Name: capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

このプロジェクトの資金は、ウィスコンシン州パートナーシッププログラム(A.I.M.)からUW医学公衆衛生大学院と米国心臓協会キャリア開発賞19CDA34660169(A.I.M.)によって提供されました。

実験はすべて、実験動物の使用とケアのためのガイドに従って、ウィスコンシン大学マディソン校医学公衆衛生学部の施設動物のケアと使用委員会に従って行われました。すべての方法は、野生型C57BL/ 6J(B6)およびジャクソン研究所から得られたトランスジェニックマウスラインで行われました。
1. 1日齢の新生児マウスにおける左前前下方動脈(LAD)の結紮により誘発された...

<ol>
	<li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Kikuchi, K., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regenerative+capacity+and+mechanisms.">Cardiac regenerative capacity and mechanisms.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Savarese, G., Lund, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Public+Health+Burden+of+Heart+Failure.">Global Public Health Burden of Heart Failure.</a> Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice.">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).</li><li>Karwowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+infarct+artery+location,+acute+total+coronary+occlusion,+and+mortality+in+STEMI+and+NSTEMI+patients.">Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients.</a> Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).</li><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).</li><li>MAGGIC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survival+of+patients+with+heart+failure+with+preserved+or+reduced+left+ventricular+ejection+fraction:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis.</a> European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).</li><li>Notari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+local+microenvironment+limits+the+regenerative+potential+of+the+mouse+neonatal+heart.">The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart.</a> Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neonatal+and+adult+mammalian+heart+regeneration+by+the+miR-15+family.">Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Collateral+Artery+Development+Program+Promotes+Neonatal+Heart+Regeneration.">A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration.</a> Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+neonatal+cardiac+extracellular+matrix+prevents+widespread+ventricular+remodeling+in+adult+mammals+after+myocardial+infarction.">Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction.</a> Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).</li><li>Mahmoud, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+Regulate+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration.">Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).</li><li>Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+lineage+tracing+methods+and+intestinal+tumors.">Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.</a> Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Phillips, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum:+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease.">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Scientific Reports. 6, 26013 (2016).</li><li>Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+in+Neonatal+Mice,+A+Model+of+Cardiac+Regeneration.">Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).</li><li>Sereti, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+clonal+expansion+during+mouse+heart+development+and+injury.">Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).</li><li>Lepilina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration.">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127 (3), 607-619 (2006).</li><li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair.">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li><li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li></ol>

心筋細胞と非筋細胞集団との細胞間相互作用は、心臓が線維症を受けるか、損傷後に修復するかの決定要因である。神経14、心外膜細胞,24、腹膜マクロファージ1425、動脈12、13、リンパ管内皮細胞26、およびリンパ管内皮細胞26を含む様々な細胞タイプが、すべて心臓修復を媒介する上で不可欠な...

心臓は長い間、マイトアティック後の器官であると考えられてきましたが、最近の証拠は、心筋細胞の再生が成人の人間の心臓で1年に約1%で起こることを示しています。しかし、これらの低い心筋細胞の回転率は、傷害後に起こる組織の大規模な損失を補充するには不十分である。心筋梗塞に苦しんでいる心臓は約10億個の心筋細胞を失い、しばしば心不全と突然の心臓死の前兆として22,33を果たします。世界中で2,600万人以上の人々が心不全の影響を受けているので、心臓病4によって引き起こされた損害を取り消すことができる治療のための満たされていない必要性があります。
治療におけるこのギャップを埋めるために、科学者たちは、傷害後の内因性再生の根源である進化的に保存されたメカニズムの調査を開始しました。哺乳類の心臓再生を研究するための1つのモデルは、新生児マウスである。生後1週間以内に、新生児マウスは心臓損傷5に続く強い再生応答を有する。我々は以前、新生児マウスが心尖部切除5に続く心筋細胞増殖を介して心臓を再生できることを実証した。この技術は新生児の心臓再生を呼び起こす可能性があるが、手術は人間の心臓傷害との臨床的関連性を欠いている。新生児マウスモデルにおける人的傷害を模倣するために、冠状動脈閉塞6を通して心筋梗塞を誘発する技術を開発した。この技術は、左心室心筋6,7に血液の40%〜50%を送達する役割を果たす左前下降下動脈(LAD)の外科的結紮を必要とする7。したがって、手術は左心室壁のかなりの部分に影響を与える梗塞をもたらす。心筋へのこの損傷は、新生児における心筋細胞増殖および心臓再生を刺激する5.
冠状動脈閉塞手術は、心臓再生の内部の働きを明らかにするために、非常に再現性の高い、直接翻訳方法を提供します。新生児手術は、ヒト心臓における冠動脈アテローム性動脈硬化症と平行して、動脈の内壁内にプラークが蓄積すると閉塞とその後の心筋梗塞8を引き起こす可能性がある。心不全患者の治療治療の空隙のために、LADの閉塞は傷害9後1年以内に最大26%に達する死亡率に関連しており、その結果、「未亡人メーカー」と呼ばれています。治療の進歩には、心臓損傷の複雑な生理学的および病理学的影響を正確に反映するモデルが必要です。新生児マウス心臓損傷のための当社の外科プロトコルは、研究者が損傷後に哺乳類の心臓再生を知らせる分子および細胞の手がかりを調査することを可能にするプラットフォームを提供します。
最近の研究では、細胞外環境と増殖型心筋細胞との動的関係が明示されています。例えば、心部10を取り巻く細胞外マトリックスの剛性を減少させることにより、出生後回生期の窓を延長することができる。新生児細胞外マトリックスからの生体材料はまた、心臓損傷11に続く成人哺乳類の心臓における心臓再生を促進することができる。また、心筋細胞増殖に伴う血管形成応答12,13;12,新生児マウスの再生心臓に特有の副動脈形成は、心臓再生12を刺激するために不可欠であることが示された。さらに、我々の研究室は神経シグナル伝達が成長因子レベルの変調を介して心筋細胞増殖および心臓再生を調節することを実証した。これらの知見は、心臓損傷に応答して非筋細胞集団を追跡する必要性を強調している。この目的を達成するために、トランスジェニックマウスラインにおけるCre-lox組換えシステムを利用して、系統トレースのための蛍光レポータータンパク質の構成的または条件的な発現を組み込んでいます。さらに、高度な方法を用いて、Cre依存型の多色蛍光レポーターの確率的発現に依存するレインボーマウスラインを用いてクローン拡張パターンを決定し、標的細胞集団15のクローン拡張を決定することができる。新生児冠動脈閉塞手術で系統トレースを採用することは、心臓再生の複雑な細胞機構を解剖するための強力なツールです。
3次元(3D)の臓器全画像を用いて蛍光標識細胞の系統を追跡することは、特に神経線維や血管などの細胞集団が壊れやすい場合に、従来の断面化と再構成技術を用いて達成することは困難である。光学断面による臓器の直接全実装イメージングは表面的な細胞集団を捕捉することができるが、組織の奥深くに存在する構造はアクセスできないままである。これらの障壁を回避するために、組織クリア技術は、臓器組織全体の不透明度を低減するために開発されています。近年、脂質抽出16を介して固定組織をクリアする透明脂質交換アクリルアミドハイブリジッドリジッドイメージング適合組織hYdrogel(CLARITY)ベースの方法に大きな進歩がなされている。また、屈折率を均質化し、その後、撮像しながら光散乱を低減するステップも取られる。そのような方法の1つは活性なCLARITYであり、電気泳動を用いて組織18全体に洗浄剤を浸透させることによって脂質分解を促進する。効果的であるが、この組織の清算方法は高価な機器を必要とし、組織損傷を引き起こす可能性があり、心臓神経19のような脆弱な細胞集団との相容れないアプローチを作る。したがって、我々は穏やかに洗剤の浸透を促進するために熱に依存する受動的なCLARITYアプローチを採用し、したがって、複雑な細胞構造20、21,21の保持を支援する。
受動クラリティは、通常、アクティブなCLARITY18よりも効率が悪いと考えられていますが、この技術には、臓器の深さ全体をクリアできないことと、成人組織をクリアするために必要な膨大な時間という2つの大きな障害がしばしば伴います。私たちの受動的なCLARITYアプローチは、新生児および成人心臓組織を完全にクリアすることができる迅速な清算プロセスでこれらの障壁の両方を克服する。当社の受動的なCLARITY組織クリアリング技術は、成人心臓全体に分布する稀な集団を含む様々な心臓細胞集団の可視化を可能にする効率に達した。クリアされた心臓を共焦点顕微鏡で画像化すると、発達中、疾患、再生中の細胞特異的パターニングのアーキテクチャを照らすことができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-thioglycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Prolene Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8889H</td>
			<td>Polypropylene Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16-050-146</td>
			<td>Half Curved, Serrated, 4 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-812-39</td>
			<td>Dissecting, 4.5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vial</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-339-26A</td>
			<td>12 x 35 mm Vial with Cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>2 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td>Straight, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-966</td>
			<td>Mayo-Hegar, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Forceps</td>
			<td>Sigma-Adrich</td>
			<td>Z168777</td>
			<td>Fine Tip, Straight, 4.25 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Dissecting Scissor</td>
			<td>Walter Stern Inc</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>30 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16050133</td>
			<td>Medium Tissue, 1X2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>Water-soluble azo initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging

心血管疾患は、他のすべての死因を上回り、世界中の死亡率の驚異的な31%を占めています。この疾患は、主に急性心筋梗塞の形で、心臓傷害に現れる。傷害後の回復力がほとんどなく、かつて健康な心臓組織は繊維状の非収縮性瘢痕組織に置き換えられ、しばしば心不全の前兆となる。再生医療における新しい治療法の選択肢を特定するために、研究は生来の再生能力を持つ脊椎動物に焦点を当てています。そのようなモデル生物の1つは新生児マウスであり、強い心筋再生で心臓損傷に反応する。臨床的に関連する新生児マウスの傷害を誘発するために、我々は、ヒト心臓のアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる心筋梗塞を反映して、左前下降動脈(LAD)を閉塞させる手術を開発した。心筋細胞と非筋細胞集団の両方の変化を追跡する技術と一致すると、このモデルは心臓再生を導くメカニズムを特定するプラットフォームを提供します。傷害後の心臓細胞集団の変化に関する洞察を得ることは、かつて組織切片や組織学的検査などの方法に大きく依存していました。さらに、これらの方法は、細胞系の変化を追跡する能力を欠き、代わりに傷害応答のスナップショットを提供するだけである。系統追跡モデル、全臓器のクリアリング、3次元(3D)全実装顕微鏡の技術的に高度な方法を用いて、心臓修復のメカニズムを解明する方法を説明する。新生児マウス心筋梗塞手術、組織クリアリング、3D全臓器イメージングのプロトコルにより、心筋細胞増殖を誘導する複雑な経路が解明され、心臓再生のための新しい治療標的が明らかになりました。

多くの場合、2つの最も困難なステップは、胸腔から心臓を導き出し、LADを結び付けることです。これらの手順をトラブルシューティングするために、第 4 肋間筋肉間の最初の穿刺の配置に調整が加えられることがあります。穿刺と鈍い解剖が胸骨に近すぎると、心臓が胸腔から出ることができない場合があります(図1A)。
さらに、この?...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

心筋細胞増殖後の傷害は、非筋細胞集団からの細胞外の手がかりの交響を必要とする動的プロセスである。系統トレース、パッシブクラリティ、3次元全型共焦点顕微鏡技術を利用して、様々な細胞タイプが心臓修復および再生に及ぼす影響を分析することができます。

クリアされた心臓3次元イメージングによる標的細胞集団の心臓損傷応答のキャプチャ

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

内因性心臓再生は、複数の細胞タイプが協調して協力して、堅牢な再生応答を取り付ける動的プロセスです。損傷に応答してクリアされた心臓の3D画像を介して再生組織をピアリングすることは、この心臓回生応答を導く細胞ダイナミクスの再構築に役立つ可能性がある。当社のプロトコルは、開発中および再生中に細胞を追跡するように特別に設計されています。私たちは、クリアリング、染色、イメージング技術を他の臓器タイプに広く適用することに制限はないと予見しています。LAD誘発冠動脈閉塞の場合、まず麻酔薬を用いた1日齢の新生児の外科領域を消毒液で殺菌する。胸部領域で横方向の皮膚切開を行います。皮膚と筋肉を分離するには、ドレッシング鉗子を使用して皮膚を慎重に持ち上げながら、肋間筋に対してはさみを閉じた位置に軽く押し付けます。第4肋間空間を見つけ、内臓を避けるために注意を払って小さな表面穿刺を行うために小さな鉗子を使用する。鈍い解剖とドレッシング鉗子を使用して、指が腹部の左側に適用されるまで肋間筋の間の領域を広げながら、胸腔から心臓を穏やかに導くためにドレッシング鉗子で開いた肋間空間を保持します。心臓が抽出されたら、心臓が肋間筋の上に休み、LADを血液のプールが少ない心臓の領域として見つけることができます。心筋梗塞を誘発するには、6-0縫合糸を使用して、動脈を切断することなく、血管の周りに正方形の結び目を2回しっかりと結びます。頂点でのブランチングは、直ちに観察する必要があります。同様の梗塞サイズのために、LADに沿った縫合線配置に一貫性を保ることが重要です。これは、血液がまだ動脈を流れている間に心臓に素早くアクセスすることによって達成されるのが最善です。縫合糸が置かれたら、心臓が胸腔に戻るようにします。肋骨の上下のセットを通して6-0の縫合を渡しながら肋骨の上のセットを持ち上げるために鈍い鉗子を使用して1人の外科医と1つの正方形の結び目と一緒に肋骨を縫合する。上部腹部に少量の皮膚接着剤を塗布し、細かい鉗子を使用して、露出した胸部領域の上に下腹部の皮膚を配置します。次に、子犬を加熱パッドに置き、次の動物にライゲーションを行います。すべての手術が行われたら、暖かく移動した子犬を母親の自宅のケージに戻します。収穫された心臓組織の受動的な明瞭さのために、足の指のピンチに対する応答の欠如を確認した後の21日間の手術後、マウスをsupine位置の清潔な外科領域に置き、テープで手足を固定する。ティッシュ鉗子を使用して、シフォイドプロセスのすぐ下に毛皮をつかみ、胸部の幅にまたがる切開を行います。胸部の遠位部分と一緒にカットし、側面を露出するxiphoidプロセスを持ち上げるために鉗子を使用します。湾曲した鉗子で横隔膜を取り外し、鼓動心臓がアクセス可能になるまで組織を耳に引っ張ります。湾曲した鉗子を使用してベースの心臓をつかみ、虹彩切りはさみを使用して大根と優れた大静脈を切断します。心臓が保持された血液をポンプアウトするように、鼓動心臓をPBSのペトリ皿に入れます。心筋梗塞は、LAD結紮の正しい解剖学的配置によって確認することができる。心臓が鼓動を止めたら、残りの血液を排出するために鉗子で器官を静かに絞り、2ミリリットルのPBSを含む使い捨ての2.5ミリリットルのガラスシェルバイアルに標本を移す。溶液が血液から離れるまで、10分ごとにPBS溶液を変える室温で少なくとも30分間シェーカーの上にバイアルを置きます。PBSが明らかになったら、PBSを2ミリリットルの冷たい4%パラホルムアルデヒドに置き換え、室温で4時間のインキュベーションを行い、続いてシェーカーに10分間の洗浄を3回、洗浄ごとに2ミリリットルの新鮮なPBSを使用します。最後の洗浄後、バイアルに4%アクリルアミドの2ミリリットルを充填し、摂氏4度で一晩インキュベーションを行うために0.5%VA-044溶液を補います。翌日、バイアルを37°Cのヒートブロックに3時間置きます。重合の終わりに、心臓を新しいガラスシェルバイアルに移し、新鮮なPBSの2ミリリットルで心臓組織を10分間洗浄し、すべてのインキュベーションの終わりにPBSをリフレッシュします。PBSが透明になったら、洗浄液を2ミリリットルのクリア液に交換します。心臓がはっきりするまで数週間摂氏37度で試料をインキュベートし、2~3日ごとにクリア液をリフレッシュします。臓器が透明になったら、37°Cで24時間インキュベーションのために新鮮なPBSでバイアルを補充する前に実証されているようにシェーカー上のPBSで標本を洗います。翌日、PBSをリムスに置き換え、摂氏37度で24時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、組織は完全にクリアされます。組織は数週間後に透明になるはずです。心筋梗塞誘導後にクリアされた出生後マウス心臓の画像処理のために、カスタムメイドのうつ病スライドのチャンバーの半分をPBSで満たし、曲がった鉗子を使用してクリアされた心臓をチャンバーに慎重に移します。チャンバーの残りの容積をPBSで満たします。次に、液体の表面がチャンバの上部の上にドームを形成するまでPBSでチャンバーを充填し、標準的なイメージングプロトコルに従って共焦点顕微鏡で組織をイメージングする前にカバースライドを取り付けます。穿刺と鈍い解剖が胸骨に近すぎると、心臓が胸腔から出ることができない可能性があります。心臓が空洞から出てこない場合は、左腹部に圧力をかけ、プロセスを容易にします。合併症は、肋間筋に心臓を休ませることから起こり得る。したがって、LADの明確な可視化とアクセシビリティを可能にするために、鈍い解剖を水平方向の最小サイズに保つことが重要です。表面的な結紮は、最終的な縫合位置で調整する余地が少なく、LADの周りの縫合線は制御された安定した動きで行われるべきであることに注意してください。クリアリングステップの終わりまでに、心臓全体が一貫して中心に変色を伴わない不透明でなければなりません。室温でRIMS溶液で数日後、心臓は完全にクリアされ、いくつかの組織の膨張が観察される可能性があります。tdTomatoレポータータンパク質発現により観察されるように、心神経は主に外心層に存在する一部の集団と表面的である。重要なことに、レポータータンパク質発現確認は、示されるように明瞭なプロトコルを受けた後に保存される。3D心臓をクリアしてイメージングすると、心臓細胞集団の位置と形態に関する視点が提供されます。これにより、細胞パターニングや細胞間相互作用の新たな側面を特定することができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

MYH6プロモーター - 選択と組み合わせたES細胞のプログラミングに基づいて、マウス心臓ペースメーカー細胞凝集体の生成

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

の血液細胞集団のアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

歯肉の炎症性三次元人体同等

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

前庭と聴覚の感覚器官の三次元切片培養

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...