Name: capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Finansieringen av dette prosjektet ble gitt av UW School of Medicine and Public Health fra Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), og en American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).

Alle eksperimenter ble utført i samsvar med Guide for bruk og omsorg for laboratoriedyr og i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee i School of Medicine and Public Health ved University of Wisconsin-Madison. Alle metoder ble utført på vill type C57BL/6J (B6) og transgene muselinjer hentet fra Jackson Laboratories.
1. Koronararterie okklusjon (hjerteinfarkt) Indusert via Ligation av venstre anterior synkende arterie (LAD) i 1-dagers gamle neonatal mus6<...

<ol>
	<li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Kikuchi, K., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regenerative+capacity+and+mechanisms.">Cardiac regenerative capacity and mechanisms.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Savarese, G., Lund, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Public+Health+Burden+of+Heart+Failure.">Global Public Health Burden of Heart Failure.</a> Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice.">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).</li><li>Karwowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+infarct+artery+location,+acute+total+coronary+occlusion,+and+mortality+in+STEMI+and+NSTEMI+patients.">Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients.</a> Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).</li><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).</li><li>MAGGIC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survival+of+patients+with+heart+failure+with+preserved+or+reduced+left+ventricular+ejection+fraction:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis.</a> European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).</li><li>Notari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+local+microenvironment+limits+the+regenerative+potential+of+the+mouse+neonatal+heart.">The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart.</a> Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neonatal+and+adult+mammalian+heart+regeneration+by+the+miR-15+family.">Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Collateral+Artery+Development+Program+Promotes+Neonatal+Heart+Regeneration.">A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration.</a> Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+neonatal+cardiac+extracellular+matrix+prevents+widespread+ventricular+remodeling+in+adult+mammals+after+myocardial+infarction.">Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction.</a> Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).</li><li>Mahmoud, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+Regulate+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration.">Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).</li><li>Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+lineage+tracing+methods+and+intestinal+tumors.">Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.</a> Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Phillips, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum:+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease.">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Scientific Reports. 6, 26013 (2016).</li><li>Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+in+Neonatal+Mice,+A+Model+of+Cardiac+Regeneration.">Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).</li><li>Sereti, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+clonal+expansion+during+mouse+heart+development+and+injury.">Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).</li><li>Lepilina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration.">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127 (3), 607-619 (2006).</li><li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair.">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li><li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li></ol>

Cellecelleinteraksjoner mellom kardiomyocytter og ikke-myocytter populasjoner er en avgjørende faktor for om hjertet vil gjennomgå fibrose eller reparere etter skade. Funn har blitt gjort som viser at en rekke celletyper, inkludert nerver14, epikardiale celler24, peritoneal makrofager25, arterioler12,13, og lymfatiske endotelceller26, alle spiller en viktig rolle i ?...

Hjertet har lenge vært ansett for å være et post-mitotisk organ, men nyere bevis viser at kardiomyocytter fornyelse forekommer i voksen menneskelig hjerte på ca 1% per år1. Imidlertid er disse lave frekvensene av kardiomycyttomsetning utilstrekkelig til å fylle det massive tapet av vev som oppstår etter skade. Et hjerte som har lidd en hjerteinfarkt vil miste rundt en milliard kardiomyocytter, ofte fungerer som et forspill til hjertesvikt og plutselig hjertedød2,3. Med over 26 millioner mennesker rammet av hjertesvikt over hele verden, er det et udekket behov for terapeutiske midler som kan reversere skadene påført av hjertesykdom4.
For å bygge bro over dette gapet i terapeutiske midler, har forskere begynt å undersøke evolusjonært bevarte mekanismer som ligger til grunn for endogen regenerering etter skade. En modell for å studere pattedyr hjerteregenerering er neonatal musen. I løpet av uken etter fødselen har nyfødte mus en robust regenerativ respons etter hjerteskade5. Vi har tidligere vist at neonatalmus kan regenerere sitt hjerte via kardiomycyttspredning etter en apikal reseksjon5. Selv om denne teknikken kan fremkalle hjerteregenerering i nyfødte, mangler operasjonen klinisk relevans for menneskelige hjerteskader. For å etterligne en menneskelig skade i neonatal musemodell, har vi utviklet en teknikk for å indusere et hjerteinfarkt gjennom en koronarokklusjon6. Denne teknikken krever kirurgisk ligation av venstre geerior synkende arterie (LAD), som er ansvarlig for å levere 40%-50% av blodet til venstre ventrikulær myokardiet6,7. Dermed resulterer operasjonen i en infarkt som påvirker en betydelig del av venstre ventrikulær vegg. Denne skaden på myokardiet vil stimulere kardiomycytt spredning og hjerte regenerering i nyfødte5.
Koronararterienokklusjonkirurgi gir en svært reproduserbar og direkte translasjonell metode for å avdekke den indre driften av hjerteregenerering. Neonatal kirurgi paralleller koronar aterosklerose i det menneskelige hjerte, hvor akkumulering av plakk innenfor de indre veggene i arteriene kan forårsake en okklusjon og påfølgende hjerteinfarkt8. På grunn av et tomrom i terapeutiske behandlinger for hjertesviktpasienter, er en okklusjon i LAD forbundet med dødelighet som når opp til 26% innen et år etter skade9, og følgelig har blitt kalt "enkemakeren". Fremskritt i terapeutiske midler krever en modell som nøyaktig gjenspeiler de komplekse fysiologiske og patologiske effektene av hjerteskade. Vår kirurgiske protokoll for neonatal mus hjerteskade gir en plattform som gjør det mulig for forskere å undersøke molekylære og cellulære signaler som signaliserer pattedyr hjerteregenerering etter skade.
Nyere forskning fremhever det dynamiske forholdet mellom det ekstracellulære miljøet og prolifererende kardiomyocytter. For eksempel kan det postnatale regenerative vinduet forlenges ved å redusere stivheten til den ekstracellulære matrisen rundt hjertet10. Biomaterialer fra neonatal extracellulær matrise kan også fremme hjerteregenerering hos voksne pattedyrhjerter etter hjerteskade11. Også medkardiomyocytter proliferasjon er en angiogen respons12,13; sikkerhet arterie dannelse unik for regenererende hjertet av neonatal musen ble vist å være avgjørende for å stimulere hjerte regenerering12. Videre har vårt laboratorium vist at nervesignalering regulerer kardiomycyttspredning og hjerteregenerering via modulering av vekstfaktornivåer, samt den inflammatoriske responsen etter skade14. Disse funnene understreker behovet for å spore ikke-myocytter cellepopulasjoner som svar på hjerteskade. For å oppnå dette målet har vi benyttet oss av Cre-lox rekombinasjonssystemet i transgene muslinjer for å innlemme konstitutivt eller betinget uttrykk for fluorescerende reporterproteiner for avstamningssporing. Videre kan vi bruke avanserte metoder for å bestemme klonal ekspansjonsmønster med Rainbow-muselinjen, som er avhengig av stokastisk uttrykk for de Cre-avhengige, multifargede fluorescerende journalistene for å bestemme klonal utvidelse av målrettede cellepopulasjoner15. Å bruke avstamning sporing med neonatal koronar okklusjon kirurgi er et kraftig verktøy for dissekering intrikate cellulære mekanismer for hjerteregenerering.
Sporing av avstamning av fluorescerende merkede celler med tredimensjonale (3D) hele organavbildning er vanskelig å oppnå ved hjelp av tradisjonell snitting og rekonstruksjonsteknikk – spesielt når cellepopulasjoner er skjøre, for eksempel nervefibre eller blodkar. Mens direkte hele mount avbildning av orgelet ved optisk snitting kan fange overfladiske cellepopulasjoner, strukturer som bor dypt inne i vevet forblir utilgjengelig. For å omgå disse barrierene, vev clearing teknikker har blitt utviklet for å redusere opasitet av hele organvev. Nylig har det blitt gjort betydelige fremskritt for å fjerne lipid-utvekslet akrylamid-hybridisert Rigid Imaging kompatibel Tissue hYdrogel (CLARITY)-baserte metoder, som fjerner fast vev via lipid utvinning16. Det iverksettes også tiltak for å homogenisere brytningsindeksen og deretter redusere lysspredning mens bildebehandling17. En slik metode er aktiv CLARITY, som fremskynder lipidnedbrytning ved hjelp av elektroforese for å trenge inn i vaskemiddelet gjennom hele vevet18. Selv om effektiv, krever denne vevsfjerningsmetoden dyrt utstyr og kan forårsake vevsskade, noe som gjør tilnærmingen uforenlig med skjøre cellepopulasjoner som hjertenervene19. Dermed bruker vi den passive CLARITY-tilnærmingen, som er avhengig av varme for å forsiktig lette vaskemiddelpenetrasjon, og hjelper derfor til oppbevaring av intrikate cellestrukturer20,,21.
Passiv KLARHET er vanligvis antatt å være mindre effektiv enn aktiv CLARITY18, da teknikken ofte ledsages av to store hindringer: manglende evne til å fjerne hele organdybden og den omfattende tiden som kreves for å fjerne voksent vev. Vår passive CLARITY-tilnærming overvinner begge disse barrierene med en fremskyndet clearingprosess som er i stand til å fullstendig rydde neonatal og voksent hjertevev. Vår passive CLARITY vevingsteknikk har nådd en effektivitet som tillater visualisering av en rekke hjertecellepopulasjoner, inkludert sjeldne populasjoner distribuert over hele det voksne hjertet. Når det ryddet hjertet er avbildet med konfokal mikroskopi, kan arkitekturen av cellespesifikk mønster under utvikling, sykdom og regenerering belyses.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-thioglycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Prolene Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8889H</td>
			<td>Polypropylene Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16-050-146</td>
			<td>Half Curved, Serrated, 4 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-812-39</td>
			<td>Dissecting, 4.5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vial</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-339-26A</td>
			<td>12 x 35 mm Vial with Cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>2 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td>Straight, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-966</td>
			<td>Mayo-Hegar, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Forceps</td>
			<td>Sigma-Adrich</td>
			<td>Z168777</td>
			<td>Fine Tip, Straight, 4.25 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Dissecting Scissor</td>
			<td>Walter Stern Inc</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>30 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16050133</td>
			<td>Medium Tissue, 1X2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>Water-soluble azo initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging

Kardiovaskulær sykdom overgår alle andre dødsårsaker og er ansvarlig for svimlende 31% av dødeligheten over hele verden. Denne sykdommen manifesterer seg i hjerteskade, hovedsakelig i form av akutt hjerteinfarkt. Med liten motstandskraft etter skade, vil det en gang friske hjertevevet bli erstattet av fibrøse, ikke-kontraktile arrvev og ofte være et forspill til hjertesvikt. For å identifisere nye behandlingsalternativer i regenerativ medisin, har forskning fokusert på virveldyr med medfødte regenerative evner. En slik modell organisme er neonatal mus, som reagerer på hjerteskade med robust hjerteinfarkt regenerering. For å indusere en skade i neonatal mus som er klinisk relevant, har vi utviklet en operasjon for å okkta venstre fremre synkende arterie (LAD), speiling en hjerteinfarkt utløst av aterosklerose i det menneskelige hjerte. Når matchet med teknologien for å spore endringer både innen kardiomyocytter og ikke-myocytter populasjoner, gir denne modellen oss en plattform for å identifisere mekanismene som styrer hjerteregenerering. Få innsikt i endringer i hjertecellepopulasjoner etter skade en gang var sterkt avhengig av metoder som vevssnitting og histologisk undersøkelse, som er begrenset til todimensjonal analyse og ofte skader vevet i prosessen. Videre mangler disse metodene muligheten til å spore endringer i cellelinjer, i stedet gir bare et øyeblikksbilde av skaderesponsen. Her beskriver vi hvordan teknologisk avanserte metoder i avstamningssporingsmodeller, hele organrydding og tredimensjonal (3D) helmontert mikroskopi kan brukes til å belyse mekanismer for hjertereparasjon. Med vår protokoll for neonatal mus hjerteinfarkt kirurgi, vev clearing, og 3D hele organ imaging, de komplekse veier som induserer kardiomyocyte spredning kan raknes, avsløre nye terapeutiske mål for hjerte regenerering.

Ofte styrer de to mest utfordrende trinnene hjertet ut av brysthulen og ligating LAD. For å feilsøke disse trinnene, kan justeringer gjøres i plassering av den første punkteringen mellom de fjerde interkostale musklene; hvis punktering og sløv disseksjon er for nær i nærheten av brystbenet, kan hjertet ikke være i stand til å gå ut av brysthulen (Figur 1A).
I tillegg kan økt trykk på venstre underliv være nødvendig for å lette denne...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Kardiomycyttspredning etter skade er en dynamisk prosess som krever en symfoni av ekstracellulære signaler fra ikke-myocyttercellepopulasjoner. Ved hjelp av avstamningssporing, passiv CLARITY og tredimensjonale helmonteringskonfokalmikroskopiteknikker kan vi analysere påvirkningen av en rekke celletyper på hjertereparasjon og regenerering.

Fange hjerteskaderesponsen til målrettede cellepopulasjoner via ryddet hjerte tredimensjonal avbildning

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Den endogene hjerteregenerering er en dynamisk prosess som involverer flere celletyper som arbeider sammen sammen for å montere en robust regenerativ respons. Peering inn i regenererende vev via 3D-avbildning av det ryddet hjertet som svar på skade kan hjelpe i rekonstruksjon av cellulær dynamikk som guider denne hjerte regenerative responsen. Vår protokoll er spesielt utviklet for å spore celler under utvikling og regenerering.Vi forutser ingen begrensninger i å bruke våre clearing-, fargings- og bildeteknikker på andre organtyper. For LAD-indusert koronarkalen okklusjon, først sterilisere kirurgisk område av en bedøvet en dag gammel neonatal valp med antiseptisk løsning. Lag et tverrgående hud snitt i brystområdet.For å skille huden fra muskelen, bruk et par dressing tang for å løfte huden forsiktig mens du forsiktig presser saksen mot interkostalrommuskulaturen i lukket stilling. Finn det fjerde interkostalrom og bruk små tang for å lage en liten overfladisk punktering som tar vare på å unngå de indre organene. Ved hjelp av sløv disseksjon og dressing tang, utvide området mellom interkostalrommuskulaturen bare til en finger kan påføres på venstre side av magen mens du holder interkostalrom åpent med dressing tang for å forsiktig lede hjertet ut av brysthulen.Når hjertet er ekstrahert, la hjertet hvile på interkostalrommuskulaturen og lokalisere LAD som hjertets region med mindre samlet blod. For å indusere hjerteinfarkt, bruk en 6-0-sutur for å knytte en firkantet knute tett rundt fartøyet to ganger uten å kutte arterien. Blanching på toppunktet bør observeres umiddelbart.Det er viktig å være konsekvent på suturplasseringen langs LAD for en lignende infarktstørrelse. Dette oppnås best ved å få tilgang til hjertet raskt mens blodet fortsatt strømmer gjennom arteriene. Når suturen er plassert, la hjertet gli tilbake i brysthulen.Sutur ribbeina sammen med en kirurg og en firkantet knute ved hjelp av stumpe tang for å løfte det øvre settet med ribber mens du passerer en 6-0 sutur gjennom øvre og nedre sett med ribber. Påfør et lite volum av hudlim på overlivet og bruk fine tang for å plassere huden på underlivet over den eksponerte brystregionen. Plasser deretter valpen på en varmepute og utfør ligation på neste dyr.Når alle operasjonene er utført, returnerer du de varme og mobile valpene til morens hjemmebur. For passiv klarhet i det høstede hjertevevet, 21 dager postsurgery etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemme, plasser musen på et rent kirurgisk område i liggende stilling og fest lemmer med tape. Ved hjelp av vevs tang, ta tak i pelsen like under xiphoid prosessen og gjøre et snitt som strekker seg over bredden av brystkassen.Klipp sammen med de distale delene av brystkassen og bruk tangen til å løfte xiphoidprosessen for å eksponere membranen. Løsne membranen med buede tang og trekk vevet kranielt til det bankende hjertet er tilgjengelig. Bruk de buede tangene til å gripe hjertet ved basen og bruk iridektomisaks til å kutte aorta og overlegen vena cava.Legg det bankende hjertet i en petriskål av PBS slik at hjertet pumper ut noe beholdt blod. Hjerteinfarktet kan bekreftes ved en korrekt anatomisk plassering av LAD-ligationen. Når hjertet slutter å slå, klem forsiktig orgelet med tang for å utvise gjenværende blod og overføre prøven til et engangs 2,5 milliliter hetteglass med glassskall som inneholder to milliliter PBS.Plasser hetteglasset på en shaker i minst 30 minutter ved romtemperatur og endre PBS-oppløsningen hvert 10. Når PBS er klar, skift PBS med to milliliter kald 4% paraformaldehyd i en fire timers inkubasjon ved romtemperatur etterfulgt av tre 10-minutters vasker på shakeren med to milliliter frisk PBS per vask. Etter siste vask, fyll hetteglasset med to milliliter på 4% akrylamid supplert med 0,5% VA-044 løsning for en overnatting inkubasjon ved fire grader Celsius.Neste dag, plasser hetteglasset i en 37 grader Celsius varmeblokk i tre timer. På slutten av polymeriseringen, overfør hjertet til et nytt hetteglass med glassskall og vask hjertevevet i to milliliter frisk PBS 10 minutter om gangen forfriskende PBS på slutten av hver inkubasjon. Når PBS er klar, skift ut vaskebufferen med to milliliter av ryddeløsning.Inkuber prøven ved 37 grader Celsius i flere uker til hjertet er klart, forfriskende ryddeløsningen hver to til tre dager. Når orgelet er klart, vask prøven med PBS på shakeren som vist før du fyller hetteglasset med frisk PBS for en 24-timers inkubasjon ved 37 grader Celsius. Neste dag erstatter du PBS med RIMS for en 24-timers inkubasjon ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen er vevet helt ryddet. Vevet skal bli gjennomsiktig etter flere uker. For avbildning av det ryddet postnatale musehjertet etter hjerteinfarktinduksjon, fyll halvparten av et kammer av en skreddersydd depresjonssklie med PBS og bruk buede tang for å forsiktig overføre det ryddet hjertet inn i kammeret.Fyll det gjenværende volumet av kammeret med PBS. Fyll deretter kammeret med PBS til overflaten av væsken danner en kuppel over toppen av kammeret og monterer dekselet lysbilde før avbildning vevet ved konfokal mikroskopi i henhold til standard bildeprotokoller. Hvis punkteringen og den stumpe disseksjonen er for nær i nærheten av brystbenet, kan det hende at hjertet ikke kan gå ut av brysthulen.Hvis hjertet ikke lett går ut av hulrommet, bruk trykk på venstre mage for å lette prosessen. Komplikasjoner kan oppstå ved å hvile hjertet på interkostalrommuskulaturen. Derfor er det viktig å holde den stumpe disseksjonen til en minimal størrelse i horisontal retning for å tillate en klar visualisering og tilgjengelighet av LAD.Merk at en overfladisk ligation vil ha mindre rom for justering i den endelige suturplasseringen, og at suturen rundt LAD skal utføres med kontrollerte jevnbevegelser. Ved slutten av clearing trinn, hele hjertet bør være konsekvent ugjennomsiktig uten misfarging i midten. Etter noen dager i RIMS løsning ved romtemperatur, bør hjertet være helt ryddet og noen vevsutvidelse kan observeres.Som observert av tdTomato reporter protein uttrykk, hjertenervene er hovedsakelig overfladisk med noen populasjoner bosatt i epicardial laget. Viktigere, reporter protein uttrykk bekreftelse er bevart etter å ha gjennomgått klarhet protokollen som demonstrert. Rydding og bildebehandling av 3D-hjertet gir perspektiv inn i plasseringen og morfologien til hjertecellepopulasjoner.Dette gjør det mulig for oss å identifisere nye aspekter i cellemønster og cellecelleinteraksjoner.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differensiering av Human Neural Stem Cell Line on tredimensjonal kulturer, Analyse av mikroRNA og Antatte målgener

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Generasjon av murine pacemaker Cell Aggregater Basert på ES-Cell-programmering i kombinasjon med Myh6-arrangøren-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Analyse av blodcellepopulasjoner i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Isolering av perivaskulær multipotente forløpercelle populasjoner fra humane kardiale Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Diagnostikk klarert Embryonic og barsel hjerter på Single-celle Oppløsning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal helmontering: En romanbehandlings- og bildeprotokoll for tykke, tredimensjonale vev Tverrsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tredimensjonal gjengivelse og analyse av Immunolabeled, avklart menneskelige Placental Villous vaskulære nettverk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Tredimensjonale inflammatorisk menneskelig vev ekvivalenter av Gingiva

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Tredimensjonale Organotypic kulturer av Vestibular og auditiv Sanseorganer

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...