Name: capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

이 프로젝트에 대한 기금은 위스콘신 파트너십 프로그램 (A.I.M.)에서 UW 의과 공중 보건 학교와 미국 심장 협회 경력 개발 상 19CDA34660169 (A.I.M.)에 의해 제공되었습니다.

모든 실험은 실험실 동물의 사용 및 관리를위한 가이드에 따라 위스콘신 - 매디슨 대학의 의학 및 공중 보건 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행되었습니다. 모든 방법은 잭슨 연구소에서 얻은 야생 형 C57BL / 6J (B6) 및 형질전환 마우스 라인에서 수행되었다.
1. 관상 동맥 폐색 (심근 경색) 1 일 된 신생아 마우스에서 왼쪽 전방 내림차순 동맥 (LAD)의 결찰을 통해 유?...

<ol>
	<li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Kikuchi, K., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regenerative+capacity+and+mechanisms.">Cardiac regenerative capacity and mechanisms.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Savarese, G., Lund, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Public+Health+Burden+of+Heart+Failure.">Global Public Health Burden of Heart Failure.</a> Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice.">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).</li><li>Karwowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+infarct+artery+location,+acute+total+coronary+occlusion,+and+mortality+in+STEMI+and+NSTEMI+patients.">Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients.</a> Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).</li><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).</li><li>MAGGIC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survival+of+patients+with+heart+failure+with+preserved+or+reduced+left+ventricular+ejection+fraction:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis.</a> European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).</li><li>Notari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+local+microenvironment+limits+the+regenerative+potential+of+the+mouse+neonatal+heart.">The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart.</a> Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neonatal+and+adult+mammalian+heart+regeneration+by+the+miR-15+family.">Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Collateral+Artery+Development+Program+Promotes+Neonatal+Heart+Regeneration.">A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration.</a> Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+neonatal+cardiac+extracellular+matrix+prevents+widespread+ventricular+remodeling+in+adult+mammals+after+myocardial+infarction.">Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction.</a> Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).</li><li>Mahmoud, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+Regulate+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration.">Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).</li><li>Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+lineage+tracing+methods+and+intestinal+tumors.">Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.</a> Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Phillips, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum:+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease.">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Scientific Reports. 6, 26013 (2016).</li><li>Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+in+Neonatal+Mice,+A+Model+of+Cardiac+Regeneration.">Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).</li><li>Sereti, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+clonal+expansion+during+mouse+heart+development+and+injury.">Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).</li><li>Lepilina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration.">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127 (3), 607-619 (2006).</li><li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair.">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li><li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li></ol>

심근세포와 비 근세포 집단 사이의 세포 세포 상호 작용은 심장이 섬유증을 겪거나 부상 다음 수리를 받을지 여부를 결정하는 요소입니다. 발견은 신경14,후막 세포24,복막 대식세포25,동맥12,,13,및 림프내피세포(26)를포함한 다양한 세포 유형이 모두 심장 수리를 중재하는 데 필수적...

심혼은 오래 포스트 유사분열 기관으로 여겨지고 있습니다, 그러나 최근 기록은 심근 세포 갱신이 대략 1%에 성인 인간 심혼에서 일어납니다1. 그러나, 심근 세포 회전율의 이 낮은 비율은 상해 다음 생기는 조직의 거대한 손실을 보충하기 위하여 불충분합니다. 심근 경색을 겪은 심장은 심근세포 약 10억 개를 잃게 되며, 종종 심부전과 갑작스런 심장 사망의 전주곡으로 쓰일 수 있습니다2,,3. 전 세계적으로 2,600만 명 이 넘는 사람들이 심장 마비로 인해 심장 질환으로 인한 피해를 되돌릴 수있는 치료법에 대한 충족되지 않은필요성이 있습니다 4.
치료에 있는 이 격차를 해소하기 위하여는, 과학자는 상해 다음 내인성 재생의 기초가 되는 진화적으로 보존한 기계장치를 조사하기 시작했습니다. 포유류 심장 재생을 연구하기위한 하나의 모델은 신생아 마우스입니다. 출생 다음 주 안에, 신생아 마우스는 심장 손상 다음 강력한 재생 반응이5. 우리는 이전에 신생아 마우스가 정점 절제술5에 따라 심근 세포 증식을 통해 심장을 재생할 수 있음을 입증했습니다. 이 기술은 신생아에서 심장 재생을 불러 일으킬 수 있지만, 수술은 인간의 심장 부상에 임상 관련성이 부족합니다. 신생아 마우스 모델에서 사람의 상해를 모방하기 위해 관상동맥 폐색을 통해 심근경색을 유도하는 기술을개발하도6. 이 기술은 좌심실 심근 에 혈액의 40%-50%를 전달하는 책임있는 좌측 전방 내림차종 동맥 (LAD)의 외과결찰을 요구합니다 6,,7. 따라서, 수술은 좌심실 벽의 상당 부분에 영향을 미치는 경색을 초래한다. 심근에 이 손상은 신생아에 있는 심근 세포 증식 그리고 심혼 재생을 자극할 것입니다5.
관상 동맥 폐색 수술은 심장 재생의 내부 작용을 밝히기 위해 매우 재현가능하고 직접적인 번역 방법을 제공합니다. 신생아 수술은 인간의 심장에 관상 동맥 동맥 경화증을 평행, 여기서 동맥의 내벽 내에서 플라크의 축적은 폐색 및 후속 심근 경색을 일으킬 수 있습니다8. 심부전 환자를 위한 치료 치료에 있는 무효 때문에, LAD에 있는 폐색은 상해9다음 년 안에 26%까지 도달하는 사망률과 연관되고, 결과적으로 "과부 제조자"로 불려졌습니다. 치료법의 발전은 심장 손상의 복잡한 생리적 및 병리학적 효과를 정확하게 반영하는 모델이 필요합니다. 신생아 마우스 심장 부상에 대한 우리의 수술 프로토콜은 연구원이 부상 후 포유류 심장 재생을 신호 분자 및 세포 단서를 조사 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.
최근 연구는 세포 외 환경과 증식 심근 세포 사이의 동적 관계를 강조합니다. 예를 들어, 산후 재생 창은심장(10)을둘러싼 세포외 기질의 강성을 감소시킴으로써 연장될 수 있다. 신생아 외 세포 질성에서 생체 물질은 또한 심장 부상 다음 성인 포유류 심장에서 심장 재생을 촉진 할 수있습니다 11. 또한 수반되는 심근세포 증식은 혈관신생 반응12,,13; 신생아 마우스의 재생심장에 특이적인 부수적인 동맥 형성은 심장 재생을 자극하는 데 필수적인 것으로 나타났다12. 더욱이, 우리의 실험실은 신경 신호가 성장 인자 수준의 변조를 통해 심근 세포 증식 및 심장 재생을 조절하고, 부상 다음 염증반응14를입증했다. 이 사실 인정은 심장 상해에 응하여 비 근세포 세포 인구를 추적하는 필요를 강조합니다. 이 목표를 달성하기 위해, 우리는 계보 추적을 위한 형광 리포터 단백질의 구성또는 조건부 표현을 통합하기 위하여 형질전환 마우스 라인에 있는 Cre-lox 재조합 시스템을 이용했습니다. 더욱이, 우리는 표적 세포집단(15)의클론 팽창을 결정하기 위해 Cre 의존성, 다색 형광기의 스토컨스 발현에 의존하는 레인보우 마우스 라인으로 클론 팽창 패터닝을 결정하기 위한 고급 방법을 사용할 수 있다. 신생아 관상 동맥 폐색 수술과 계보 추적을 채택하는 것은 심장 재생의 복잡한 세포 메커니즘을 해부하기위한 강력한 도구입니다.
3차원(3D) 전체 장기 이미징으로 형광표지된 세포의 혈통을 추적하는 것은 전통적인 단면화 및 재건 기법을 사용하여 달성하기 가 어렵습니다 - 특히 신경 섬유 나 혈관과 같은 세포 집단이 취약할 때. 광학 단면에 의하여 기관의 직접적인 전체 마운트 화상 진찰이 표면 적인 세포 인구를 붙잡을 수 있는 동안, 조직 내의 깊은 곳에 있는 구조물은 접근할 수 없는 남아 있습니다. 이러한 장벽을 우회하기 위해 전체 장기 조직의 불투명도를 줄이기 위해 조직 정리 기술이 개발되었습니다. 최근에는 지질추출을통해 고정조직을 클리어하는 클리어 지질교환 아크릴아미드-혼성화 강성 이미징 호환 조직 hYdrogel(CLARITY)-기반 방법(CLARITY)에 상당한 진전이 이루어지고 있다. 단계는 또한 굴절률을 균질화하고 이후에 화상 진찰17동안 광 산란을 감소시키기 위하여 취합니다. 이러한 방법 중 하나는 활성 CLARITY이며, 이는 전기 활성을 이용하여 조직 전체에 세제를 침투시킴으로써 지질 분해를가속화한다(18). 효과적이지만, 이 조직 정리 방법은 고가의 장비를 필요로 하고 조직 손상을 일으킬 수 있으며, 심장신경(19)과같은 연약한 세포 집단과 호환되지 않는 접근법을 만드는 것이다. 따라서, 우리는 부드럽게 세제 침투를 용이하게하기 위해 열에 의존 수동 CLARITY 접근 방식을 채택, 따라서 복잡한 세포 구조의 보존에 도움20,,21.
수동 선명도는 일반적으로 활성 CLARITY 보다 덜 효율적인 것으로 생각된다 18,기술은 종종 두 가지 주요 장애물을 동반: 전체 장기 깊이 지우지 못하는 성인 조직을 취소 하는 데 필요한 시간의 광범위 한 금액. 우리의 수동적인 CLARITY 접근법은 신생아와 성인 심장 조직을 완전히 지를 수 있는 신속한 클리어링 프로세스로 이러한 장벽을 모두 극복합니다. 우리의 수동 CLARITY 조직 정리 기술은 성인 심혼을 통하여 분포된 희소한 인구를 포함하여 심장 세포 인구의 다양한 의 시각화를 허용하는 효율성에 도달했습니다. 지워진 심혼이 공초점 현미경으로 심상될 때, 발달, 질병 및 재생 도중 세포 특정 패터닝의 건축은 점등될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-thioglycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Prolene Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8889H</td>
			<td>Polypropylene Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16-050-146</td>
			<td>Half Curved, Serrated, 4 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-812-39</td>
			<td>Dissecting, 4.5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vial</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-339-26A</td>
			<td>12 x 35 mm Vial with Cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>2 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td>Straight, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-966</td>
			<td>Mayo-Hegar, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Forceps</td>
			<td>Sigma-Adrich</td>
			<td>Z168777</td>
			<td>Fine Tip, Straight, 4.25 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Dissecting Scissor</td>
			<td>Walter Stern Inc</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>30 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16050133</td>
			<td>Medium Tissue, 1X2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>Water-soluble azo initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging

심혈관 질환은 다른 모든 사망 원인을 능가하며 전 세계적으로 사망률의 31%를 차지합니다. 이 질병은 주로 급성 심근 경색의 형태로 심장 손상으로 나타납니다. 부상 다음 약간의 탄력성으로, 한 번 건강한 심장 조직은 섬유질로 대체됩니다, 비 수축 흉터 조직종종 심장 마비의 전주곡이 될. 재생 의학에서 새로운 치료 옵션을 식별 하기 위해, 연구는 타고난 재생 기능을 가진 척추 동물에 초점을 맞추고 있다. 그러한 모델 유기체 중 하나는 강력한 심근 재생으로 심장 손상에 반응하는 신생아 마우스입니다. 임상적으로 관련이 있는 신생아 마우스의 부상을 유도하기 위해, 우리는 인간의 심장에 있는 동맥 경화증에 의해 유발된 심근 경색을 미러링하는 왼쪽 전방 내림차순 동맥 (LAD)을 폐색하는 수술을 개발했습니다. 심근세포 와 비 근세포 집단 내의 변화를 추적하는 기술과 일치할 때, 이 모형은 심혼 재생을 인도하는 기계장치를 확인하는 플랫폼을 저희에게 제공합니다. 상해 다음 심장 세포 인구에 있는 변경에 통찰력을 얻는 것은 한 번 2 차원 분석으로 제한되고 수시로 프로세스에 있는 조직을 손상하는 조직 단면도 와 조직학 검사와 같은 방법에 크게 의존했습니다. 더욱이, 이 방법은 세포 계의 변경을 추적하는 기능이 부족합니다, 대신 상해 반응의 단지 스냅샷을 제공하. 여기에서는 계보 추적 모델, 전체 장기 클리어링 및 3차원(3D) 전체 마운트 현미경 검사법에서 기술적으로 진보된 방법을 사용하여 심장 수리 메커니즘을 설명하는 방법을 설명합니다. 신생아 마우스 심근 경색 수술, 조직 정리 및 3D 전체 장기 이미징을위한 프로토콜을 사용하면 심근 세포 증식을 유도하는 복잡한 경로를 풀어 심장 재생을위한 새로운 치료 목표를 드러냅니다.

종종 가장 어려운 두 단계는 가슴 구멍에서 심장을 안내하고 LAD를 결찰하는 것입니다. 이러한 단계를 해결하기 위해, 조정은 제 4 늑간 근육 사이의 초기 펑크의 배치에 이루어질 수있다; 천자와 무딘 해부가 흉골에 너무 가깝으면 심장이 흉강을 빠져 나갈 수 없을 수 있습니다(그림 1A).
추가적으로, 좌측 복부에 증가한 압력은 이 프로세스를...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

상해 다음 심근 세포 증식은 비 근세포 세포 집단에서 세포 외 단서의 교향곡을 요구하는 동적 프로세스입니다. 계보 추적, 수동 선명도 및 3차원 전체 마운트 공초점 현미경 기술을 활용하여 다양한 세포 유형이 심장 수리 및 재생에 미치는 영향을 분석할 수 있습니다.

클리어 심장 3 차원 이미징을 통해 표적 세포 집단의 심장 손상 반응을 캡처

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

내인성 심장 재생은 강력한 재생 반응을 탑재하기 위해 함께 작업하는 여러 세포 유형을 포함하는 동적 과정입니다. 부상에 대한 응답으로 클리어 된 심장의 3D 이미징을 통해 재생 조직으로 피어링은이 심장 재생 반응을 안내하는 세포 역학의 재건에 도움이 될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 개발 및 재생 중에 세포를 추적하도록 특별히 설계되었습니다.우리는 다른 장기 유형에 우리의 청산, 염색 및 화상 진찰 기술을 광범위하게 적용하는 데 아무런 제한이 없다고 예측합니다. LAD 유도 관상 동맥 폐색의 경우, 먼저 살균 된 1 일 된 신생아 새끼의 수술 부위를 살균하여 방부제 용액을 제공합니다. 가슴 부위에 횡단 피부 절개를 합니다.피부와 근육을 분리하려면 드레싱 포셉을 사용하여 피부를 조심스럽게 들어 올리는 동시에 가위를 닫힌 자세로 늑간 근육에 부드럽게 누르십시오. 네 번째 늑간 공간을 찾아 작은 집게를 사용하여 내부 장기를 피하기 위해 작은 피상적 인 구멍을 처리합니다. 무딘 해부와 드레싱 집게를 사용하여, 손가락이 복부의 왼쪽에 적용 될 때까지 늑간 근육 사이의 영역을 넓히고 드레싱 집게로 늑간 공간을 열어 가슴 구멍에서 부드럽게 안내합니다.심장이 추출되면 심장이 늑간 근육에 휴식을 취하여 풀이 덜 한 혈액을 가진 심장 영역으로 LAD를 찾도록 하십시오. 심근 경색을 유도하기 위해 6-0 봉합사를 사용하여 동맥을 끊지 않고 용기 주위에 사각형 매듭을 두 번 단단히 묶습니다. 정점에 희게 즉시 관찰해야합니다.비슷한 경색 크기에 대 한 LAD를 따라 봉합사 배치에 일관성을 유지 하는 것이 중요 하다. 이것은 혈액이 아직도 동맥을 통해 흐르는 동안 심장에 빨리 접근하여 달성됩니다. 봉합사가 배치되면 심장이 가슴 구멍으로 다시 미끄러질 수 있습니다.갈비뼈의 상부와 하부 세트를 통과하는 동안 갈비뼈의 상부 세트를 들어 올리는 무딘 집게를 사용하여 한 외과 의사와 한 평방 매듭과 함께 갈비뼈를 봉합합니다. 상복부에 소량의 피부 접착제를 바르고 미세 한 집게를 사용하여 노출 된 가슴 부위에 하복부의 피부를 배치하십시오. 그런 다음 강아지를 가열 패드에 놓고 다음 동물에 결찰을 수행합니다.모든 수술이 수행되면 따뜻하고 이동식 새끼를 어머니의 집 케이지로 되돌려 놓습니다. 수확된 심장 조직의 수동적인 명확성을 위해, 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후 21일 수술 후, 마우스를 supine 위치에 있는 깨끗한 수술 부위에 놓고 테이프로 팔다리를 고정시하십시오. 조직 집게를 사용하여, xiphoid 과정 바로 아래에 모피를 잡고 흉곽의 폭에 걸쳐 절개를합니다.흉곽의 말단 부분과 함께 잘라 횡격막을 노출하는 xiphoid 과정을 들어 올리기 위해 집게를 사용합니다. 다이어프램을 구부러진 집게로 분리하고 박동하는 심장이 접근 할 때까지 조직을 미친 듯이 당깁니다. 곡선 된 집게를 사용하여 베이스의 심장을 파악하고 iridectomy 가위를 사용하여 대오르타와 우수한 베나 카바를 자른다.심장이 유지된 혈액을 펌핑할 수 있도록 박동하는 심장을 PBS의 페트리 접시에 넣습니다. 심근 경색은 LAD 결찰의 올바른 해부학적 배치에 의해 확인될 수 있다. 심장박동이 멈추면, 잔류 혈액을 추방하고 표본을 PBS 의 2 밀리리터를 포함하는 일회용 2.5 밀리리터 유리 껍질 바이알로 옮기기 위해 집게로 기관을 부드럽게 짜냅니다.용액이 혈액이 제거될 때까지 10분마다 PBS 용액을 변경하는 실온에서 적어도 30분 동안 바이알을 셰이커에 놓습니다. PBS가 명확할 때 PBS를 실온에서 4시간 동안 잠복한 후 워시당 2밀리리터의 신선한 PBS2밀리리터로 셰이커에 10분 동안 세척할 수 있는 2밀리리터로 PBS를 교체하십시오. 마지막 세척 후, 4%의 아크릴아미드의 2밀리리터로 바이알을 채우고 섭씨 4도에서 하룻밤 잠복할 수 있도록 0.5%VA-044 용액을 보충합니다.다음 날, 3 시간 동안 섭씨 37도 열 블록에 유리병을 배치합니다. 중합의 끝에서, 새로운 유리 껍질 유리 바이알로 심혼을 전송하고 모든 잠복의 끝에 PBS를 상쾌하게 한 번에 신선한 PBS 10 분의 2 밀리리터에 심장 조직을 씻어. PBS가 명확하면 세척 버퍼를 2밀리리터의 클리어링 솔루션으로 교체합니다.심장이 맑을 때까지 몇 주 동안 섭씨 37도에서 표본을 배양하여 2~3일마다 클리어링 솔루션을 새로 고침합니다. 장기가 명확할 때, 37섭씨에서 24시간 배양을 위해 바이알을 신선한 PBS로 리필하기 전에 시연된 대로 셰이커에 PBS로 시편을 씻으시다. 다음 날, PBS를 RIMS로 교체하여 섭씨 37도에서 24시간 배양할 수 있습니다.잠복이 끝나면 조직이 완전히 지워집니다. 조직은 몇 주 후에 투명해져야 합니다. 심근 경색 유도 후 삭제 된 산후 마우스 심장의 이미징을 위해 PBS와 맞춤형 우울증 슬라이드의 챔버의 절반을 채우고 곡선 된 집게를 사용하여 클리어 된 심장을 조심스럽게 챔버로 옮긴다.PBS로 챔버의 나머지 볼륨을 채웁니다. 그런 다음 액체 표면이 챔버의 상단 위에 돔을 형성하고 표준 이미징 프로토콜에 따라 공초점 현미경에 의해 조직을 이미징하기 전에 커버 슬라이드를 장착 할 때까지 PBS로 챔버를 채웁니다. 천자와 무딘 해부는 흉골에 근접너무 가까이있는 경우, 심장은 가슴 구멍을 종료하지 못할 수 있습니다.심장이 쉽게 구멍을 빠져나가지 않으면 왼쪽 복부에 압력을 가하여 과정을 용이하게 하십시오. 합병증은 늑간 근육에 심혼을 휴식에서 생길 수 있습니다. 따라서 LAD의 명확한 시각화 및 접근성을 허용하기 위해 무딘 해부를 수평 방향으로 최소한의 크기로 유지하는 것이 중요합니다.피상적 결찰은 최종 봉합사 배치에서 조정할 여지가 적고 LAD 주변의 봉합사가 제어된 꾸준한 움직임으로 수행되어야 합니다. 클리어링 단계가 끝날 때까지 심장 전체가 중앙에 변색없이 일관되게 불투명해야합니다. 실온에서 RIMS 용액에서 며칠 후, 심장은 완전히 지워야하며 일부 조직 확장을 관찰 할 수 있습니다.tdTomato 리포터 단백질 발현에 의해 관찰된 바와 같이, 심장 신경은 주로 상고층에 거주하는 일부 인구와 피상적이다. 중요한 것은, 리포터 단백질 발현 확인은 입증된 바와 같이 선명도 프로토콜을 받은 후에 보존된다. 3D 심장을 지우고 이미징하면 심장 세포 집단의 위치와 형태에 대한 관점을 제공합니다.이것은 우리가 세포 패터닝 및 세포 세포 상호 작용에 있는 새로운 양상을 확인하는 것을 허용합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

연구

발생학

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Myh6 발기인 - 선택과 함께 ES-세포 프로그래밍을 바탕으로 설치류 심장 페이스 메이커 세포 집합체의 생성

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

3 차원 선 동적인 인간 조직 Gingiva 등가물

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 Organotypic 문화

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...