Name: capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

המימון לפרויקט זה סופק על ידי בית הספר UW לרפואה ובריאות הציבור מתוכנית שותפות ויסקונסין (A.I.M.), ו האמריקנית לפיתוח קריירה האגודה פרס הברית 19CDA34660169 (A.I.M.).

כל הניסויים נערכו בהתאם למדריך לשימוש ולטיפול בבעלי חיים מעבדתיים ובציות לועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים בבית הספר לרפואה ובריאות הציבור באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון. כל השיטות נערכו על סוג פראי C57BL/6J (B6) וקווי העכבר הטרנסגניים שהתקבלו ממעבדות ג'קסון.
1. סגר עורק כלי?...

<ol>
	<li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Kikuchi, K., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regenerative+capacity+and+mechanisms.">Cardiac regenerative capacity and mechanisms.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Savarese, G., Lund, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Public+Health+Burden+of+Heart+Failure.">Global Public Health Burden of Heart Failure.</a> Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice.">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).</li><li>Karwowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+infarct+artery+location,+acute+total+coronary+occlusion,+and+mortality+in+STEMI+and+NSTEMI+patients.">Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients.</a> Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).</li><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).</li><li>MAGGIC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survival+of+patients+with+heart+failure+with+preserved+or+reduced+left+ventricular+ejection+fraction:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis.</a> European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).</li><li>Notari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+local+microenvironment+limits+the+regenerative+potential+of+the+mouse+neonatal+heart.">The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart.</a> Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neonatal+and+adult+mammalian+heart+regeneration+by+the+miR-15+family.">Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Collateral+Artery+Development+Program+Promotes+Neonatal+Heart+Regeneration.">A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration.</a> Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+neonatal+cardiac+extracellular+matrix+prevents+widespread+ventricular+remodeling+in+adult+mammals+after+myocardial+infarction.">Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction.</a> Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).</li><li>Mahmoud, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+Regulate+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration.">Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).</li><li>Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+lineage+tracing+methods+and+intestinal+tumors.">Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.</a> Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Phillips, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum:+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease.">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Scientific Reports. 6, 26013 (2016).</li><li>Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+in+Neonatal+Mice,+A+Model+of+Cardiac+Regeneration.">Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).</li><li>Sereti, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+clonal+expansion+during+mouse+heart+development+and+injury.">Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).</li><li>Lepilina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration.">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127 (3), 607-619 (2006).</li><li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair.">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li><li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li></ol>

אינטראקציות תא תא בין האוכלוסייה הקרדיוציטים לבין אוכלוסיות שאינן מיוציט הן גורם הקובע אם הלב יעבור פיברוזיס או יתקן לאחר הפציעה. תגליות נעשו להפגין כי מגוון של סוגי תאים, כולל עצבים14, תאים אפירחיוג24, מקרופאגים הצפק25, העורקי העורקים12...

הלב כבר זמן רב נחשב להיות עוגב פוסט-mitotic, אך הראיות האחרונות מראות כי התחדשות הקרדיוציט מתרחשת בלב האנושי המבוגר בערך 1% לשנה1. עם זאת, אלה שיעורי נמוך של מחזור קרדיומיקוציט אינם מספיקים כדי לחדש את אובדן מסיבי של רקמות המתרחשת לאחר הפציעה. לב שסבל אוטם שריר הלב יאבדו סביב 1,000,000,000 קרדיוציטים, לעתים קרובות משמש כהקדמה לכישלון הלב ומוות לב פתאומי2,3. עם מעל 26,000,000 אנשים מושפעים אי ספיקת לב ברחבי העולם, יש צורך בלתי מתקיים עבור therapeutics שיכול להפוך את הנזקים שנגרמו על ידי מחלת לב4.
על מנת לגשר על פער זה בtherapeutics, החלו מדענים לחקור מנגנונים שאינם מנוצלים ושמרו על התחדשות האנדודוגני בעקבות הפציעה. מודל אחד ללימוד התחדשות לב היונקים הוא עכבר ה, הנמצא בתנועה. בתוך שבוע לאחר הלידה, עכברים בעלי הילודה יש תגובה משובי חזקה בעקבות נזק לב5. בעבר הדגמנו כי עכברים בעלי שם מסוגלים לחדש את הלב באמצעות התפשטות הקרדיוציט בעקבות כריתת הקודקוד5. למרות שטכניקה זו יכולה לעורר התחדשות לב בneonates, הניתוח חסר רלוונטיות קלינית לפציעות לב אנוש. כדי לחקות פציעה אנושית במודל העכבר של התינוק, פיתחנו טכניקה כדי לגרום אוטם שריר הלב דרך עורק כלילי הסגר6. טכניקה זו דורשת הארכה כירורגית של העורק האחורי השמאלי הקדמי (בחור), אשר אחראי על אספקת 40%-50% של הדם אל שריר הלב השמאלי בשריר המוח6,7. כך, הניתוח מביא לסיכונים ההשפעות על חלק ניכר מהחומה השמאלית החדרית. הנזק הזה לשריר הלב יעורר את התפשטות הקרדיוציט ואת התחדשות הלב בneonates5.
בעורק העורק הכלילי מספק שיטה מאוד מיועלת וישירה לחשוף את פעולתו הפנימית של התחדשות הלב. הניתוח המנותח מקבילה טרשת עורקים עורק כלילי בלב האדם, שבו הצטברות של הפלאק בתוך הקירות הפנימיים של העורקים יכול לגרום לחסימה ואת אוטם שריר הלב הבאים8. בשל חוסר בטיפולים טיפוליים לחולי אי ספיקת לב, חסימה בנער קשורה לשיעורי התמותה המגיעים עד 26% בתוך שנה לאחר פציעה9, וכתוצאה מכך נקרא "האלמנה maker". פיתוחים בtherapeutics דורשים מודל המשקף במדויק את ההשפעות הפיסיולוגיים והפתולוגיים המורכבים של פגיעה בליבו. הפרוטוקול הכירורגי שלנו לפגיעה בליבם של העכברים מספק פלטפורמה המאפשרת לחוקרים לחקור את הרמזים המולקולריים והסלולריים המספקים התחדשות לב היונקים לאחר הפציעה.
מחקר שנערך לאחרונה מדגיש את הקשר הדינמי בין סביבת החילוץ לבין הקרדיוומיציטים מתרבים. לדוגמה, חלון התחדשות לידה ניתן להאריך על ידי הפחתת הנוקשות של מטריצה החילוץ סביב הלב10. ביואטיריאלס מהמטריקס המגמיותיים יכולים גם לקדם התחדשות לב בלבבות יונקים למבוגרים לאחר פגיעה בלב11. גם ליווי התפשטות הקרדיוציט היא תגובה לאנגיוגנטית12,13; היווצרות עורק הסביבתי ייחודי ליבה מתחדשות של עכבר ה, היתה הכרחית לעירור התחדשות הלב12. יתר על כן, המעבדה שלנו הוכיחה כי מווסת את הפצת הקרדיוציט ואת התחדשות הלב באמצעות אפנון של רמות גורם הצמיחה, כמו גם את התגובה הדלקתית בעקבות פציעה14. ממצאים אלה מדגישים את הצורך לעקוב אחר אוכלוסיות תאים שאינן מיציט בתגובה לפציעה בלב. כדי להשיג מטרה זו, אנו יש לנו לנצל את המערכת שילוב מחדש של היצור-לקס בשורות עכברים טרנסגניים לשלב הביטוי הקונסטיטוטיבי או מותנה של כתבת הפלורסנט חלבונים עבור מעקב השושלת. יתר על כן, אנו יכולים להשתמש בשיטות מתקדמות כדי לקבוע התרחבות התפשטות שבטים עם קו העכבר קשת, אשר מסתמך על ביטוי סטוכסטי של כתבים תלויי-צבע התלויים, רב צבעים כדי לקבוע את התפשטות המשובטים של אוכלוסיות ממוקדות תאים15. העסקת מעקב אחר השושלת עם הניתוח הכלילי של הדום העורקים הוא כלי רב עוצמה לנתח את המנגנונים הסלולריים המורכבות של התחדשות הלב.
מעקב אחר שושלת היוחסין של תאים בעלי תווית של שלושה מימדים (3D) הדמיה של איבר שלם קשה להשיג באמצעות הציבור המסורתי וטכניקת שחזור – במיוחד כאשר אוכלוסיות תאים הם שבירים, כגון סיבי עצב או כלי דם. בעוד הדמיה מלאה הדמיית העוגב על ידי הדגשות אופטיות יכולות ללכוד אוכלוסיות תאים שטחיות, מבנים השוכנים עמוק בתוך הרקמה נותרים בלתי נגישים. כדי לעקוף מחסומים אלה, טכניקות ניקוי רקמות פותחו כדי להפחית את האטימות של רקמות איברים שלם. לאחרונה, מקדמות משמעותיות נעשו לנקות השומנים-החליפו אקרילאמיד-הוכלא קשיח הדמיה תואם רקמות הידרוג'ל (בהירות)-שיטות מבוססות, אשר רקמה קבועה ברורה באמצעות הפקת ליפיד16. צעדים נלקחים גם כדי המגון את המדד השבירה ולאחר מכן להפחית פיזור אור בזמן הדמיה17. שיטה אחת כזאת היא בהירות פעילה, אשר מזירוז פירוק השומנים באמצעות אלקטרופורזה לחדור את אבקת הניקוי לאורך הרקמה18. למרות יעיל, זה ניקוי רקמות שיטה דורשת ציוד יקר יכול לגרום נזק לרקמות, מה שהופך את הגישה לא תואם אוכלוסיות תאים שברירי כגון עצבי הלב19. לפיכך, אנו מעסיקים את הגישה בהירות פסיבית, אשר נשענת על חום כדי להקל בעדינות על חדירת חומרי ניקוי, ולכן לסייע בשמירה של מבני תאים מסובכים20,21.
בהירות פסיבית היא בדרך כלל נחשב פחות יעיל מאשר בהירות פעילה18, כמו הטכניקה מלווה לעתים קרובות על ידי שני מכשולים עיקריים: חוסר היכולת לנקות את עומק האיבר כולו ואת כמות נרחבת של זמן הנדרש כדי לנקות רקמות מבוגרים. הגישה הפסיבית שלנו בהירות גוברת על שני המחסומים הללו עם תהליך ניקוי מהיר שמסוגל לנקות במלואו את החול ואת רקמת הלב מבוגרים. טכניקת הניקוי הפסיבי של רקמת הבהירות הגיעה ליעילות המאפשרת הדמיה של מגוון אוכלוסיות של תאי לב, כולל אוכלוסיות נדירות המופצות ברחבי הלב המבוגר. כאשר הלב הנקי הוא התמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי, את הארכיטקטורה של המבנה הספציפי לתא במהלך פיתוח, מחלה, והתחדשות יכול להיות מואר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-thioglycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Prolene Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8889H</td>
			<td>Polypropylene Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16-050-146</td>
			<td>Half Curved, Serrated, 4 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-812-39</td>
			<td>Dissecting, 4.5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vial</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-339-26A</td>
			<td>12 x 35 mm Vial with Cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>2 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td>Straight, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-966</td>
			<td>Mayo-Hegar, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Forceps</td>
			<td>Sigma-Adrich</td>
			<td>Z168777</td>
			<td>Fine Tip, Straight, 4.25 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Dissecting Scissor</td>
			<td>Walter Stern Inc</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>30 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16050133</td>
			<td>Medium Tissue, 1X2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>Water-soluble azo initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging

מחלות לב וכלי דם הבטן כל סיבות אחרות של המוות והוא אחראי על 31% מדהים של מורטליקצבאות ברחבי העולם. מחלה זו מתבטאת בפגיעה בלב, בעיקר בצורה של אוטם שריר הלב חריפה. עם מעט חוסן לאחר הפציעה, רקמת לב בריאה פעם יוחלפו על ידי סיבי, לא הקונקטילה צלקת רקמה ולעתים קרובות להיות הקדמה אי ספיקת לב. כדי לזהות אפשרויות טיפול הרומן ברפואה רגנרטיבית, המחקר התמקד בחוליות עם יכולות משובי מולדת. אחד כזה אורגניזם מודל הוא עכבר ה, אשר מגיב לפציעה לב עם התחדשות חזקה שריר הלב. כדי לגרום לפציעה בעכבר ה, כי הוא רלוונטי קלינית, פיתחנו ניתוח כדי לסגר את העורק הקדמי שמאל בירידה (LAD), שיקוף אוטם שריר הלב המופעל על ידי טרשת עורקים בלב האנושי. מודל זה מספק לנו פלטפורמה לזיהוי המנגנונים המנחים את התחדשות הלב באמצעות הטכנולוגיה למעקב אחר שינויים בתוך האוכלוסיות האנטי-מיוציטים והלא-מיציט. קבלת תובנה על שינויים באוכלוסיות של תאי לב לאחר הפציעה הסתמך פעם בכבדות על שיטות כגון הבחנה רקמות הבדיקה היסטולוגית, אשר מוגבלים ניתוח דו מימדי ולעיתים קרובות נזק הרקמה בתהליך. יתר על כן, שיטות אלה חסרות את היכולת לעקוב אחר שינויים בתאי התאים, במקום זאת מספקת רק תמונה של תגובת הפציעה. כאן, אנו מתארים כיצד שיטות מתקדמות מבחינה טכנולוגית במודלים לאיתור השושלת, ניקוי איברים שלם ותלת מימדי (3D) המיקרוסקופיה מלאה יכול לשמש כדי להבהיר מנגנונים של תיקון לב. עם הפרוטוקול שלנו לניתוח אוטם שריר הלב של העכבר, ניקוי רקמות, 3D איברים שלמים הדמיה, מסלולים מורכבים לגרום להתפשטות הקרדיוציט יכול להיות מורכב, חשיפת מטרות טיפוליות הרומן להתחדשות הלב.

לעתים קרובות שני הצעדים המאתגרים ביותר מנחה את הלב מתוך חלל החזה ליגגאת LAD. כדי לפתור את הפעולות הבאות, ניתן לבצע התאמות במיקום הניקוב הראשוני בין השרירים הבין-מפרידים הרביעית; אם הניקוב והניתוח הקהה קרובים מדי בסמיכות לעצם החזה, ייתכן שהלב לא יוכל לצאת מחלל החזה (איור 1...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

התפשטות הקרדיוציט לאחר הפציעה היא תהליך דינאמי הדורש סימפוניה של רמזים בלתי-מיכיים מאוכלוסיות תאים שאינן מיוציט. ניצול מעקב אחר השושלת, בהירות פסיבית, ושלושה מימדים שלמים של מיקרוסקופ ההרכבה טכניקות, אנחנו יכולים לנתח את ההשפעה של מגוון סוגי תאים על תיקון לב והתחדשות.

לכידת תגובת פגיעה לב של אוכלוסיות תאים ממוקדות באמצעות לב נקי תלת מימדי הדמיה

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

התחדשות הלב הא אנדוגנית היא תהליך דינמי המערב סוגי תאים מרובים עובדים יחד בתיאום כדי לעלות תגובה רגנרטיבית חזקה. הצצה לתוך הרקמה המתחדשת באמצעות הדמיה תלת מימדית של הלב המנוקה בתגובה לפציעה יכולה לסייע בשחזור הדינמיקה התאית שמנחה את התגובה הרגנרטיבית הלבבית הזו. הפרוטוקול שלנו תוכנן במיוחד כדי לעקוב אחר תאים במהלך פיתוח והתחדשות.איננו צפויים למגבלות ביישום נרחב של טכניקות ההבהבה, הכתם וההדמיה שלנו על סוגי איברים אחרים. עבור העורק הכלילי הנגרמת על ידי LAD, תחילה לחסן את האזור הכירורגי של גור יילודים בן יום אחד עם פתרון חיטוי. בצע חתך עור רוחבי באזור החזה.כדי להפריד את העור מהשריר, השתמש בזוג מדחפי ההלבשה כדי להרים את העור בזהירות תוך לחיצה עדין על המספריים נגד השרירים הבין-חלקים בתקורה סגורה. אתר את החלל הבין-צלעי הרביעי ולהשתמש במלקחיים קטנים כדי להפוך את ניקור שטחי קטן דואג כדי למנוע את האיברים הפנימיים. באמצעות ניתוח קהה ומטליות ההלבשה, להרחיב את האזור בין השרירים הבין-חלקים רק עד אצבע ניתן להחיל על הצד השמאלי של הבטן תוך החזקת שטח intercostal פתוח עם מטליות ההלבשה בעדינות להנחות את הלב מתוך חלל החזה.לאחר שהלב חולץ, אפשר ללב לנוח על השרירים הבין-חלקיים ולאתר את LAD כאזור הלב עם דם פחות מקובץ. כדי לגרום אוטם שריר הלב, להשתמש תפר 6-0 לקשור קשר מרובע בחוזקה סביב כלי השיט פעמיים מבלי לנתק את העורק. בלאנשינג על איפקס יש לצפות מיד.חשוב להישאר עקביים על מיקום התפר לאורך LAD לגודל אוטם דומה. זה מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי גישה ללב במהירות בעוד הדם עדיין זורם דרך העורקים. כאשר התפר הונח, לאפשר ללב להחליק בחזרה לתוך חלל החזה.תפר את הצלעות יחד עם מנתח אחד וקשר מרובע אחד באמצעות ממטרות קהות כדי להרים את הסט העליון של הצלעות תוך העברת תפר 6-0 דרך הסט העליון והתחתון של הצלעות. יש למרוח כמות קטנה של דבק עור על הבטן העליונה ולהשתמש במדפים עדין כדי למקם את עור הבטן התחתונה מעל אזור החזה החשוף. לאחר מכן מניחים את הגור על משטח חימום ולבצע את הקשירה על החיה הבאה.לאחר ביצוע כל הניתוחים, החזירו את הגורים החמים והמוביילים לכלוב הביתי של האם. לבהירות פסיבית של רקמת הלב שנקטפה, 21 ימים לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן, מניחים את העכבר על אזור כירורגי נקי בתצורת השופע ומאבטחים את הגפיים בקלטת. באמצעות מטחנות רקמה, לתפוס את הפרווה ממש מתחת לתהליך xiphoid ולעשות חתך פורש את רוחב בית החזה.חותכים לצד החלקים הדיסטליים של בית החזה ולהשתמש במטליות כדי להרים את תהליך xiphoid לחשוף את הסרעפת. נתק את הסרעפת עם מדפים מעוגלים ולמשוך את הרקמה cranially עד הלב הפועם נגיש. השתמש במקלפים המעוקלים כדי לתפוס את הלב בבסיס ולהשתמש מספריים iridectomy לחתוך את כאב הלב ואת וונה קאווה מעולה.מניחים את הלב הפועם לתוך צלחת פטרי של PBS כך הלב שואב את כל הדם שמור. אוטם שריר הלב יכול להיות מאושר על ידי מיקום אנטומי נכון של רצועות LAD. כאשר הלב מפסיק לפעום, בעדינות לסחוט את האיבר עם ממטרות לגרש את הדם שיורית ולהעביר את הדגימה לתוך בקבוקון זכוכית חד פעמי 2.5 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של PBS.מניחים את הבקבוקון על שייקר לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר ומשנים את תווי PBS כל 10 דקות עד שהפתרון נשאר נקי מדם. כאשר PBS ברור, להחליף את PBS עם שני מיליליטר של קר 4% paraformaldehyde עבור דגירה של ארבע שעות בטמפרטורת החדר ואחריו שלוש 10 דקות שטיפה על השייקר עם שני מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, למלא את הבקבוקון עם שני מיליליטר של 4% אקרילאמיד בתוספת 0.5%VA-044 פתרון עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס.למחרת, מניחים את הבקבוקון בבלוק חום של 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. בסוף הפולימריזציה, מעבירים את הלב לבקבוקון קליפת זכוכית חדש ושוטפים את רקמת הלב בשני מיליליטר של PBS טרי 10 דקות בכל פעם מרעננים את ה- PBS בסוף כל דגירה. כאשר PBS ברור, להחליף את מאגר לשטוף עם שני מיליליטר של פתרון ניקוי.דגירה הדגימה ב 37 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות עד הלב ברור, מרענן את פתרון הסליקה כל יומיים עד שלושה ימים. כאשר האיבר ברור, לשטוף את הדגימה עם PBS על שייקר כפי שהוכח לפני מילוי הבקבוקון עם PBS טרי עבור דגירה 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, החלף את PBS עם RIMS עבור דגירה 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, הרקמה מנוקה לחלוטין. הרקמה צריכה להיות שקופה לאחר מספר שבועות. להדמיה של לב העכבר לאחר הלידה לאחר אינדוקציה אוטם שריר הלב, למלא חצי תא של שקופית דיכאון בהתאמה אישית עם PBS ולהשתמש מלקחים מעוגלים להעביר בזהירות את הלב פינה לתוך התא.מלא את הנפח הנותר של התא עם PBS. לאחר מכן למלא את התא עם PBS עד פני השטח של הנוזל יוצר כיפה מעל החלק העליון של התא ולהרכיב את החלקה כיסוי לפני הדמיה של הרקמה על ידי מיקרוסקופ קונפוקל על פי פרוטוקולי הדמיה סטנדרטיים. אם הנקב והתספורת הקהה קרובים מדי בסמיכות לעצם החזה, ייתכן שהלב לא יוכל לצאת חלל החזה.אם הלב לא יוצא בקלות מהחללים, יש להפעיל לחץ על הבטן השמאלית כדי להקל על התהליך. סיבוכים עלולים להתרחש מהנוחת הלב על השרירים הבין-חלקים. לכן, חשוב לשמור על הניתוח הקהה לגודל מינימלי בכיוון אופקי כדי לאפשר הדמיה ברורה ונגישות של LAD.שים לב כי קשירה שטחית יהיה פחות מקום להתאמה במיקום התפר הסופי, כי התפר קשירה סביב LAD צריך להתבצע עם תנועות קבועות מבוקרות. עד סוף שלב ההבהרה, הלב כולו צריך להיות אטום באופן עקבי ללא שינוי צבע במרכז. לאחר כמה ימים בתסרון RIMS בטמפרטורת החדר, הלב צריך להיות פינה לחלוטין וכמה הרחבת רקמות ניתן לראות.כפי שנצפה על ידי ביטוי חלבון כתב tdTomato, עצבי הלב הם בעיקר שטחיים עם כמה אוכלוסיות המתגוררות בשכבה האפיקארדית. חשוב לציין, אישור ביטוי חלבון הכתב נשמר לאחר שעבר את פרוטוקול הבהירות כפי שהוכח. ניקוי והדמיה של הלב תלת-ממדי מספקים פרספקטיבה למיקום ומורפולוגיה של אוכלוסיות תאי לב.זה מאפשר לנו לזהות היבטים חדשים בתבנית תאים ובאינטראקציות בין תאים לתאים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

דור של אגרגטים תא Murine לב קוצב לב בהתבסס על ES-Cell-תכנות בשילוב עם Myh6-יזם-בחירה

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

תלת מימדי רקמה אנושית דלקתיות במקבילות של חניכיים

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Organotypic תלת מימדי התרבויות שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...