Name: capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Bu projenin finansmanı Wisconsin Ortaklık Programı (A.I.M.) ve Amerikan Kalp Derneği Kariyer Geliştirme Ödülü 19CDA34660169 (A.I.M.) tarafından UW Tıp ve Halk Sağlığı Okulu tarafından sağlanmıştır.

Tüm deneyler, Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı Kılavuzu'na ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Tıp ve Halk Sağlığı Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm yöntemler, Jackson Laboratuvarları'ndan elde edilen c57BL/6J (B6) ve transgenik fare hatlarında uygulandı.
1. 1 Günlük YenidoğanFarelerde Sol Anterior İnancı Arterin (LAD) Ligasyonu ile İndüklenen Koroner Arter Oklüz...

<ol>
	<li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Kikuchi, K., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regenerative+capacity+and+mechanisms.">Cardiac regenerative capacity and mechanisms.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Savarese, G., Lund, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Public+Health+Burden+of+Heart+Failure.">Global Public Health Burden of Heart Failure.</a> Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice.">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).</li><li>Karwowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+infarct+artery+location,+acute+total+coronary+occlusion,+and+mortality+in+STEMI+and+NSTEMI+patients.">Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients.</a> Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).</li><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).</li><li>MAGGIC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survival+of+patients+with+heart+failure+with+preserved+or+reduced+left+ventricular+ejection+fraction:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis.</a> European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).</li><li>Notari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+local+microenvironment+limits+the+regenerative+potential+of+the+mouse+neonatal+heart.">The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart.</a> Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neonatal+and+adult+mammalian+heart+regeneration+by+the+miR-15+family.">Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Collateral+Artery+Development+Program+Promotes+Neonatal+Heart+Regeneration.">A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration.</a> Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+neonatal+cardiac+extracellular+matrix+prevents+widespread+ventricular+remodeling+in+adult+mammals+after+myocardial+infarction.">Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction.</a> Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).</li><li>Mahmoud, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+Regulate+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration.">Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).</li><li>Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+lineage+tracing+methods+and+intestinal+tumors.">Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.</a> Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Phillips, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum:+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease.">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Scientific Reports. 6, 26013 (2016).</li><li>Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+in+Neonatal+Mice,+A+Model+of+Cardiac+Regeneration.">Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).</li><li>Sereti, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+clonal+expansion+during+mouse+heart+development+and+injury.">Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).</li><li>Lepilina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration.">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127 (3), 607-619 (2006).</li><li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair.">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li><li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li></ol>

Kardiyomiyositler ve miyosit dışı popülasyonlar arasındaki hücre-hücre etkileşimleri, kalbin yaralanma sonrası fibrozis mi yoksa onarım mı geçireceğini belirleyen bir faktördür. Keşifler gösteren çeşitli hücre tipleri, sinirler de dahil olmak üzere14, epikardiyal hücreler24, peritonmakrojlar25, arteriyol1212,13, ve lenfatik endotel hücreleri26, t...

Kalp uzun bir post-mitotik organ olarak kabul edilmiştir, henüz son kanıtlar kardiyomiyosit yenilenmesi yılda yaklaşık% 1 yetişkin insan kalbinde meydana geldiğini göstermektedir1. Ancak, kardiyomiyosit ciro bu düşük oranları yaralanma sonrasında meydana gelen doku büyük kaybı doldurmak için yetersizdir. Bir miyokard enfarktüsü acı bir kalp genellikle kalp yetmezliği ve ani kardiyak ölüm2,,3bir prelüd olarak hizmet veren, bir milyar kardiyomiyosit civarında kaybedersiniz . Dünya çapında kalp yetmezliğinden etkilenen 26 milyondan fazla insan ile, kalp hastalığı4tarafından neden olduğu zararları tersine çevirebilir terapötik için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.
Terapötik ler arasındaki bu boşluğu kapatmak için bilim adamları, yaralanma sonrası endojen yenilenmenin altında yatan evrimsel olarak korunmuş mekanizmaları araştırmaya başladılar. Memeli kardiyak rejenerasyonu üzerinde çalışmak için bir model yenidoğan faresidir. Doğumu takip eden hafta içinde, yenidoğan farelerkardiyak hasarı takiben sağlam bir rejeneratif yanıta sahiptir5. Daha önce neonatal farelerin apikal rezeksiyon5sonrasında kardiyomiyosit proliferasyonu ile kalplerini yenileyebildiklerini göstermiştir. Bu teknik, yenini kardiyak rejenerasyon uyandırmak rağmen, cerrahi insan kalp yaralanmaları için klinik alaka yoksundur. Neonatal fare modelinde bir insan yaralanması taklit etmek için, bir koroner arter tıkanıklığı ile miyokard enfarktüsü neden bir teknik geliştirdik6. Bu teknik sol ventrikül miyokardiyum6,,7kan% 40-50 teslim sorumludur sol anterior inen arter (LAD), cerrahi ligasyon gerektirir. Böylece, cerrahi sol ventrikül duvarının önemli bir bölümünü etkileyen bir enfarktüs sonuçları. Miyokardindeki bu hasar kardiyomiyosit proliferasyonlarını ve kalp yenilenmesini teşvik edecektir5.
Koroner arter oklüzyon cerrahisi kardiyak rejenerasyon iç işleyişini ortaya çıkarmak için son derece tekrarlanabilir ve doğrudan çeviriyöntemi sağlar. Yenidoğan cerrahisi insan kalbinde koroner arter ateroskleroz paralellikler, arterlerin iç duvarları içinde plak birikimi bir oklüzyon ve sonraki miyokard enfarktüsü neden olabilir8. Kalp yetmezliği hastaları için terapötik tedavilerde bir boşluk nedeniyle, LAD bir tıkanıklık yaralanma9aşağıdaki bir yıl içinde% 26'ya ulaşan mortalite oranları ile ilişkilidir , ve sonuç olarak "dul yapıcı" olarak adlandırılmıştır. Terapötik gelişmeler doğru kardiyak yaralanma karmaşık fizyolojik ve patolojik etkilerini yansıtan bir model gerektirir. Yenidoğan fare kardiyak yaralanması için cerrahi protokolümüz, araştırmacıların yaralanma sonrası memeli kalp yenilenmesini işaret eden moleküler ve hücresel ipuçlarını araştırmalarını sağlayan bir platform sağlar.
Son araştırmalar hücre dışı ortam ve kardiyomiyositler çoğalan arasındaki dinamik ilişkiyi vurgulamaktadır. Örneğin, postnatal rejeneratif pencere kalbi çevreleyen hücre dışı matriks sertliği azaltarak uzatılabilir10. Yenidoğan ekstrasellüler matris biyomalzemeler de kardiyak yaralanma11aşağıdaki yetişkin memeli kalplerde kalp rejenerasyonu teşvik edebilir. Ayrıca kardiyomiyosit proliferasyonu eşlik eden bir anjiyojenik yanıt12,13; yenidoğan farenin rejeneratif kalbine özgü kollateral arter oluşumukardiyak rejenerasyonu teşvik etmek için gerekli olduğu gösterilmiştir12. Ayrıca, bizim laboratuvar sinir sinyalizasyonu kardiyomiyosit proliferasyon ve büyüme faktörü düzeyleri modülasyonu yoluyla kalp rejenerasyon düzenler göstermiştir, yanı sıra yaralanma sonrası inflamatuar yanıt14. Bu bulgular kardiyak yaralanmaya yanıt olarak miyosit dışı hücre popülasyonlarının izlenmesi gereğini vurgulamaktadır. Bu amaca ulaşmak için, transgenik fare hatlarındaki Cre-lox rekombinasyon sisteminden yararlanarak floresan muhabir proteinlerin kurucu veya koşullu ifadesini soy takibi için birleştirdik. Ayrıca, hedeflenen hücre popülasyonlarının klonal genişlemesini belirlemek için Cre bağımlı, çok renkli floresan muhabirlerin stokastik ifadesine dayanan Rainbow fare çizgisi ile klonal genişleme desenlerini belirlemek için gelişmiş yöntemler kullanabiliriz15. Neonatal koroner arter oklüzyonu cerrahisi ile soy takibi nin alınması, kardiyak rejenerasyonun karmaşık hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir araçtır.
Floresan etiketli hücrelerin soyunu üç boyutlu (3D) tüm organ görüntülemesi ile izlemek geleneksel kesitleme ve rekonstrüksiyon tekniği kullanılarak elde etmek zordur – özellikle hücre popülasyonları kırılgan olduğunda, sinir lifleri veya kan damarları gibi. Optik kesitile organın doğrudan tam montaj görüntüleme yüzeysel hücre popülasyonları yakalayabilir iken, doku içinde derin bulunan yapılar erişilemez kalır. Bu engelleri aşmak için, doku temizleme teknikleri tüm organ dokularının opaklık azaltmak için geliştirilmiştir. Son zamanlarda, önemli gelişmeler Clear Lipid-exchanged Akrilamid-hibrid Rijit Görüntüleme uyumlu Doku hYdrogel (CLARITY) tabanlı yöntemler, hangi lipid ekstraksiyon u geçerek sabit doku temiz16yapılmıştır . Kırılma indisi homojenize etmek ve daha sonra17'yigörüntülerken ışık saçılımını azaltmak için de adımlar atılır. Böyle bir yöntem aktif CLARITY, hangi doku18boyunca deterjan nüfuz elektroforez kullanarak lipid ayrışmasını hızlandırır. Etkili olmasına rağmen, Bu doku temizleme yöntemi pahalı ekipman gerektirir ve doku hasarına neden olabilir, yaklaşım kardiyak sinirler gibi kırılgan hücre popülasyonları ile uyumsuz hale19. Böylece, biz yavaşça deterjan penetrasyon kolaylaştırmak için ısı dayanır pasif CLARITY yaklaşımı, istihdam, bu nedenle karmaşık hücre yapılarının tutulmasına yardımcı20,21.
Pasif BERRAKLIK genellikle aktif CLARITY18daha az verimli olduğu düşünülmektedir , teknik genellikle iki büyük engeller eşlik ettiği gibi: yetersizlik tüm organ derinliği temizlemek için ve yetişkin dokuları temizlemek için gerekli zaman geniş miktarda. Pasif CLARITY yaklaşımımız, yenidoğan ve erişkin kalp dokusunu tamamen temizleyebilecek hızlı bir temizleme işlemi yle bu engellerin her ikisini de aşar. Pasif CLARITY doku temizleme tekniğimiz, erişkin kalbe dağılmış nadir popülasyonlar da dahil olmak üzere çeşitli kardiyak hücre popülasyonlarının görüntülenmesine izin veren bir verimliliğe ulaşmıştır. Temizlenmiş kalp konfokal mikroskopi ile görüntülendiğinde, gelişim, hastalık ve rejenerasyon sırasında hücreye özgü desenleme mimarisi aydınlatılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-thioglycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Prolene Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8889H</td>
			<td>Polypropylene Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16-050-146</td>
			<td>Half Curved, Serrated, 4 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-812-39</td>
			<td>Dissecting, 4.5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vial</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-339-26A</td>
			<td>12 x 35 mm Vial with Cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>2 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td>Straight, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-966</td>
			<td>Mayo-Hegar, 6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Forceps</td>
			<td>Sigma-Adrich</td>
			<td>Z168777</td>
			<td>Fine Tip, Straight, 4.25 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Dissecting Scissor</td>
			<td>Walter Stern Inc</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>30 mm Cutting Edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>16050133</td>
			<td>Medium Tissue, 1X2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>Water-soluble azo initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging

Kardiyovasküler hastalık diğer tüm ölüm nedenlerinden daha yüksektir ve dünya çapındaki ölümlerin %31'inden sorumludur. Bu hastalık kardiyak yaralanmada, öncelikle akut miyokard enfarktüsü şeklinde ortaya çıkar. Yaralanma dan sonra çok az esneklik ile, bir kez sağlıklı kardiyak doku fibröz, non-kontrtil skar dokusu ile değiştirilir ve genellikle kalp yetmezliği için bir prelüd olabilir. Rejeneratif tıpta yeni tedavi seçeneklerini belirlemek için, araştırma doğuştan rejeneratif yetenekleri olan omurgalılar üzerinde odaklanmıştır. Böyle bir model organizma yenidoğan fare, sağlam miyokardiyal rejenerasyon ile kardiyak yaralanma yanıt verir. Yenidoğan faresinde klinik olarak alakalı bir yaralanmayı tetiklemek için, sol anterior inen arteri (LAD) tıkamak için, insan kalbinde aterosklerozun tetiklediği miyokard enfarktüsü yansıtan bir ameliyat geliştirdik. Kardiyomiyositler ve miyosit olmayan popülasyonlarda ki değişiklikleri takip etme teknolojisiyle eşleştiğinde, bu model bize kalp yenilenmesini yönlendiren mekanizmaları belirlemek için bir platform sağlar. Yaralanma sonrası kardiyak hücre popülasyonlarında değişiklikler hakkında bilgi edinmek, bir zamanlar doku kesiti ve histolojik inceleme gibi iki boyutlu analizle sınırlı olan ve genellikle bu süreçte dokuya zarar veren yöntemlere dayanıyordu. Ayrıca, bu yöntemler hücre soy değişiklikleri izlemek için yeteneği yoksun, bunun yerine yaralanma yanıtı sadece bir anlık görüntü sağlayan. Burada, soyu izleme modellerinde teknolojik olarak gelişmiş yöntemlerin, tüm organ temizliğinin ve üç boyutlu (3D) tam montajlı mikroskopinin kardiyak onarım mekanizmalarını açıklamak için nasıl kullanılabileceğini anlatıyoruz. Yenidoğan fare miyokard infarktüsü cerrahisi, doku temizleme ve 3Boyutlu tüm organ görüntüleme protokolümüzle, kardiyomiyosit proliferasyonuna neden olan karmaşık yollar çözülerek kardiyak rejenerasyon için yeni tedavi hedeflerini ortaya çıkarabilebilir.

Genellikle iki en zorlu adım göğüs boşluğu dışında kalp rehberlik ve LAD ligating vardır. Bu adımları gidermek için, ayarlamalar dördüncü interkostal kaslar arasında ilk delinme yerleşimi yapılabilir; delinme ve künt diseksiyon göğüs kafesine çok yakınsa, kalp göğüs boşluğundan çıkamayabilir(Şekil 1A).
Ayrıca, sol karın üzerinde artan basınç bu süreci kolaylaştırmak için gerekli olabilir<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging at JoVE.com

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Yaralanma sonrası kardiyomiyosit proliferasyonu, miyosit dışı hücre popülasyonlarından gelen ekstrasellüler ipuçlarının senfonisini gerektiren dinamik bir süreçtir. Soy takibi, pasif CLARITY ve üç boyutlu tam montajlı konfokal mikroskopi tekniklerini kullanarak, çeşitli hücre tiplerinin kardiyak onarım ve rejenerasyon üzerindeki etkisini analiz edebiliriz.

Temizlenmiş Kalp Üç Boyutlu Görüntüleme ile Hedefhücre Popülasyonlarının Kardiyak Yaralanma Yanıtının Yakalanması

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Endojen kalp rejenerasyonu, sağlam bir rejeneratif yanıt monte etmek için birlikte çalışan birden fazla hücre tipini içeren dinamik bir süreçtir. Yaralanmaya yanıt olarak temizlenmiş kalbin 3Boyutlu görüntüleme yoluyla rejenerasyon doku içine bakan bu kardiyak rejeneratif yanıt rehberlik hücresel dinamiklerin rekonstrüksiyonu yardımcı olabilir. Protokolümüz özellikle geliştirme ve rejenerasyon sırasında hücreleri izlemek için tasarlanmıştır.Temizleme, boyama ve görüntüleme tekniklerimizi diğer organ tiplerine yaygın olarak uygulamakta herhangi bir sınırlama öngörmüyoruz. LAD'ye bağlı koroner arter tıkanıklığı için, önce anestezili bir günlük yenidoğan yavrusunun cerrahi alanını antiseptik solüsyonla sterilize edin. Göğüs bölgesinde enine deri kesiyapın.Kas cildi ayırmak için, hafifçe kapalı bir pozisyonda interkostal kaslara karşı makas basarak cildi dikkatle kaldırmak için pansuman forseps bir çift kullanın. Dördüncü interkostal alanı bulmak ve iç organları önlemek için özen küçük bir yüzeysel delinme yapmak için küçük çalgılar kullanın. Künt diseksiyon ve pansuman forceps kullanarak, bir parmak yavaşça göğüs boşluğundan kalp rehberlik etmek için pansuman forceps ile interkostal boşluk açık tutarken karın sol tarafına uygulanabilir kadar interkostal kaslar arasındaki alanı genişletmek.Kalp çıkarıldıktan sonra, kalp interkostal kaslar üzerinde dinlenmek ve daha az birikmiş kan ile kalbin bölge olarak LAD bulmak için izin verin. Miyokard enfarktüsü neden olmak için, arter kesmeden damar etrafında iki kez sıkıca bir kare düğüm bağlamak için 6-0 dikiş kullanın. Tepede beyazlatma hemen gözlenmelidir.Benzer bir enfarkt boyutu için LAD boyunca dikiş yerleşimi tutarlı kalmak önemlidir. Bu en iyi kan hala arterler üzerinden akan ise hızlı bir şekilde kalbe erişerek elde edilir. Dikiş yerleştirildiğinde, kalbin göğüs boşluğuna geri kaymasına izin verin.Kaburgaların üst ve alt setinden 6-0'lık bir dikiş geçerken kaburgaların üst setini kaldırmak için künt forseps ler kullanarak kaburgaları bir cerrah ve bir kare düğüm le birlikte dikin. Üst karın deri tutkal küçük bir hacim uygulayın ve maruz göğüs bölgesi üzerinde alt karın cilt konumlandırmak için ince forceps kullanın. Sonra bir ısıtma yastığı üzerinde yavru yerleştirin ve bir sonraki hayvan üzerinde ligasyon gerçekleştirmek.Tüm ameliyatlar yapıldığında, sıcak ve hareketli yavruları annenin kafesine geri getirin. Hasat edilen kalp dokusunun pasif netliği için, 21 gün ameliyat sonrası parmak ucuna yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra fareyi supine pozisyonunda temiz bir cerrahi alana yerleştirin ve uzuvları bantla sabitleyin. Doku forceps kullanarak, xiphoid sürecinin hemen altında kürk kavramak ve göğüs kafesi genişliğikapsayan bir kesi yapmak.Göğüs kafesinin distal kısımlarının yanında kesin ve diyaframı ortaya çıkarmak için xiphoid işlemini kaldırmak için forsepskullanın. Diyaframı kavisli forceps ile ayırın ve atan kalp erişilebilir olana kadar kafatasında doku çekin. Tabanında kalp kavramak ve aort ve üstün vena kava kesmek için iridektomi makas kullanmak için kavisli forceps kullanın.Atan kalbi PBS'nin Petri kabına yerleştirin, böylece kalp tutulan kanı dışarı pompalar. Miyokard enfarktüsü LAD ligasyonunun doğru anatomik yerleşimi ile doğrulanabilir. Kalp durduğunda, kalan kanı atmak için organı forsepslerle hafifçe sıkın ve numuneyi iki mililitre PBS içeren tek kullanımlık 2,5 mililitrelik cam kabuk şişesine aktarın.Çözelti kandan temiz kalana kadar şişeyi oda sıcaklığında pbs çözeltisini her 10 dakikada bir değiştirerek en az 30 dakika çalkalayıcıüzerine yerleştirin. PBS temiz olduğunda, oda sıcaklığında dört saatlik bir kuluçka için iki mililitre soğuk 4%paraformaldehit ile PBS değiştirin ve ardından yıkama başına iki mililitre taze PBS ile çalkalayıcıüzerinde üç 10 dakikalık yıkar. Son yıkamadan sonra, dört santigrat derecede bir gecede kuluçka için% 0.5 VA-044 çözeltisi ile desteklenen% 4 akrilamid iki mililitre ile şişe doldurun.Ertesi gün, şişeyi 37 derecelik bir ısı bloğuna üç saat süreyle yerleştirin. Polimerizasyonun sonunda, kalbi yeni bir cam kabuk şişesine aktarın ve kalp dokusunu her kuluçka sonunda PBS'yi yenilerek bir seferde iki mililitre taze PBS 10 dakika yıkayın. PBS temizlendiğinde, yıkama tamponu iki mililitre temizleme çözeltisi ile değiştirin.Kalbi temize gelene kadar numuneyi 37 santigrat derecede birkaç hafta kuluçkaya yatırın ve temizleme solüsyonunu her 2-3 günde bir yenileyin. Organ temizlendiğinde, numuneyi 37 santigrat derecede 24 saatlik bir kuluçka için taze PBS ile doldurmadan önce gösterildiği gibi çalkalayıcıda PBS ile yıkayın. Ertesi gün, 37 santigrat derecede 24 saatlik kuluçka için PBS'yi RIMS ile değiştirin.Kuluçka sonunda doku tamamen temizlenir. Doku birkaç hafta sonra şeffaf hale gelmelidir. Miyokard infarktüsü sonrası temizlenmiş postnatal fare kalbinin görüntülenmesi için, özel yapım depresyon slaytının yarısını PBS ile doldurun ve temizlenmiş kalbi dikkatlice odaya aktarmak için kavisli forseps kullanın.Haznenin kalan hacmini PBS ile doldurun. Daha sonra sıvı nın yüzeyi odanın üst kısmında bir kubbe oluşturana kadar odayı PBS ile doldurun ve standart görüntüleme protokollerine göre dokuyu konfokal mikroskopi ile görüntülemeden önce kapak kaydırağı monte edin. Delinme ve künt diseksiyon göğüs kafesine çok yakınsa, kalp göğüs boşluğundan çıkamayabilir.Kalp kolayca boşluk tan çıkmazsa, süreci kolaylaştırmak için sol karın basınç uygulayın. Komplikasyonlar interkostal kaslar üzerinde kalp dinlenme oluşabilir. Bu nedenle, lad net bir görselleştirme ve erişilebilirlik sağlamak için yatay bir yönde en az boyutta künt diseksiyon tutmak önemlidir.Yüzeysel bir ligasyon son dikiş yerleşiminde ayarlama için daha az yer olacak ve LAD etrafında dikiş bağlama kontrollü sabit hareketlerle yapılmalıdır unutmayın. Temizleme adımının sonunda, tüm kalp sürekli merkezinde hiçbir renk değişikliği ile opak olmalıdır. Oda sıcaklığında RIMS çözeltisinde birkaç gün kaldıktan sonra kalp tamamen temizlenmeli ve bazı doku genişlemesi gözlemlenebilir.TdTomato muhabiri protein ekspresyonunda gözlendiği gibi, kardiyak sinirler epikardiyal tabakada yaşayan bazı popülasyonlarda çoğunlukla yüzeyseldir. Daha da önemlisi, muhabir protein ekspresyonu onayı gösterildiği gibi netlik protokolünden geçtikten sonra korunur. 3D kalbin temizlenmesi ve görüntülenmesi, kardiyak hücre popülasyonlarının yeri ve morfolojisi ile ilgili perspektif sağlar.Bu bize hücre desenleme ve hücre-hücre etkileşimleri yeni yönlerini belirlemek için izin verir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Myh6-Promotörle Seçim ile kombinasyonu ES-Hücre-Programlama dayanarak Kemirgen Kardiyak Kalp Pili Hücre Agregaların Üretimi

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Üç boyutlu inflamatuar insan dokusu jinjiva karşılıkları

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu Organotypic

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...