Name: capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Die Finanzierung dieses Projekts wurde von der UW School of Medicine and Public Health aus dem Wisconsin Partnership Program (A.I.M.) und einem American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.) bereitgestellt.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Guide for the Use and Care of Laboratory Animals und in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee in der School of Medicine and Public Health der University of Wisconsin-Madison durchgeführt. Alle Methoden wurden auf Wildtyp C57BL/6J (B6) und transgenen Mauslinien von Jackson Laboratories durchgeführt.
1. Koronare Arterienokklusion (Myokardinfarkt) Induziert durch Ligation der linken vorderen absteigenden Arterie (L...

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li></ol>

Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Kardiomyozyten und Nicht-Myozytenpopulationen sind ein entscheidender Faktor dafür, ob das Herz nach verletzungen fibrosis oder repariert wird. Es wurden Entdeckungen gemacht, die zeigen, dass eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Nerven14, Epikardialzellen24, Peritonealmakrophagen25, Arteriole12,13und lymphatische Endothelzellen26...

Das Herz gilt seit langem als ein post-mitotisches Organ, aber neuere Beweise zeigen, dass Kardiomyozyten-Erneuerung tritt im erwachsenen menschlichen Herzen bei etwa 1% pro Jahr1. Jedoch, Diese niedrigen Raten der Kardiomyozyten Umsatz sind nicht ausreichend, um den massiven Verlust von Gewebe, die nach Verletzungen auftritt wieder aufzufüllen. Ein Herz, das einen Myokardinfarkt erlitten hat, wird etwa eine Milliarde Kardiomyozyten verlieren, die oft als Vorspiel zu Herzinsuffizienz und plötzlichem Herztod dienen2,3. Mit über 26 Millionen Menschen, die weltweit von Herzinsuffizienz betroffen sind, besteht ein unerfüllter Bedarf an Therapeutika, die die durch Herzerkrankungen verursachten Schäden umkehren können4.
Um diese Lücke in der Therapeutik zu überbrücken, haben Wissenschaftler begonnen, evolutionär konservierte Mechanismen zu untersuchen, die der endogene Regeneration nach Verletzungen zugrunde liegen. Ein Modell zur Untersuchung der Herzregeneration von Säugetieren ist die Neonatalmaus. In der Woche nach der Geburt haben neonatale Mäuse eine robuste regenerative Reaktion nach Herzschäden5. Wir haben bereits gezeigt, dass neonatale Mäuse ihr Herz durch Kardiomyozytenproliferation nach einer apikalen Resektionregenerierenkönnen 5 . Obwohl diese Technik die Herzregeneration bei den Neonaten hervorrufen kann, fehlt es der Operation an klinischer Relevanz für menschliche Herzverletzungen. Um eine menschliche Verletzung im neonatalen Mausmodell nachzuahmen, haben wir eine Technik entwickelt, um einen Myokardinfarkt durch einen koronaren Arterienverschluss6zu induzieren. Diese Technik erfordert eine chirurgische Ligation der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD), die für die Abgabe von 40%–50% des Blutes an das linksventrikuläre Myokard6,7verantwortlich ist. So führt die Operation zu einem Infarkt, der einen erheblichen Teil der linken ventrikulären Wand trifft. Diese Schädigung des Myokards stimuliert die Kardiomyozytenproliferation und Herzregeneration bei Neonaten5.
Die koronare Arterienverschlusschirurgie bietet eine hochreproduzierbare und direkt translationale Methode, um das Innenleben der Herzregeneration aufzudecken. Die neonatale Chirurgie parallel koronare Arterien-Atherosklerose im menschlichen Herzen, wo Ansammlung von Plaque in den inneren Wänden der Arterien kann eine Okklusion und nachfolgenden Myokardinfarktverursachen 8. Aufgrund einer Lücke in der therapeutischen Behandlung von Herzinsuffizienz-Patienten ist ein Okklusion im LAD mit Sterblichkeitsraten verbunden, die innerhalb eines Jahres nach der Verletzung9bis zu 26% erreichen, und wurde daher als "Witwenmacher" bezeichnet. Fortschritte in der Therapeutik erfordern ein Modell, das die komplexen physiologischen und pathologischen Auswirkungen von Herzverletzungen genau widerspiegelt. Unser chirurgisches Protokoll für neonatale Mausherzverletzungen bietet eine Plattform, die es Forschern ermöglicht, die molekularen und zellulären Hinweise zu untersuchen, die die Herzregeneration von Säugetieren nach einer Verletzung signalisieren.
Jüngste Forschungen zeigen die dynamische Beziehung zwischen der extrazellulären Umgebung und sich ausbreitenden Kardiomyozyten. Beispielsweise kann das postnatale regenerative Fenster erweitert werden, indem die Steifigkeit der extrazellulären Matrix um das Herz10verringert wird. Biomaterialien aus der neonatalen extrazellulären Matrix können auch die Herzregeneration in erwachsenen Säugetierherzen nach einer Herzverletzung fördern11. Auch die begleitende Proliferation von Kardiomyozyten ist eine angiogene Reaktion12,13; Kollateralarterienbildung, die nur für das regenerierende Herz der Neonatalmaus einzigartig ist, erwies sich als wesentlich für die Stimulierung der Herzregeneration12. Darüber hinaus hat unser Labor gezeigt, dass die Nervensignalisierung die Proliferation der Kardiomyozyten und die Herzregeneration durch Modulation der Wachstumsfaktorspiegel sowie die Entzündungsreaktion nach Derverletzung14reguliert. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, nicht-Myozyten-Zellpopulationen als Reaktion auf Herzverletzungen zu verfolgen. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir das Cre-lox-Rekombinationssystem in transgenen Mäuselinien genutzt, um die konstitutive oder bedingte Expression fluoreszierender Reporterproteine für die Linienverfolgung zu integrieren. Darüber hinaus können wir fortschrittliche Methoden verwenden, um die klonale Expansionsmusterung mit der Regenbogen-Mauslinie zu bestimmen, die auf der stochastischen Expression der cre-abhängigen, mehrfarbigen fluoreszierenden Reporter beruht, um die klonale Expansion von Zielzellpopulationen zu bestimmen15. Die Verwendung von Linienverfolgung enden mit der neonatalen koronaren Arterienverschlusschirurgie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die komplizierten zellulären Mechanismen der Herzregeneration zu sezieren.
Die Verfolgung der Abstammung fluoreszierend markierter Zellen mit dreidimensionaler (3D) Ganzkörperbildgebung ist mit der traditionellen Schnitt- und Rekonstruktionstechnik schwer zu erreichen – insbesondere dann, wenn Zellpopulationen zerbrechlich sind, wie Nervenfasern oder Blutgefäße. Während eine direkte Ganzkörperbildgebung des Organs durch optische Steilerstellung oberflächliche Zellpopulationen erfassen kann, bleiben Strukturen, die tief im Gewebe liegen, unzugänglich. Um diese Barrieren zu umgehen, wurden Geweberäumtechniken entwickelt, um die Opazität ganzer Organgewebe zu reduzieren. In jüngster Zeit wurden signifikante Fortschritte bei Clear Lipid-ausgetauschten Acrylamid-hybridisierten Rigid Imaging-kompatiblen Tissue hYdrogel (CLARITY)-basierten Methoden gemacht, die festes Gewebe über die Lipidextraktion16ablöschen. Es werden auch Schritte unternommen, um den Brechungsindex zu homogenisieren und anschließend die Lichtstreuung während der Bildgebung zu reduzieren17. Eine solche Methode ist die aktive CLARITY, die die Lipidzersetzung durch Elektrophorese beschleunigt, um das Waschmittel im gesamten Gewebe zu durchdringen18. Obwohl diese Geweberäummethode wirksam ist, erfordert sie teure Geräte und kann Gewebeschäden verursachen, wodurch der Ansatz mit empfindlichen Zellpopulationen wie den Herznerven 19 unvereinbarist. So verwenden wir den passiven CLARITY-Ansatz, der auf Wärme angewiesen ist, um das Eindringen von Reinigungsmitteln sanft zu erleichtern und so bei der Retention komplizierter Zellstrukturen zu helfen20,21.
Passive CLARITY wird in der Regel als weniger effizient als aktive CLARITY18, da die Technik wird oft von zwei Haupthindernissen begleitet: die Unfähigkeit, die gesamte Organtiefe zu löschen und die große Menge an Zeit benötigt, um erwachsene Gewebe zu löschen. Unser passiver CLARITY-Ansatz überwindet diese beiden Barrieren mit einem beschleunigten Clearing-Prozess, der in der Lage ist, neonatales und erwachsenes Herzgewebe vollständig zu beseitigen. Unsere passive CLARITY Gewebeclearing-Technik hat eine Effizienz erreicht, die die Visualisierung einer Vielzahl von Herzzellpopulationen ermöglicht, einschließlich seltener Populationen, die im erwachsenen Herzen verteilt sind. Wenn das gelöschte Herz mit konfokaler Mikroskopie abgebildet wird, kann die Architektur der zellspezifischen Musterung während der Entwicklung, Krankheit und Regeneration beleuchtet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-thioglycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Prolene Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8889H</td>
			<td>Polypropylene Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16-050-146</td>
			<td>Half Curved, Serrated, 4 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-812-39</td>
			<td>Dissecting, 4.5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vial</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-339-26A</td>
			<td>12 x 35 mm Vial with Cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>2 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td>Straight, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-966</td>
			<td>Mayo-Hegar, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Forceps</td>
			<td>Sigma-Adrich</td>
			<td>Z168777</td>
			<td>Fine Tip, Straight, 4.25 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Dissecting Scissor</td>
			<td>Walter Stern Inc</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>30 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16050133</td>
			<td>Medium Tissue, 1X2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>Water-soluble azo initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging

Herz-Kreislauf-Erkrankungen übertreffen alle anderen Todesursachen und sind für unglaubliche 31 % der Todesfälle weltweit verantwortlich. Diese Krankheit manifestiert sich bei Herzverletzungen, in erster Linie in Form eines akuten Myokardinfarkts. Mit wenig Resilienz nach Verletzungen wird das einst gesunde Herzgewebe durch faseriges, nicht kontraktiles Narbengewebe ersetzt und ist oft ein Vorspiel zu Herzinsuffizienz. Um neue Behandlungsmöglichkeiten in der regenerativen Medizin zu identifizieren, konzentrierte sich die Forschung auf Wirbeltiere mit angeborenen regenerativen Fähigkeiten. Ein solcher Modellorganismus ist die Neonatalmaus, die auf Herzverletzungen mit robuster Myokardregeneration reagiert. Um eine Verletzung bei der neonatalen Maus zu induzieren, die klinisch relevant ist, haben wir eine Operation entwickelt, um die linke vordere absteigende Arterie (LAD) zu verdecken, die einen Myokardinfarkt widerspiegelt, der durch Arteriosklerose im menschlichen Herzen ausgelöst wird. In Verbindung mit der Technologie, um Veränderungen sowohl innerhalb von Kardiomyozyten als auch innerhalb von Nicht-Myozytenpopulationen zu verfolgen, bietet uns dieses Modell eine Plattform, um die Mechanismen zu identifizieren, die die Herzregeneration leiten. Einblicke in Veränderungen der Herzzellpopulationen nach Verletzungen stützten sich einst stark auf Methoden wie Gewebeschnitt und histologische Untersuchung, die sich auf zweidimensionale Analysen beschränken und dabei oft das Gewebe schädigen. Darüber hinaus ist es diesen Methoden nicht in der Lage, Veränderungen in Zelllinien nachzuverfolgen, anstatt lediglich eine Momentaufnahme der Verletzungsreaktion bereitzustellen. Hier beschreiben wir, wie technologisch fortschrittliche Methoden in Linienverfolgungsmodellen, ganzer Organreinigung und dreidimensionaler (3D) Vollmontagemikroskopie eingesetzt werden können, um Mechanismen der Herzreparatur aufzuklären. Mit unserem Protokoll für die Operation an Myokardinfarktoperationen der Neonatalen Maus, die Gewebereinigung und die 3D-Gesamteorganbildgebung können die komplexen Wege, die die Kardiomyozytenproliferation induzieren, entwirrt werden, was neue therapeutische Ziele für die Herzregeneration enthüllt.

Oft führen die beiden anspruchsvollsten Schritte das Herz aus der Brusthöhle und ligan den LAD. Um diese Schritte zu beheben, können Anpassungen bei der Platzierung der anfänglichen Punktion zwischen den vierten interkostalen Muskeln vorgenommen werden; Wenn die Punktion und die stumpfe Sezierung zu nah am Brustbein sind, kann das Herz die Brusthöhle möglicherweise nicht verlassen (Abbildung 1A).
Zusätzlich kann ein erhöhter Druck auf den ...

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Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Die Proliferation von Cardiomyozyten nach einer Verletzung ist ein dynamischer Prozess, der eine Symphonie extrazellulärer Hinweise aus Nicht-Myozyten-Zellpopulationen erfordert. Mit Lineage-Tracing, passiven CLARITY und dreidimensionalen konfokalen Mikroskopie-Techniken mit ganzer Montage können wir den Einfluss einer Vielzahl von Zelltypen auf die Herzreparatur und -regeneration analysieren.

Erfassung der Herzverletzungsreaktion von gezielten Zellpopulationen über cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Die endogene Herzregeneration ist ein dynamischer Prozess, bei dem mehrere Zelltypen gemeinsam zusammenarbeiten, um eine robuste regenerative Reaktion zu ermöglichen. Ein Blick in das regenerierende Gewebe mittels 3D-Bildgebung des gelöschten Herzens als Reaktion auf Verletzungen kann bei der Rekonstruktion der zellulären Dynamik helfen, die diese kardiale regenerative Reaktion leiten. Unser Protokoll wurde speziell entwickelt, um Zellen während der Entwicklung und Regeneration zu verfolgen.Wir sehen keine Einschränkungen bei der allgemeinen Anwendung unserer Räum-, Färbe- und Bildgebungstechniken auf andere Organtypen vor. Für LAD-induzierte koronare Arterienverschluss, sterilisieren Sie zuerst den chirurgischen Bereich eines anästhesierten eintägigen neonatalen Welpen mit antiseptischer Lösung. Machen Sie einen queren Hautschnitt im Brustbereich.Um die Haut vom Muskel zu trennen, verwenden Sie ein Paar Anziehzange, um die Haut vorsichtig zu heben, während Sie die Schere vorsichtig gegen die Interkostalmuskulatur in einer geschlossenen Position drücken. Suchen Sie den vierten interkostalen Raum und verwenden Sie kleine Zangen, um eine kleine oberflächliche Punktion zu machen, die darauf achtet, die inneren Organe zu vermeiden. Mit stumpfer Sezierung und den Ankleidezangen, erweitern Sie den Bereich zwischen den interkostalen Muskeln, bis ein Finger auf die linke Seite des Bauches aufgetragen werden kann, während sie den interkostalen Raum mit Ankleidezangen offen halten, um das Herz sanft aus der Brusthöhle zu führen.Sobald das Herz extrahiert wurde, lassen Sie das Herz auf den interkostalen Muskeln ruhen und lokalisieren Sie die LAD als die Region des Herzens mit weniger gepoolten Blut. Um einen Myokardinfarkt auszulösen, verwenden Sie eine 6-0 Naht, um einen quadratischen Knoten zweimal fest um das Gefäß zu binden, ohne die Arterie zu trennen. Das Blancnieren an der Spitze sollte sofort beobachtet werden.Es ist wichtig, bei der Nahtplatzierung entlang des LAD für eine ähnliche Infarktgröße konsistent zu bleiben. Dies wird am besten durch den schnellen Zugriff auf das Herz erreicht, während das Blut noch durch die Arterien fließt. Wenn die Naht platziert wurde, lassen Sie das Herz wieder in die Brusthöhle rutschen.Befestigen Sie die Rippen zusammen mit einem Chirurgen und einem quadratischen Knoten mit stumpfer Zange, um den oberen Satz von Rippen zu heben, während Sie eine 6-0 Naht durch den oberen und unteren Satz von Rippen passieren. Tragen Sie ein kleines Volumen von Hautkleber auf den Oberbauch auf und verwenden Sie feine Zangen, um die Haut des Unterbauchs über dem exponierten Brustbereich zu positionieren. Dann legen Sie den Welpen auf ein Heizkissen und führen Sie die Ligation auf das nächste Tier.Wenn alle Operationen durchgeführt wurden, kehren Sie die warmen und mobilen Welpen in den Hauskäfig der Mutter zurück. Für passive Klarheit des geernteten Herzgewebes, 21 Tage nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, legen Sie die Maus auf einen sauberen chirurgischen Bereich in der Supine-Position und sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Mit Tissue-Zangen, greifen Sie das Fell direkt unter dem xiphoiden Prozess und machen einen Schnitt über die Breite des Brustkorbs.Schneiden Sie neben den distalen Teilen des Brustkorbs und verwenden Sie die Zange, um den xiphoiden Prozess zu heben, um das Zwerchfell freizulegen. Lösen Sie das Zwerchfell mit gekrümmten Zangen und ziehen Sie das Gewebe kranially, bis das schlagende Herz zugänglich ist. Verwenden Sie die gekrümmten Zangen, um das Herz an der Basis zu greifen und verwenden Sie Iridectomie Schere, um die Aorta und überlegene Vena cava zu schneiden.Legen Sie das schlagende Herz in eine Petrischale aus PBS, so dass das Herz jedes zurückgehaltene Blut auspumpt. Der Myokardinfarkt kann durch eine korrekte anatomische Platzierung der LAD-Ligation bestätigt werden. Wenn das Herz aufhört zu schlagen, drücken Sie das Organ vorsichtig mit Zangen, um das Restblut zu vertreiben und übertragen Sie die Probe in eine Einweg-Glasschale Mitglas-Flasche mit zwei MilliliterPBS.Legen Sie die Durchstechflasche mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Shaker und wechseln Sie die PBS-Lösung alle 10 Minuten, bis die Lösung blutfrei bleibt. Wenn die PBS klar ist, ersetzen Sie die PBS durch zwei Milliliter kaltes 4%Paraformaldehyd für eine vierstündige Inkubation bei Raumtemperatur, gefolgt von drei 10-minütigen Wäschen am Shaker mit zwei Millilitern frischer PBS pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche die Durchstechflasche mit zwei Millilitern 4%Acrylamid füllen, ergänzt mit 0,5%VA-044 Lösung für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag die Durchstechflasche in einem 37 Grad Celsius Hitzeblock für drei Stunden platzieren. Am Ende der Polymerisation das Herz in eine neue Glasschalen-Fläschchen geben und das Herzgewebe in zwei Millilitern frischer PBS 10 Minuten gleichzeitig waschen und die PBS am Ende jeder Inkubation erfrischen. Wenn die PBS klar ist, ersetzen Sie den Waschpuffer durch zwei Milliliter Clearinglösung.Bebrüte die Probe mehrere Wochen bei 37 Grad Celsius, bis das Herz klar ist, und erfrischen Sie die Klärlösung alle zwei bis drei Tage. Wenn das Organ klar ist, waschen Sie die Probe mit PBS auf dem Shaker, wie gezeigt, bevor Sie die Durchstechflasche mit frischem PBS für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius nachfüllen. Ersetzen Sie am nächsten Tag die PBS durch RIMS für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius.Am Ende der Inkubation wird das Gewebe vollständig gerodet. Das Gewebe sollte nach einigen Wochen transparent werden. Zur Abbildung des gelöschten postnatalen Mausherzes nach der Induktion des Myokardinfarkts, füllen Sie die Hälfte einer Kammer einer maßgeschneiderten Depressionsrutsche mit PBS und verwenden Sie gekrümmte Zangen, um das gereinigte Herz vorsichtig in die Kammer zu übertragen.Füllen Sie das restliche Volumen der Kammer mit PBS. Füllen Sie dann die Kammer mit PBS, bis die Oberfläche der Flüssigkeit eine Kuppel über der Oberseite der Kammer bildet und montieren Sie den Abdeckungsschlitten, bevor Sie das Gewebe durch konfokale Mikroskopie nach Standard-Bildgebungsprotokollen bebildert. Wenn die Punktion und stumpfe Sezierung zu nah am Brustbein sind, kann das Herz die Brusthöhle möglicherweise nicht verlassen.Wenn das Herz den Hohlraum nicht leicht verlässt, druckn Sie den linken Bauch, um den Prozess zu erleichtern. Komplikationen können auftreten, wenn das Herz auf den interkostalen Muskeln ruht. Daher ist es wichtig, die stumpfe Sezierung in einer horizontalen Ausrichtung auf eine minimale Größe zu halten, um eine klare Visualisierung und Zugänglichkeit des LAD zu ermöglichen.Beachten Sie, dass eine oberflächliche Ligation in der letzten Nahtplatzierung weniger Anpassungsspielraum hat und dass die Nahtbindung um den LAD mit kontrollierten stetigen Bewegungen durchgeführt werden sollte. Am Ende des Clearing-Schritts sollte das ganze Herz konsequent undurchsichtig und ohne Verfärbungen in der Mitte sein. Nach ein paar Tagen in RIMS-Lösung bei Raumtemperatur sollte das Herz vollständig gelöscht werden und eine gewisse Gewebeausdehnung kann beobachtet werden.Wie die Proteinexpression des tdTomato-Reporters beobachtet, sind die Herznerven hauptsächlich oberflächlich, wobei einige Populationen in der Epikardialschicht leben. Wichtig ist, dass die Bestätigung der Proteinexpression des Reporters nach dem gezeigten Klarheitsprotokoll erhalten bleibt. Das Clearing und die Bildgebung des 3D-Herzens bieten eine Perspektive in die Lage und Morphologie von Herzzellpopulationen.Dies ermöglicht es uns, neue Aspekte in der Zellmusterung und Zell-Zell-Interaktionen zu identifizieren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Generierung von murinen Herzschrittmacher Zellaggregate Basierend auf ES-Zell-Programmierung in Kombination mit Myh6-Promoter-Auswahl

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Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

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