد القلب في الولدان5.
توفر جراحة انسداد الشريان التاجي طريقة مترجمة وقابلة للاستنساخ بشكل كبير للكشف عن الأعمال الداخلية لتجديد القلب. ويوازي جراحة حديثي الولادة تصلب الشرايين التاجية في قلب الإنسان، حيث تراكم البلاك داخل الجدران الداخلية للشرايين يمكن أن يسبب انسداد واحتشاء عضلة القلب اللاحقة8. بسبب الفراغ في العلاجات العلاجية لمرضى قصور القلب ، يرتبط الانسداد في LAD بمعدلات الوفيات التي تصل إلى 26٪ في غضون عام بعد الإصابة9، وبالتالي تم تسميته "صانع الأرملة". تتطلب التطورات في العلاجات نموذجًا يعكس بدقة الآثار الفسيولوجية والمرضية المعقدة لإصابة القلب. يوفر البروتوكول الجراحي لإصابة قلب الفأر الوليدية منصة تسمح للباحثين بالتحقيق في الإشارات الجزيئية والخلوية التي تشير إلى تجديد قلب الثدييات بعد الإصابة.
يسلط البحث الأخير الضوء على العلاقة الديناميكية بين البيئة خارج الخلية وخلايا القلب المنتشرة. على سبيل المثال ، يمكن تمديد نافذة التجدد بعد الولادة عن طريق تقليل صلابة المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالقلب10. المواد الحيوية من مصفوفة خارج الخلية الوليدية يمكن أيضا تعزيز تجديد القلب في قلوب الثدييات البالغة بعد إصابة القلب11. كما يرافق انتشار عضلة القلب هو استجابة أنجيوجينيك12،13؛ وقد تبين أن تكوين الشريان الجانبي الفريد من نوعه لقلب الفأر الوليدي التجدد ضروري لتحفيز تجديد القلب12. وعلاوة على ذلك، أثبت مختبرنا أن الإشارات العصبية تنظم انتشار عضلة القلب وتجديد القلب عن طريق تعديل مستويات عامل النمو، فضلا عن الاستجابة الالتهابية بعد الإصابة14. هذه النتائج تؤكد على الحاجة إلى تتبع مجموعات الخلايا غير myocyte استجابة لإصابات القلب. من أجل تحقيق هذا الهدف، استفدنا من نظام إعادة تركيب Cre-lox في خطوط الفئران المعدلة وراثيا لدمج التعبير التأسيسي أو المشروط لبروتينات مراسل الفلورسنت لتتبع النسب. وعلاوة على ذلك، يمكننا استخدام أساليب متقدمة لتحديد نمط التوسع clonal مع خط الماوس قوس قزح، الذي يعتمد على التعبير العشوائي من المراسلين الفلورسنت تعتمد على Cre، متعددة الألوان لتحديد التوسع clonal من مجموعات الخلايا المستهدفة15. توظيف تتبع النسب مع جراحة انسداد الشريان التاجي الوليدي هو أداة قوية لتشريح الآليات الخلوية المعقدة لتجديد القلب.
من الصعب تتبع نسب الخلايا المسماة بالفلورسنت مع تصوير الأعضاء ثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام تقنية الإخراج وإعادة البناء التقليدية - خاصة عندما تكون مجموعات الخلايا هشة ، مثل الألياف العصبية أو الأوعية الدموية. في حين أن التصوير المباشر الكامل للجهاز عن طريق الإخراج البصري يمكن التقاط مجموعات الخلايا السطحية ، فإن الهياكل التي توجد في عمق الأنسجة لا تزال غير قابلة للوصول. للتحايل على هذه الحواجز ، تم تطوير تقنيات إزالة الأنسجة للحد من غموض أنسجة الأعضاء بأكملها. في الآونة الأخيرة ، تم إحراز تقدم كبير في مسح الدهون تبادل الأكريلاميد الهجين التصوير جامدة الأنسجة المتوافقة hYdrogel (وضوح) - الأساليب القائمة ، والتي واضحة الأنسجة الثابتة عن طريق استخراج الدهون16. كما يتم اتخاذ خطوات لتجانس مؤشر الانكسار وتقليل بعد ذلك تشتت الضوء أثناء التصوير17. واحدة من هذه الطريقة هي الوضوح النشط ، مما يسرع تحلل الدهون باستخدام الكهربية لاختراق المنظفات في جميع أنحاء الأنسجة18. على الرغم من فعالية، وهذا الأسلوب تطهير الأنسجة يتطلب معدات باهظة الثمن ويمكن أن يسبب تلف الأنسجة، مما يجعل النهج غير متوافق مع مجموعات الخلايا الهشة مثل الأعصاب القلبية19. وهكذا ، فإننا نستخدم نهج الوضوح السلبي ، الذي يعتمد على الحرارة لتسهيل اختراق المنظفات بلطف ، وبالتالي المساعدة في الاحتفاظ بهياكل الخلايا المعقدة20،21.
ويعتقد عادة الوضوح السلبي لتكون أقل كفاءة من الوضوح النشط18، كما يرافق هذه التقنية في كثير من الأحيان من قبل اثنين من العقبات الرئيسية : عدم القدرة على مسح عمق الجهاز بأكمله وكمية طويلة من الوقت اللازم لمسح أنسجة الكبار. يتغلب نهج الوضوح السلبي لدينا على كل من هذه الحواجز من خلال عملية تطهير سريعة قادرة على إزالة أنسجة القلب الوليدية والبالغين بشكل كامل. وقد وصلت تقنية إزالة الأنسجة السلبية CLARITY لدينا إلى الكفاءة التي تسمح بتصور مجموعة متنوعة من مجموعات خلايا القلب ، بما في ذلك مجموعات نادرة موزعة في جميع أنحاء قلب البالغين. عندما يتم تصوير القلب مسح مع المجهر المعالبؤر، يمكن إضاءة الهندسة المعمارية للنقش الخلايا محددة أثناء التنمية، والمرض، والتجدد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-thioglycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Prolene Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8889H</td>
			<td>Polypropylene Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16-050-146</td>
			<td>Half Curved, Serrated, 4 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-812-39</td>
			<td>Dissecting, 4.5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vial</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-339-26A</td>
			<td>12 x 35 mm Vial with Cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>2 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td>Straight, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-966</td>
			<td>Mayo-Hegar, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Forceps</td>
			<td>Sigma-Adrich</td>
			<td>Z168777</td>
			<td>Fine Tip, Straight, 4.25 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Dissecting Scissor</td>
			<td>Walter Stern Inc</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>30 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16050133</td>
			<td>Medium Tissue, 1X2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>Water-soluble azo initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging

ويفوق عدد أمراض القلب والأوعية الدموية جميع أسباب الوفاة الأخرى، وهو مسؤول عن 31% من الوفيات المذهلة في جميع أنحاء العالم. يتجلى هذا المرض في الإصابة القلبية ، في المقام الأول في شكل احتشاء عضلة القلب الحاد. مع القليل من المرونة بعد الإصابة ، سيتم استبدال أنسجة القلب السليمة ذات مرة بأنسجة ندبة ليفية وغير منقدة وغالباً ما تكون مقدمة لفشل القلب. لتحديد خيارات العلاج الجديدة في الطب التجديدي ، ركزت الأبحاث على الفقاريات ذات القدرات التجديدية الفطرية. أحد هذه الكائنات النموذجية هو الفأر الوليدي ، الذي يستجيب لإصابة القلب بتجديد عضلة القلب القوي. من أجل الحث على إصابة في الفأر الوليدي ذات الصلة سريريا، قمنا بتطوير عملية جراحية لانسداد الشريان الأمامي الأيسر التنازلي (LAD)، مما يعكس احتشاء عضلة القلب الناجم عن تصلب الشرايين في قلب الإنسان. عندما تتطابق مع التكنولوجيا لتتبع التغييرات على حد سواء داخل خلايا القلب والسكان غير myocyte، وهذا النموذج يوفر لنا منصة لتحديد الآليات التي توجه تجديد القلب. كان اكتساب نظرة ثاقبة في التغيرات في مجموعات خلايا القلب بعد الإصابة يعتمد بشكل كبير على طرق مثل تقسيم الأنسجة والفحص النسيجي ، والتي تقتصر على التحليل ثنائي الأبعاد وغالباً ما تتلف الأنسجة في هذه العملية. وعلاوة على ذلك، تفتقر هذه الأساليب إلى القدرة على تتبع التغيرات في أنساب الخلايا، وبدلاً من ذلك تقدم مجرد لقطة من استجابة الإصابة. هنا ، ونحن نصف كيف يمكن استخدام الأساليب المتقدمة تكنولوجيا في نماذج تتبع النسب ، وتطهير الجهاز كله ، والمجهر ثلاثي الأبعاد (3D) كامل جبل لتوضيح آليات إصلاح القلب. مع بروتوكول نا لجراحة احتشاء عضلة القلب الماوس الوليدي، وتطهير الأنسجة، وتصوير الجهاز كله 3D، يمكن كشف المسارات المعقدة التي تحفز انتشار عضلة القلب، والكشف عن أهداف علاجية جديدة لتجديد القلب.

في كثير من الأحيان خطوتين الأكثر تحديا هي توجيه القلب للخروج من تجويف الصدر وligating LAD. لاستكشاف هذه الخطوات، قد يتم إجراء تعديلات في موضع الثقب الأولي بين العضلات بين الوكوستية الرابعة; إذا كان الثقب والتشريح الحاد قريبين جدًا من القص ، فقد لا يتمكن القلب من الخروج من تجويف الصدر...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

انتشار القلب وخلايا القلب بعد الإصابة هي عملية ديناميكية تتطلب سيمفونية من الإشارات خارج الخلية من مجموعات الخلايا غير myocyte. باستخدام تتبع النسب ، والوضوح السلبي ، وتقنيات المجهر ثلاثي الأبعاد كامل جبل confocal ، يمكننا تحليل تأثير مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا على إصلاح القلب والتجدد.

التقاط استجابة إصابات القلب من مجموعات الخلايا المستهدفة عن طريق مسح القلب التصوير ثلاثي الأبعاد

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

تجديد القلب الذاتية هي عملية ديناميكية تنطوي على أنواع الخلايا المتعددة التي تعمل معا في الحفل لتركيب استجابة قوية التجدد. النظر في تجديد الأنسجة عن طريق التصوير 3D من القلب واضحة ردا على الاصابة يمكن أن تساعد في إعادة بناء ديناميات الخلوية التي توجه هذه الاستجابة تجديد القلب. تم تصميم بروتوكولنا خصيصًا لتتبع الخلايا أثناء التطوير والتجديد.نحن لا نتوقع أي قيود في تطبيق على نطاق واسع لدينا تطهير، وتلطيخ وتقنيات التصوير لأنواع الأعضاء الأخرى. لانسداد الشريان التاجي الناجم عن LAD، أولا تعقيم المنطقة الجراحية للجرو الوليدي تخدير يوم واحد مع محلول مطهر. إجراء شق الجلد عرضية في منطقة الصدر.لفصل الجلد عن العضلات، استخدمي زوج من ملقط الضمادات لرفع الجلد بعناية أثناء الضغط بلطف على المقص ضد العضلات الوربية في وضع مغلق. حدد مكان الفضاء الوربي الرابع واستخدم ملقط صغيرة لجعل ثقب سطحي صغير مع الحرص على تجنب الأعضاء الداخلية. باستخدام تشريح حادة وملبس خلع الملابس، توسيع المنطقة بين العضلات الوربية فقط حتى يمكن تطبيق إصبع على الجانب الأيسر من البطن في حين عقد الفضاء الوربي مفتوحة مع ملقط خلع الملابس لتوجيه بلطف القلب للخروج من تجويف الصدر.بمجرد استخراج القلب، والسماح للقلب للراحة على العضلات النترية وتحديد موقع LAD كمنطقة القلب مع أقل تجمع الدم. للحث على احتشاء عضلة القلب ، استخدم خياطة 6-0 لربط عقدة مربعة بإحكام حول الوعاء مرتين دون قطع الشريان. وينبغي أن يلاحظ في التبييض على الفور.من المهم أن تبقى متسقة على وضع الغرز على طول LAD لحجم مماثل. ويتحقق ذلك على أفضل أفضل المدى من خلال الوصول إلى القلب بسرعة في حين أن الدم لا يزال يتدفق عبر الشرايين. عندما يتم وضع الغرزة، اسمح للقلب أن ينزلق مرة أخرى إلى تجويف الصدر.خياطة الأضلاع جنبا إلى جنب مع جراح واحد وعقدة مربع واحد باستخدام ملقط حادة لرفع المجموعة العليا من الأضلاع في حين يمر خياطة 6-0 من خلال مجموعة العلوي والسفلى من الأضلاع. تطبيق حجم صغير من الغراء الجلد إلى الجزء العلوي من البطن واستخدام ملقط غرامة لوضع الجلد من أسفل البطن على منطقة الصدر المكشوفة. ثم ضع الجرو على وسادة التدفئة وأداء الربط على الحيوان المقبل.عندما يتم إجراء جميع العمليات الجراحية، إعادة الجراء الدافئة والمتحركة إلى قفص الأم المنزلي. للوضوح السلبي من أنسجة القلب المحصودة، 21 يوما بعد الجراحة بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القار، ووضع الماوس على منطقة جراحية نظيفة في موقف supine وتأمين الأطراف مع الشريط. باستخدام ملقط الأنسجة، فهم الفراء فقط تحت عملية xiphoid وجعل شق يمتد عرض القفص الصدري.قطع جنبا إلى جنب مع أجزاء من القفص الصدري واستخدام ملقط لرفع عملية xiphoid لفضح الحجاب الحاجز. فصل الحجاب الحاجز مع ملقط منحني وسحب الأنسجة كريا حتى يمكن الوصول إلى القلب النابض. استخدام ملقط منحني لفهم القلب في قاعدة واستخدام مقص استئصال iriddectomy لقطع الشريان الأبهر و الأجوف الأجوف فينا متفوقة.وضع القلب النابض في طبق بيتري من برنامج تلفزيوني بحيث يضخ القلب أي دم محتفظ به. يمكن تأكيد احتشاء عضلة القلب من خلال وضع تشريحي صحيح لأربطة LAD. عندما يتوقف القلب عن النبض ، اضغط بلطف على العضو باستخدام ملقط لطرد الدم المتبقي ونقل العينة إلى قارورة زجاجية يمكن التخلص منها 2.5 ملليلتر تحتوي على ملليلترين من PBS.ضع القارورة على شاكر لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة تغيير حل PBS كل 10 دقائق حتى يبقى الحل واضحًا من الدم. عندما يكون برنامج تلفزيوني واضح، استبدال برنامج تلفزيوني مع ملليلتر اثنين من بارد 4٪ شبهformaldehyde لمدة أربع ساعات حضانة في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة يغسل 10 دقيقة على شاكر مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل. بعد الغسيل الأخير، ملء القارورة مع مليلترين من 4٪ أكريلاميد تكملها 0.5٪ VA-044 حل لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.في اليوم التالي، ضع القارورة في كتلة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. في نهاية البلمرة، نقل القلب إلى قارورة قذيفة زجاجية جديدة وغسل أنسجة القلب في مليلترين من برنامج تلفزيوني الطازجة 10 دقيقة في وقت منعش برنامج تلفزيوني في نهاية كل حضانة. عندما يكون PBS واضحًا، استبدل مخزن الغسيل بمحل إزالة المليلترين.احتضان العينة في 37 درجة مئوية لعدة أسابيع حتى القلب هو واضح، منعش حل المقاصة كل يومين إلى ثلاثة أيام. عندما يكون العضو واضحًا ، اغسل العينة مع PBS على الشاكر كما هو موضح قبل إعادة ملء القارورة بـ PBS جديدة لمدة 24 ساعة في حضانة عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استبدل برنامج تلفزيوني مع RIMS لاحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية.في نهاية الحضانة ، يتم مسح الأنسجة بالكامل. وينبغي أن تصبح شفافة الأنسجة بعد عدة أسابيع. لتصوير قلب فأر ما بعد الولادة بعد تحريض احتشاء عضلة القلب، املأ نصف غرفة شريحة الاكتئاب المصنوعة خصيصًا مع PBS واستخدم ملقطًا منحنية لنقل القلب المصفى بعناية إلى الغرفة.ملء وحدة التخزين المتبقية من الغرفة مع برنامج تلفزيوني. ثم ملء الغرفة مع برنامج تلفزيوني حتى سطح السائل يشكل قبة فوق الجزء العلوي من الغرفة وجبل الشريحة الغطاء قبل تصوير الأنسجة عن طريق المجهر confocal وفقا لبروتوكولات التصوير القياسية. إذا كان الثقب وتشريح حادة قريبة جدا في القرب من القص، قد لا يكون القلب قادرا على الخروج من تجويف الصدر.إذا كان القلب لا يخرج بسهولة من التجويف ، فضغط على البطن الأيسر لتسهيل العملية. قد تحدث مضاعفات من يستريح القلب على العضلات الوربية. لذلك ، من المهم الحفاظ على تشريح حاد إلى الحد الأدنى من الحجم في اتجاه أفقي للسماح لتصور واضح وسهولة الوصول إلى LAD.لاحظ أن الربط السطحي سيكون أقل مساحة للتكيف في وضع خياطة النهائي وأنه ينبغي إجراء خياطة ربط حول LAD مع حركات ثابتة تسيطر عليها. في نهاية خطوة المقاصة ، يجب أن يكون القلب بأكمله معتمًا باستمرار بدون تغير في الوسط. بعد بضعة أيام في حل RIMS في درجة حرارة الغرفة، يجب أن يتم مسح القلب تماما ويمكن ملاحظة بعض توسع الأنسجة.كما لوحظ من قبل tdTomato التعبير عن البروتين مراسل، والأعصاب القلبية هي سطحية أساسا مع بعض السكان المقيمين في طبقة epicardial. الأهم من ذلك، يتم الحفاظ على تأكيد التعبير عن البروتين مراسل بعد خضوعه لبروتوكول وضوح كما هو موضح. تطهير وتصوير القلب 3D يوفر منظور في الموقع ومورفولوجيا مجموعات الخلايا القلبية.وهذا يسمح لنا لتحديد جوانب جديدة في الخلية النقش والتفاعلات الخلية الخلية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

التمايز من العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية على الثقافات الثلاث الأبعاد، تحليل الجينات الرنا الميكروي، واعتبارا الهدف

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

جيل من الفئران القلب منظم ضربات القلب المجاميع خلية استنادا ES-الخلوي البرمجة في الجمع مع Myh6-المروج-اختيار

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

يعاير بالسكان خلية الدم لل<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; اليرقة

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

عزل بالسكان خلية حول الأوعية متعددة القدرات السلائف من قلب الإنسان الأنسجة

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

التقديم ثلاثي الأبعاد وتحليل إيمونولابيليد، أوضح البشري شبكات الأوعية الدموية فيلوس المشيمية

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

مكافئات الأنسجة البشرية التحريضية ثلاثية الأبعاد للثة

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

الثقافات أورجانوتيبيك ثلاثي الأبعاد للأجهزة الحسية السمعية والدهليزيه

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...