Name: capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Finansiering för detta projekt tillhandahölls av UW School of Medicine and Public Health från Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), och en American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).

Alla experiment utfördes i enlighet med guiden för användning och vård av försöksdjur och i enlighet med kommittén för institutionsvård och användning vid School of Medicine and Public Health vid University of Wisconsin-Madison. Alla metoder utfördes på vild typ C57BL/6J (B6) och transgena muslinjer som erhållits från Jackson Laboratories.
1. Födans gatan ocklusion (hjärtinfarkt) inducerad via ligring av vänster främre fallande artär (LAD) i 1-dagars gamla neonatal möss<sup c...

<ol>
	<li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Kikuchi, K., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regenerative+capacity+and+mechanisms.">Cardiac regenerative capacity and mechanisms.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Savarese, G., Lund, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Public+Health+Burden+of+Heart+Failure.">Global Public Health Burden of Heart Failure.</a> Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice.">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).</li><li>Karwowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+infarct+artery+location,+acute+total+coronary+occlusion,+and+mortality+in+STEMI+and+NSTEMI+patients.">Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients.</a> Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).</li><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).</li><li>MAGGIC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survival+of+patients+with+heart+failure+with+preserved+or+reduced+left+ventricular+ejection+fraction:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis.</a> European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).</li><li>Notari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+local+microenvironment+limits+the+regenerative+potential+of+the+mouse+neonatal+heart.">The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart.</a> Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neonatal+and+adult+mammalian+heart+regeneration+by+the+miR-15+family.">Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Collateral+Artery+Development+Program+Promotes+Neonatal+Heart+Regeneration.">A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration.</a> Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+neonatal+cardiac+extracellular+matrix+prevents+widespread+ventricular+remodeling+in+adult+mammals+after+myocardial+infarction.">Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction.</a> Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).</li><li>Mahmoud, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+Regulate+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration.">Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).</li><li>Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+lineage+tracing+methods+and+intestinal+tumors.">Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.</a> Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Phillips, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum:+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease.">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Scientific Reports. 6, 26013 (2016).</li><li>Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+in+Neonatal+Mice,+A+Model+of+Cardiac+Regeneration.">Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).</li><li>Sereti, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+clonal+expansion+during+mouse+heart+development+and+injury.">Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).</li><li>Lepilina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration.">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127 (3), 607-619 (2006).</li><li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair.">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li><li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li></ol>

Cell-cell interaktioner mellan kardiomyocyter och icke-myocyte populationer är en avgörande faktor för om hjärtat kommer att genomgå fibros eller reparation efter skada. Upptäckter har gjorts visar att en mängd olika celltyper, inklusive nerver14, epicardial celler24, peritoneal makrofager25, arterioles12,13, och lymfatiska endotelceller26, alla spelar en viktig...

Hjärtat har länge ansetts vara ett postmitotiska organ, men de senaste bevisen visar att kardiomyocyte förnyelse sker i den vuxna mänskliga hjärtat på ca 1% per år1. Emellertid, dessa låga nivåer av kardiomyocyte omsättning är otillräckliga för att fylla på den massiva förlust av vävnad som uppstår efter skada. Ett hjärta som har drabbats av en hjärtinfarkt kommer att förlora cirka en miljard kardiomyocyter, ofta fungerar som ett förspel till hjärtsvikt och plötslig hjärtdöd2,3. Med över 26 miljoner människor som drabbats av hjärtsvikt över hela världen, det finns ett otillfredsställt behov av terapier som kan vända de skador som orsakats av hjärtsjukdom4.
För att överbrygga denna klyfta i therapeutics, forskare har börjat undersöka evolutionärt bevarade mekanismer som ligger bakom endogen ageneration efter skada. En modell för att studera däggdjur hjärt förnyelse är neonatal musen. Inom veckan efter födseln, neonatal möss har en robust regenerativ respons efter hjärtskador5. Vi har tidigare visat att neonatal möss kan regenerera sitt hjärta via kardiomyocyt spridning efter en apikal samband5. Även om denna teknik kan framkalla hjärtförnyelse hos nyfödda, saknar operationen klinisk relevans för mänskliga hjärtskador. För att efterlikna en mänsklig skada i neonatal mus modell, har vi utvecklat en teknik för att inducera en hjärtinfarkt genom en kranskärl ocklusion6. Denna teknik kräver kirurgisk ligation av den vänstra främre fallande artär (LAD), som ansvarar för att leverera 40%-50% av blodet till vänster Ventrikulärt hjärtmuskeln6,7. Således resulterar operationen i en infarct som påverkar en betydande del av den vänstra Ventrikulärt väggen. Denna skada på hjärtmuskeln kommer att stimulera kardiomyocyt spridning och hjärtförnyelse hos nyfödda5.
Den kranskärlocklusion kirurgi ger en mycket reproducerbar och direkt translationell metod för att avslöja det inre arbetet i hjärt förnyelse. Neonatal kirurgi paralleller kranskärlsförkalkning i det mänskliga hjärtat, där ansamling av plack inom de inre väggarna i artärerna kan orsaka en ocklusion och efterföljande hjärtinfarkt8. På grund av ett tomrum i terapeutiska behandlingar för hjärtsvikt patienter, en ocklusion i LAD är associerad med dödligheten når upp till 26% inom ett år efter skada9, och följaktligen har kallats "änka maker." Framsteg i therapeutics kräver en modell som exakt återspeglar de komplexa fysiologiska och patologiska effekterna av hjärtskada. Vårt kirurgiska protokoll för neonatal mus hjärtskada ger en plattform som gör det möjligt för forskare att undersöka molekylära och cellulära ledtrådar som signalerar däggdjur hjärtförnyelse efter skada.
Ny forskning belyser det dynamiska förhållandet mellan den extracellulära miljön och prolifererande kardiomyocyter. Till exempel kan det postnatala regenerativa fönstret förlängas genom att minska styvheten i den extracellulära matrisen som omger hjärtat10. Biomaterial från neonatal extracellulär matris kan också främja hjärtförnyelse i vuxna däggdjurshjärtan efter hjärtskada11. Också medföljande kardiomyocyte spridning är en angiogenic svar12,13; säkerheter artär bildning unik för regenererande hjärtat av neonatal musen visade sig vara avgörande för att stimulera hjärt förnyelse12. Dessutom har vårt labb visat att nervsignalering reglerar kardiomyocyte spridning och hjärtförnyelse via modulering av tillväxtfaktornivåer, samt den inflammatoriska svar efter skada14. Dessa resultat betonar behovet av att spåra icke-myocyte cellpopulationer som svar på hjärtskada. För att uppnå detta mål har vi utnyttjat Cre-lox rekombinationssystem i transgena möss linjer för att införliva konstituerande eller villkorligt uttryck för fluorescerande reporter proteiner för härstamning spårning. Dessutom kan vi använda avancerade metoder för att bestämma klonal expansion mönster med Rainbow muslinjen, som bygger på stokastiska uttryck för Cre-beroende, multi-color fluorescerande reportrar för att bestämma klonal expansion av riktade cellpopulationer15. Använda härstamning spårning med neonatal kranskärl ocklusion kirurgi är ett kraftfullt verktyg för att dissekera intrikata cellulära mekanismer för hjärt förnyelse.
Spåra härstamning av fluorescerande märkta celler med tredimensionella (3D) hela organ avbildning är svårt att uppnå med hjälp av traditionella snittning och återuppbyggnad teknik - särskilt när cellpopulationer är bräckliga, såsom nervfibrer eller blodkärl. Medan direkt helmonterad avbildning av organet genom optisk snittning kan fånga ytliga cellpopulationer, strukturer som bor djupt inne i vävnaden förblir otillgängliga. För att kringgå dessa hinder har vävnadsröjningstekniker utvecklats för att minska opaciteten hos hela organvävnader. Nyligen har betydande framsteg gjorts för att rensa Lipid-utbytte Akrylamid-hybridiserade Rigid Imaging kompatibla Vävnad hYdrogel (CLARITY)-baserade metoder, som rensar fast vävnad via lipidextraktion16. Åtgärder vidtas också för att homogenisera brytningsindexet och därefter minska ljusspridning medan bildbehandling17. En sådan metod är aktiv KLARHET, som påskyndar lipidnedbrytning med hjälp av elektrofores för att penetrera tvättmedlet i hela vävnaden18. Även effektiv, denna vävnad clearingmetod kräver dyr utrustning och kan orsaka vävnadsskador, vilket gör tillvägagångssättet oförenligt med bräckliga cellpopulationer såsom hjärt nerver19. Därför använder vi passiv CLARITY-metoden, som är beroende av värme för att försiktigt underlätta tvättmedelspenetration, och därför medhjälp till att behålla invecklade cellstrukturer20,,21.
Passiv klarhet anses vanligtvis vara mindre effektiv än aktiv CLARITY18, eftersom tekniken ofta åtföljs av två stora hinder: oförmågan att rensa hela organdjupet och den omfattande tid som krävs för att rensa vuxna vävnader. Vår passiva CLARITY strategi övervinner båda dessa hinder med en expeditated clearing process som kan helt rensa neonatal och vuxna hjärtvävnad. Vår passiva CLARITY vävnad clearing teknik har nått en effektivitet som tillåter visualisering av en mängd olika hjärtcell populationer, inklusive sällsynta populationer distribueras i hela det vuxna hjärtat. När det rensade hjärtat avbildars med konfokal mikroskopi kan arkitekturen för cellspecifik mönsterunder utveckling, sjukdom och regenerering belysas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-thioglycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Prolene Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8889H</td>
			<td>Polypropylene Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16-050-146</td>
			<td>Half Curved, Serrated, 4 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-812-39</td>
			<td>Dissecting, 4.5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vial</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-339-26A</td>
			<td>12 x 35 mm Vial with Cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>2 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td>Straight, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-966</td>
			<td>Mayo-Hegar, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Forceps</td>
			<td>Sigma-Adrich</td>
			<td>Z168777</td>
			<td>Fine Tip, Straight, 4.25 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Dissecting Scissor</td>
			<td>Walter Stern Inc</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>30 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16050133</td>
			<td>Medium Tissue, 1X2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>Water-soluble azo initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging

Hjärt-kärlsjukdom överträffar alla andra dödsorsaker och är ansvarig för en svindlande 31% av dödligheten i världen. Denna sjukdom manifesterar sig i hjärtskada, främst i form av en akut hjärtinfarkt. Med lite motståndskraft efter skada, en gång frisk hjärtvävnad kommer att ersättas av fibrösa, icke-kontraktila ärrvävnad och ofta vara ett förspel till hjärtsvikt. För att identifiera nya behandlingsalternativ inom regenerativ medicin har forskningen fokuserat på ryggradsdjur med medfödd regenerativ förmåga. En sådan modell organism är neonatal musen, som svarar på hjärtskada med robust hjärtinfarkt förnyelse. För att framkalla en skada i neonatal musen som är kliniskt relevant, har vi utvecklat en operation för att ocklude den vänstra främre fallande artär (LAD), speglar en hjärtinfarkt utlöses av åderförkalkning i det mänskliga hjärtat. När matchas med tekniken för att spåra förändringar både inom kardiomyocyter och icke-myocyter populationer, ger denna modell oss en plattform för att identifiera de mekanismer som styr hjärtförnyelse. Få insikt i förändringar i hjärtcell populationer efter skada en gång förlitat sig starkt på metoder såsom vävnad snittning och histologisk undersökning, som är begränsade till tvådimensionell analys och ofta skada vävnaden i processen. Dessutom saknar dessa metoder förmågan att spåra förändringar i celllinjer, i stället ger bara en ögonblicksbild av skadesvaret. Här beskriver vi hur tekniskt avancerade metoder i härstamningsspårningsmodeller, hela organröjning och tredimensionell (3D) helmonterad mikroskopi kan användas för att belysa mekanismer för hjärtreparation. Med vårt protokoll för neonatal mus hjärtinfarkt kirurgi, vävnad clearing, och 3D hela organ imaging, de komplexa vägar som inducerar kardiomyocyt spridning kan redas ut, avslöjar nya terapeutiska mål för hjärt förnyelse.

Ofta de två mest utmanande stegen är att styra hjärtat ur brösthålan och ligating LAD. För att felsöka dessa steg kan justeringar göras vid placeringen av den första punkteringen mellan de fjärde interkostnadsmusklerna; Om punkteringen och trubbigdissektionen är för nära i närheten av bröstbenet, kanske hjärtat inte kan lämna brösthålan (figur 1A).
Dessutom kan ökat tryck på vänster buk behövas för att underlätta denna pro...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiomyocyte spridning efter skada är en dynamisk process som kräver en symfoni av extracellulära ledtrådar från icke-myocyte cellpopulationer. Med hjälp av härstamning spårning, passiv KLARHET, och tredimensionella helmonterade confocal mikroskopi tekniker, kan vi analysera påverkan av en mängd olika celltyper på hjärt reparation och förnyelse.

Fånga hjärtskada svar av riktade cellpopulationer via rensat hjärta tredimensionell imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Den endogena hjärtregenereringen är en dynamisk process som involverar flera celltyper som arbetar tillsammans i samförstånd för att montera ett robust regenerativt svar. Peering in i regenererande vävnad via 3D-avbildning av rensat hjärta som svar på skada kan stöd i återuppbyggnaden av den cellulära dynamiken som styr denna hjärt regenerativ svar. Vårt protokoll är särskilt utformat för att spåra celler under utveckling och regenerering.Vi förutser inga begränsningar i att i stort sett tillämpa våra clearing, färgning och avbildning tekniker för andra organtyper. För LAD-inducerad födans gatan ocklusion, sterilisera först det kirurgiska området för en sövd en dag gammal neonatal pup med antiseptisk lösning. Gör en tvärgående hud snitt i bröstet regionen.För att separera huden från muskeln, använd ett par dressing-forceps för att lyfta huden försiktigt medan du försiktigt trycker på saxen mot interkosamuskulaturen i stängt läge. Lokalisera den fjärde intercostal utrymme och använda små tycer för att göra en liten ytlig punktering ta hand för att undvika de inre organen. Med hjälp av trubbig dissektion och förbandstofsen vid vida området mellan interkosamuskulaturen bara tills en finger kan appliceras på bukens vänstra sida samtidigt som det interkostala utrymmet håller öppet med förbandstärkningar för att försiktigt styra hjärtat ut ur brösthålan.När hjärtat har extraherats, låt hjärtat vila på intercostal muskler och lokalisera LAD som regionen i hjärtat med mindre poolat blod. För att framkalla hjärtinfarkt, använd en 6-0 sutur för att binda en fyrkantig knut tätt runt kärlet två gånger utan att bryta artären. Blanchering vid apexet ska observeras omedelbart.Det är viktigt att vara konsekvent på suturplaceringen längs LAD för en liknande infarct storlek. Detta uppnås bäst genom att komma åt hjärtat snabbt medan blodet fortfarande flyter genom artärerna. När suturen har placerats, låt hjärtat glida tillbaka in i brösthålan.Suturera revbenen tillsammans med en kirurg och en kvadratisk knut med hjälp av trubbiga täntstor för att lyfta den övre uppsättningen revben medan de passerar en 6-0 sutur genom den övre och nedre uppsättningen revben. Applicera en liten volym hudlim på övre delen av buken och använd fina tänjas för att placera huden på nedre delen av buken över den utsatta bröstregionen. Placera sedan valpen på en värmedyna och utför ligeringen på nästa djur.När alla operationer har utförts, returnera de varma och mobila valparna till moderns hembur. För passiv klarhet av den skördade hjärtvävnaden, 21 dagar postsurgery efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa, placera musen på en ren kirurgiskt område i ryggläge och säkra lemmar med tejp. Med hjälp av vävnadstofs, ta tag i pälsen strax under den xiphoid processen och göra ett snitt som spänner över bredden på bröstkorgen.Skär längs de distala delarna av bröstkorgen och använd tärnorna för att lyfta xiphoidprocessen för att exponera membranet. Lösgör membranet med böjda tlyck och dra vävnaden kraniellt tills det bultande hjärtat är åtkomligt. Använd böjda tövövorna för att greppa hjärtat vid basen och använd iridectomy sax för att skära aorta och överlägsen vena cava.Placera det bultande hjärtat i en petriskål av PBS så att hjärtat pumpar ut något kvarhållet blod. Den hjärtinfarkt kan bekräftas genom en korrekt anatomisk placering av LAD ligering. När hjärtat slutar slå, försiktigt pressa organet med tlymp för att driva ut kvarvarande blod och överföra exemplaret i en disponibel 2,5 milliliter glas skal injektionsflaska som innehåller två milliliter PBS.Placera injektionsflaskan på en skaktörst i minst 30 minuter vid rumstemperatur om du ändrar PBS-lösningen var 10:e minut tills lösningen förblir klar från blod. När PBS är klar, ersätt PBS med två milliliter kall 4%paraformaldehyd för en fyra timmars inkubation vid rumstemperatur följt av tre 10-minuters tvättar på shaker med två milliliter färsk PBS per tvätt. Efter den sista tvätten fyller du injektionsflaskan med två milliliter 4%akrylamid kompletterad med 0,5%VA-044 lösning för en övernattningsinkubation vid fyra grader Celsius.Nästa dag, placera injektionsflaskan i en 37 grader Celsius värmeblock i tre timmar. I slutet av polymerisationen, överföra hjärtat till en ny glasskal injektionsflaska och tvätta hjärtvävnaden i två milliliter av färska PBS 10 minuter i taget uppfriskande PBS i slutet av varje inkubation. När PBS är klar, byt tvättbufferten med två milliliter av clearinglösning.Inkubera exemplaret vid 37 grader Celsius i flera veckor tills hjärtat är klart, uppfriskande clearinglösningen varannan till var tredje dag. När orgeln är klar, tvätta provet med PBS på skakmaskinen som visas innan du fyller på injektionsflaskan med färsk PBS för en 24-timmars inkubation vid 37 grader Celsius. Nästa dag, byt ut PBS med RIMS för en 24-timmars inkubation vid 37 grader Celsius.Vid slutet av inkubationen är vävnaden helt rensad. Vävnaden ska bli transparent efter flera veckor. För bildframställning av den rensade postnatala musen hjärta efter hjärtinfarkt induktion, fyll hälften av en kammare av en skräddarsydd depression glida med PBS och använda böjda tlysningar för att noggrant överföra rensade hjärtat i kammaren.Fyll den återstående volymen av kammaren med PBS. Fyll sedan kammaren med PBS tills vätskans yta bildar en kupol ovanför kammarens överkant och montera täckglaset innan du avbildar vävnaden genom konfokalmikroskopi enligt standardbildprotokoll. Om punktering och trubbig dissekering är för nära i närheten av bröstbenet, kan hjärtat inte kunna lämna brösthålan.Om hjärtat inte lätt ut ur hålrummet, tillämpa tryck på den vänstra buken för att underlätta processen. Komplikationer kan uppstå från vila hjärtat på intercostal muskler. Därför är det viktigt att hålla den trubbiga dissektionen till en minimal storlek i en horisontell orientering för att möjliggöra en tydlig visualisering och tillgänglighet av LAD.Observera att en ytlig ligatur kommer att ha mindre utrymme för justering i den slutliga suturplaceringen och att suturens kopplingsförbehåll runt LAD-gruppen ska utföras med kontrollerade stadiga rörelser. I slutet av clearingsteget bör hela hjärtat vara genomgående ogenomskinligt utan missfärgning i mitten. Efter några dagar i RIMS-lösning vid rumstemperatur ska hjärtat rensas helt och viss vävnadsexpansion kan observeras.Som observerats av tdTomato reporter protein uttryck, de hjärt nerver är främst ytliga med vissa populationer som är bosatta i det episslapiska lagret. Viktigt, reporter protein uttryck bekräftelse bevaras efter att ha genomgått klarhet protokollet som visats. Clearing och bildbehandling 3D-hjärtat ger perspektiv på placering och morfologi av hjärtcellpopulationer.Detta gör det möjligt för oss att identifiera nya aspekter i cell mönster och cell-cell interaktioner.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiering av en mänsklig Neural Stem Cell Line den Tredimensionell kulturer, Analys av MicroRNA och Förmodade målgenerna

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Generation av murina hjärtstimulator cellaggregat Baserat på ES-cell-programmering i kombination med Myh6-promotor-Val

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Analysera blodcellpopulationer av<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Isolering av perivaskulär multi Precursor cellpopulationer från Human hjärtvävnad

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Cleared embryonala och postnatal Hearts vid encelliga Upplösning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontell helmontering: Ett nytt bearbetnings- och bildprotokoll för tjocka, tredimensionella vävnads tvärsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tredimensionell Rendering och analys av Immunolabeled, klargöras mänskliga placenta villösa vaskulär nätverk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Tredimensionella inflammatoriska mänsklig vävnad motsvarigheter av Gingiva

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Tredimensionella Organotypic kulturer av vestibulära och auditiv sinnesorgan

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...