Name: capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Finansieringen af dette projekt blev ydet af UW School of Medicine and Public Health fra Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), og en American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen for brug og pleje af laboratoriedyr og i overensstemmelse med den institutionelle Animal Care and Use Committee i School of Medicine and Public Health ved University of Wisconsin-Madison. Alle metoder blev udført på vilde type C57BL/6J (B6) og transgene muselinjer fremstillet af Jackson Laboratories.
1. Koronararterie Okklusion (Myokardieinfarkt) Induceret via Ligation af venstre anterior faldende arterie (LAD) i 1-dags-gamle neonat...

<ol>
	<li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Kikuchi, K., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regenerative+capacity+and+mechanisms.">Cardiac regenerative capacity and mechanisms.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Savarese, G., Lund, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Public+Health+Burden+of+Heart+Failure.">Global Public Health Burden of Heart Failure.</a> Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice.">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).</li><li>Karwowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+infarct+artery+location,+acute+total+coronary+occlusion,+and+mortality+in+STEMI+and+NSTEMI+patients.">Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients.</a> Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).</li><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).</li><li>MAGGIC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survival+of+patients+with+heart+failure+with+preserved+or+reduced+left+ventricular+ejection+fraction:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis.</a> European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).</li><li>Notari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+local+microenvironment+limits+the+regenerative+potential+of+the+mouse+neonatal+heart.">The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart.</a> Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neonatal+and+adult+mammalian+heart+regeneration+by+the+miR-15+family.">Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Collateral+Artery+Development+Program+Promotes+Neonatal+Heart+Regeneration.">A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration.</a> Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+neonatal+cardiac+extracellular+matrix+prevents+widespread+ventricular+remodeling+in+adult+mammals+after+myocardial+infarction.">Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction.</a> Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).</li><li>Mahmoud, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+Regulate+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration.">Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).</li><li>Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+lineage+tracing+methods+and+intestinal+tumors.">Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.</a> Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Phillips, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum:+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease.">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Scientific Reports. 6, 26013 (2016).</li><li>Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+in+Neonatal+Mice,+A+Model+of+Cardiac+Regeneration.">Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).</li><li>Sereti, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+clonal+expansion+during+mouse+heart+development+and+injury.">Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).</li><li>Lepilina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration.">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127 (3), 607-619 (2006).</li><li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair.">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li><li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li></ol>

Celle-celle interaktioner mellem kardiomyocytter og ikke-myocyt populationer er en afgørende faktor for, om hjertet vil gennemgå fibrose eller reparation efter skade. Opdagelser er blevet gjort viser, at en række celletyper, herunder nerver14, epikardieceller24, peritoneal makrofager25, arterioler12,13, og lymfeformet endotelceller26, alle spiller en væsentlig roll...

Hjertet har længe været anset for at være et post-mitotisk organ, men de seneste beviser viser, at kardiomyocyt fornyelse forekommer i det voksne menneskelige hjerte på omkring 1% om året1. Men, disse lave satser for kardiomyocyte omsætning er utilstrækkelige til at genopbygge den massive tab af væv, der opstår efter skade. Et hjerte, der har lidt en myokardieinfarkt vil miste omkring en milliard kardiomyocytter, ofte tjener som en optakt til hjertesvigt og pludselig hjertedød2,3. Med over 26 millioner mennesker ramt af hjertesvigt på verdensplan, er der et udækket behov for terapi, der kan vende de skader, som hjertesygdomme4.
For at bygge bro over denne kløft i terapeutisk, forskere er begyndt at undersøge evolutionært bevarede mekanismer, der ligger til grund endogen regenerering efter skade. En model til at studere pattedyr hjerteregenerering er neonatal mus. Inden for ugen efter fødslen har nyfødte mus et robust regenerativt respons efter hjerteskader5. Vi har tidligere vist, at neonatal mus kan regenerere deres hjerte via kardiomyocyt spredning efter en apikal resektion5. Selv om denne teknik kan fremkalde hjerteregenerering i nyfødte, mangler operationen klinisk relevans for menneskelige hjerteskader. For at efterligne en menneskelig skade i neonatal mus model, har vi udviklet en teknik til at fremkalde en myokardieinfarkt gennem en koronararterie okklusion6. Denne teknik kræver kirurgisk ligation af venstre anterior faldende arterie (LAD), som er ansvarlig for at levere 40%-50% af blodet til venstre ventrikulær myokardiet6,7. Således, operationen resulterer i en infarkt, der påvirker en betydelig del af venstre ventrikelvæg. Denne skade på myokardiet vil stimulere kardiomyocyt spredning og hjerte regenerering i nyfødte5.
Koronararterieokklusionkirurgi giver en meget reproducerbar og direkte translationel metode til at afdække de indre funktioner i hjerteregenerering. Den neonatal kirurgi paralleller koronararterie åreforkalkning i det menneskelige hjerte, hvor ophobning af plak inden for de indre vægge af arterierne kan forårsage en okklusion og efterfølgende myokardieinfarkt8. På grund af et tomrum i terapeutiske behandlinger for hjertesvigt patienter, en okklusion i LAD er forbundet med dødelighed en nåede op til 26% inden for et år efter skade9, og derfor er blevet kaldt "enke maker." Fremskridt inden for terapi kræver en model, der præcist afspejler de komplekse fysiologiske og patologiske virkninger af hjerteskade. Vores kirurgiske protokol for neonatal mus hjerteskade giver en platform, der giver forskerne mulighed for at undersøge de molekylære og cellulære signaler, der signalerer pattedyr hjerte regenerering efter skade.
Nyere forskning fremhæver det dynamiske forhold mellem det ekstracellulære miljø og prolifererende kardiomyocytter. For eksempel kan det postnatale regenerative vindue forlænges ved at mindske stivheden af den ekstracellulære matrix omkring hjertet10. Biomaterialer fra neonatal ekstracellulær matrix kan også fremme hjerte regenerering i voksne pattedyr hjerter efter hjerteskade11. Også ledsagende kardiomyocyt spredning er en angiogenic respons12,13; sikkerhedsstillelse arterie dannelse unikke for regenererende hjertet af neonatal musen viste sig at være afgørende for at stimulere hjerteregenerering12. Desuden har vores laboratorium vist, at nerve signalering regulerer kardiomyocyt spredning og hjerte regenerering via graduering af vækstfaktor niveauer, samt den inflammatoriske reaktion efter skade14. Disse resultater understreger behovet for at spore ikke-myocyt cellepopulationer som reaktion på hjerteskade. For at nå dette mål, har vi benyttet os af Cre-lox rekombinationssystem i transgene mus linjer til at indarbejde konstituerende eller betinget udtryk for fluorescerende reporter proteiner til afstamning sporing. Desuden kan vi bruge avancerede metoder til at bestemme klonale ekspansion mønstre med Rainbow muselinje, som er afhængig af stokastiske udtryk for Cre-afhængige, multi-farve fluorescerende journalister til at bestemme klonal udvidelse af målrettede cellepopulationer15. Beskæftiger afstamning opsporing med neonatal koronararterie okklusion kirurgi er et kraftfuldt værktøj til at dissekere de indviklede cellulære mekanismer hjerteregenerering.
Sporing afstamning af fluorescerende mærkede celler med tre-dimensionelle (3D) hele organ imaging er vanskeligt at opnå ved hjælp af traditionelle skæring og genopbygning teknik – især når cellepopulationer er skrøbelige, såsom nervefibre eller blodkar. Mens direkte hel-mount billeddannelse af orglet ved optisk skæring kan fange overfladiske cellepopulationer, strukturer, der bor dybt inde i vævet forbliver utilgængelige. For at omgå disse barrierer er der udviklet vævsrydningsteknikker for at reducere opaciteten af hele organvæv. For nylig, betydelige fremskridt er blevet gjort for at Clear Lipid-udvekslede Acrylamid-hybridiseret Rigid Imaging kompatible Tissue hYdrogel (CLARITY)-baserede metoder, som klare fast væv via lipid ekstraktion16. Der tages også skridt til at homogenisere brydningsindekset og derefter reducere lysspredning, mens billeddannelse17. En sådan metode er aktiv CLARITY, som fremskynder lipid nedbrydning ved hjælp af elektroforese at trænge ind i vaskemiddel i hele vævet18. Selv om effektiv, denne væv clearing metode kræver dyrt udstyr og kan forårsage vævsskader, hvilket gør tilgangen uforenelig med skrøbelige cellepopulationer såsom hjertenerver19. Således anvender vi den passive CLARITY tilgang, som er afhængig af varme til forsigtigt at lette vaskemiddel penetration, derfor medvirken i fastholdelsen af indviklede cellestrukturer20,21.
Passiv KLARHED menes typisk at være mindre effektiv end aktiv CLARITY18, da teknikken ofte ledsages af to store hindringer: den manglende evne til at rydde hele organdybden og den omfattende tid, der kræves for at rydde voksenvæv. Vores passive CLARITY tilgang overvinder begge disse barrierer med en fremskyndet clearing proces, der er i stand til fuldt ud at rydde neonatal og voksen hjertevæv. Vores passive CLARITY vævsrydningsteknik har nået en effektivitet, der gør det muligt at visualiseringaf en række hjertecellepopulationer, herunder sjældne populationer fordelt over hele det voksne hjerte. Når det ryddede hjerte er afbildet med konfokal mikroskopi, kan arkitekturen af celle-specifikke mønstre under udvikling, sygdom og regenerering belyses.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-thioglycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Prolene Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8889H</td>
			<td>Polypropylene Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16-050-146</td>
			<td>Half Curved, Serrated, 4 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-812-39</td>
			<td>Dissecting, 4.5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vial</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-339-26A</td>
			<td>12 x 35 mm Vial with Cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>2 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td>Straight, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-966</td>
			<td>Mayo-Hegar, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Forceps</td>
			<td>Sigma-Adrich</td>
			<td>Z168777</td>
			<td>Fine Tip, Straight, 4.25 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Dissecting Scissor</td>
			<td>Walter Stern Inc</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>30 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16050133</td>
			<td>Medium Tissue, 1X2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>Water-soluble azo initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging

Hjerte-kar-sygdom overgår alle andre dødsårsager og er ansvarlig for en svimlende 31% af dødeligheden på verdensplan. Denne sygdom manifesterer sig i hjerteskade, primært i form af en akut myokardieinfarkt. Med lidt modstandskraft efter skade, den gang sundt hjertevæv vil blive erstattet af fibrøst, ikke-kontraktile arvæv og ofte være en optakt til hjertesvigt. For at identificere nye behandlingsmuligheder inden for regenerativ medicin har forskningen fokuseret på hvirveldyr med medfødte regenerative evner. En sådan model organisme er neonatal mus, som reagerer på hjerteskade med robust myokardieregenerering. For at fremkalde en skade i neonatal mus, der er klinisk relevant, har vi udviklet en operation for at okkludere den venstre anterior faldende arterie (LAD), spejling en myokardieinfarkt udløst af åreforkalkning i det menneskelige hjerte. Når matchet med teknologien til at spore ændringer både inden for kardiomyocytter og ikke-myocyte populationer, denne model giver os en platform til at identificere de mekanismer, der styrer hjerte regenerering. Få indsigt i ændringer i hjertecellepopulationer efter skade engang stolede stærkt på metoder såsom væv ssektioning og histologisk undersøgelse, som er begrænset til to-dimensionel analyse og ofte skader væv i processen. Desuden mangler disse metoder evnen til at spore ændringer i celleslægter, i stedet giver blot et øjebliksbillede af skadesreaktionen. Her beskriver vi, hvordan teknologisk avancerede metoder i afstamning sracing modeller, hele orgel clearing, og tre-dimensionelle (3D) hele mount mikroskopi kan bruges til at belyse mekanismer af hjertereparation. Med vores protokol for neonatal mus myokardieinfarkt kirurgi, væv clearing, og 3D hele organ imaging, de komplekse veje, der inducerer kardiomyocyt spredning kan optrævles, afslører nye terapeutiske mål for hjerte-regenerering.

Ofte er de to mest udfordrende trin vejlede hjertet ud af brysthulen og ligating LAD. For at foretage fejlfinding af disse trin kan der foretages justeringer i placeringen af den indledende punktering mellem de fjerde interkostale muskler. Hvis punkteringen og den stumpe dissektion er for tæt på brystbenet, kan hjertet muligvis ikke forlade brysthulen (figur 1A).
Desuden kan øget pres på venstre mave være nødvendigt for at lette denne proces...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiomyocyt spredning efter skade er en dynamisk proces, der kræver en symfoni af ekstracellulære signaler fra ikke-myocyte cellepopulationer. Ved hjælp af afstamning sporing, passiv KLARHED, og tre-dimensionelle hel-mount konfokal mikroskopi teknikker, kan vi analysere indflydelsen af en række forskellige celletyper på hjerte reparation og regenerering.

Optagelse af hjerteskaderespons af målrettede cellepopulationer via clearet hjerte tredimensionel billeddannelse

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Den endogene hjerte regenerering er en dynamisk proces, der involverer flere celletyper arbejder sammen i fællesskab for at montere en robust regenerativ reaktion. Peering i det regenererende væv via 3D-billeddannelse af det rensede hjerte som reaktion på skade kan støtte i rekonstruktion af den cellulære dynamik, der styrer denne hjertegenerative reaktion. Vores protokol er specielt designet til at spore celler under udvikling og regenerering.Vi forudser ingen begrænsninger i bredt at anvende vores clearing, farvning og billeddannelse teknikker til andre organtyper. For LAD-induceret koronararterie okklusion, først sterilisere det kirurgiske område af en bedøvet en dag gamle neonatal hvalp med antiseptisk opløsning. Lav et tværgående hud snit i brystet regionen.For at adskille huden fra musklen skal du bruge et par dressing pincet til at løfte huden forsigtigt, mens du forsigtigt presser saksen mod interkostale muskler i en lukket position. Find den fjerde interkostale plads og bruge små pincet til at gøre en lille overfladisk punktering passe på at undgå de indre organer. Brug stump dissektion og dressing pincet, udvide området mellem interkostale muskler lige indtil en finger kan anvendes på venstre side af maven, mens du holder det interkostale rum åbent med dressing pincet til forsigtigt at guide hjertet ud af brysthulen.Når hjertet er blevet udvundet, lad hjertet hvile på interkostale muskler og finde LAD som regionen af hjertet med mindre poolet blod. For at fremkalde myokardie infarkt, bruge en 6-0 sutur til at binde en firkantet knude stramt omkring fartøjet to gange uden at bryde arterien. Blanchering ved toppen skal observeres straks.Det er vigtigt at forblive konsekvent på sutur placering langs LAD for en lignende infarkt størrelse. Dette opnås bedst ved at få adgang til hjertet hurtigt, mens blodet stadig flyder gennem arterierne. Når suturen er placeret, lad hjertet glide tilbage i brysthulen.Sutur ribbenene sammen med en kirurg og en firkantet knude ved hjælp af stumpe kraftbecer til at løfte det øverste sæt ribben, mens de passerer en 6-0 sutur gennem den øvre og nedre sæt ribben. Påfør en lille mængde hud lim til den øvre del af maven og bruge fine kraftforkropninger til at placere huden på underlivet over den eksponerede brystet region. Derefter placere hvalpen på en varmepude og udføre ligation på det næste dyr.Når alle operationer er blevet udført, returnere den varme og mobile hvalpe til moderens hjem bur. For passiv klarhed af det høstede hjertevæv, 21 dage efterkirurgi efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids, placere musen på et rent kirurgisk område i liggende position og sikre lemmer med tape. Brug vævsforekcessorer, tag fat i pelsen lige under xiphoid processen og lav et snit, der spænder over bredden af brystkassen.Skær sammen med de distale dele af brystkassen og bruge de virkræfter til at løfte xiphoid processen til at eksponere mellemgulvet. Tag membranen af med buede stænde og træk vævskakialen, indtil det bankende hjerte er tilgængeligt. Brug de buede kraftbånd til at gribe hjertet i bunden og bruge iridectomy saks til at skære aorta og overlegen vena cava.Placer bankende hjerte i en petriskål af PBS, så hjertet pumper ud af tilbageholdt blod. Den myokardie infarkt kan bekræftes ved en korrekt anatomisk placering af LAD ligation. Når hjertet holder op med at slå, skal du forsigtigt presse organet med saft til at udvise det resterende blod og overføre prøven til et engangsglashætteglas indeholdende to milliliter PBS.Hætteglasset sættes på en shaker i mindst 30 minutter ved stuetemperatur, der ændrer PBS-opløsningen hvert 10. Når PBS er klar, udskiftes PBS med to milliliter kold 4%paraformaldehyd for en fire timers inkubation ved stuetemperatur efterfulgt af tre 10-minutters vask på rysteapparatet med to milliliter frisk PBS pr. vask. Efter den sidste vask fyldes hætteglasset med to milliliter 4%acrylamid suppleret med 0,5% VA-044 opløsning til en overnight inkubation ved fire grader Celsius.Den næste dag, placere hætteglasset i en 37 grader Celsius varmeblok i tre timer. Ved afslutningen af polymeriseringen overføres hjertet til et nyt glasskalglas og hjertevævet vaskes i to milliliter frisk PBS 10 minutter ad gangen, der forfrisker PBS ved afslutningen af hver inkubation. Når PBS er klar, skal vaskebufferen udskiftes med to milliliter rydningsopløsning.Inkuber prøven ved 37 grader Celsius i flere uger, indtil hjertet er klart, forfriskende clearing løsning hver to til tre dage. Når organet er klart, vaskes prøven med PBS på shakeren som påvist, før hætteglasset fyldes op igen med frisk PBS i en 24-timers inkubation ved 37 grader Celsius. Den næste dag, erstatte PBS med RIMS for en 24-timers inkubation ved 37 grader Celsius.Ved slutningen af inkubationen er vævet helt ryddet. Vævet skal være gennemsigtigt efter flere uger. For billeddannelse af den ryddede postnatal mus hjerte efter myokardieinfarkt induktion, fylde halvdelen af et kammer af en skræddersyet depression dias med PBS og bruge buede kraftbeføjelse til omhyggeligt at overføre det ryddede hjerte ind i kammeret.Fyld det resterende volumen af kammeret med PBS. Fyld derefter kammeret med PBS, indtil væskens overflade danner en kuppel over toppen af kammeret, og monter dækslet, før vævet aflyses ved konfokal mikroskopi i henhold til standardbilleddiagnostiske protokoller. Hvis punktering og stump dissektion er for tæt på brystbenet, hjertet kan ikke være i stand til at forlade brysthulen.Hvis hjertet ikke let forlader hulrummet, lægge pres på venstre mave for at lette processen. Komplikationer kan opstå fra hvile hjertet på interkostale muskler. Derfor er det vigtigt at holde den stumpe dissektion til en minimal størrelse i en vandret retning for at give mulighed for en klar visualisering og tilgængelighed af LAD.Bemærk, at en overfladisk ligation vil have mindre plads til justering i den endelige sutur placering, og at sutur binde omkring LAD bør udføres med kontrollerede stabile bevægelser. Ved udgangen af clearing trin, bør hele hjertet være konsekvent uigennemsigtig uden misfarvning i midten. Efter et par dage i RIMS opløsning ved stuetemperatur, hjertet bør være helt ryddet og nogle væv ekspansion kan observeres.Som observeret af tdTomato reporter protein udtryk, hjertenervene er hovedsageligt overfladiske med nogle befolkninger, der bor i epicardial lag. Det er vigtigt, at reporter proteinudtryksbekræftelse bevares efter at have gennemgået klarhedsprotokollen som påvist. Rydning og billeddannelse giver 3D-hjertet perspektiv i placeringen og morfologien af hjertecellepopulationer.Dette giver os mulighed for at identificere nye aspekter i cellemønstre og cellecelleinteraktioner.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiering af en human neural stamcelle Line på tredimensionelle kulturer, Analyse af MicroRNA og formodede målgener

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Generation af murine pacemaker celleaggregater Baseret på ES-celle-programmering i kombination med Myh6-Promotor-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Analyse blodlegemer befolkninger i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Isolering af Perivaskulær multipotente precursorcelle populationer fra humant hjertevæv

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Cleared Embryonale og postnatal hjerter på Single-celle Opløsning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal Hel Mount: En Novel Processing and Imaging Protocol for Tykke, Tredimensionale Tissue Tværsnit af Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tre-dimensionelle gengivelse og analyse af Immunolabeled, klarere menneskelige placenta villøs vaskulære netværk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Tre-dimensionelle inflammatoriske humant væv ækvivalenter af Gingiva

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Tre-dimensionelle Organotypic kulturer af vestibulære og auditive sanseorganer

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...