Name: a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk at JoVE.com

Nous remercions Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa et Retha Geiss pour leur aide dans la coordination des études. SEM a été réalisé par l'Université du Michigan Microscopy et L'analyse d'images Laboratoire de recherche biomédicale Core Facility. Ce projet a été soutenu par des subventions des NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant du Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Subventions pilotes VISN 10 SPARK de l'Administration des anciens combattants ( RWO). Microscopie électronique à balayage effectuée par l'University of Michigan Microscopy and Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La figure 4 de ce manuscrit a été publiée à l'origine dans Baker et coll., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, et a été reproduit avec la permission d'Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Pour obtenir la permission de réutiliser ce matériel, veuillez visiter http://global.oup.com/academic/rights.

Les tissus adipeux sont achetés des sujets humains subissant la chirurgie bariatrique élective sous l'approbation institutionnelle de conseil d'examen.
1. Isolement de préadipocyte et préparation de réactif de culture
<ol><li>Préparer 2% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans une solution saline tamponnée de phosphate 1x (PBS). Filtrer la stérilisation et les conserver à 4 oC.</li>
	<li>Préparer la collagène de type II : 2 mg/mL dans 2 % de BSA en 1x PBS. Préparer immédiatement a...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li><li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+adhesion.">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li><li>O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+heats+up+adipose+tissue+lymphocytes.">Obesity heats up adipose tissue lymphocytes.</a> Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).</li><li>Engin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pathogenesis+of+Obesity-Associated+Adipose+Tissue+Inflammation.">The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).</li><li>Dankel, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COL6A3+expression+in+adipocytes+associates+with+insulin+resistance+and+depends+on+PPAR&#947;+and+adipocyte+size.">COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPAR&#947; and adipocyte size.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).</li><li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+in+human+adipose+tissue:+composition,+distribution,+and+link+with+lipid+metabolism+and+fat+mass+loss.">Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss.</a> Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).</li><li>Lackey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+adipose+tissue+architectural+and+tensile+properties+toward+defining+healthy+and+unhealthy+obesity.">Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).</li><li>Muir, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+fibrosis,+hypertrophy,+and+hyperplasia:+correlations+with+diabetes+in+human+obesity.">Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).</li><li>Spencer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+in+insulin-resistant+subjects+are+associated+with+collagen+VI+and+fibrosis+and+demonstrate+alternative+activation.">Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).</li><li>Baker, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes-specific+regulation+of+adipocyte+metabolism+by+the+adipose+tissue+extracellular+matrix.">Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).</li><li>Pellegrinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipocyte+function+is+impacted+by+mechanical+cues.">Human adipocyte function is impacted by mechanical cues.</a> Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).</li><li>Flynn, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+decellularized+adipose+tissue+to+provide+an+inductive+microenvironment+for+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells.">The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).</li><li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization.">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li><li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine.">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).</li><li>Tebyanian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Rat+Lung+Decellularization+by+Chemical+Detergents+for+Lung+Tissue+Engineering.">A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering.</a> Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering.">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li><li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation.">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop.">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li><li>Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+Metabolic+Interrogation+of+Human+Adipocytes.">Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).</li><li>O'Rourke, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexosamine+biosynthesis+is+a+possible+mechanism+underlying+hypoxia's+effects+on+lipid+metabolism+in+human+adipocytes.">Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes.</a> PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).</li><li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes.">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li><li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans.">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li></ol>

Le modèle de culture ECM-adipocyte fournit un outil précieux pour disséquer les rôles individuels de l'ECM et des cellules dans la dictation du phénotype tissulaire ultime. Le protocole d'isolement d'ECM est tout à fait reproductible, mais la variabilité dans le processus de décellularization peut être observée. L'étape de délipidation du Jour 3 est un point critique du protocole. À l'achèvement de l'extraction de nuit, la délipidation de la matrice devrait être démontrée par la solution de solvant pola...

La matrice extracellulaire (ECM) fournit non seulement un échafaudage mécanique pour les tissus, mais s'engage également dans le crosstalk complexe avec des cellules qui résident en elle, régulant divers processus nécessaires pour l'homéostasie tissulaire, y compris la prolifération cellulaire, différenciation, signalisation et métabolisme1. Tandis que l'ECM sain joue un rôle essentiel le maintien de la fonction normale de tissu, l'ECM dysfonctionnel a été impliqué dans les maladies multiples2.
Le tissu adipeux joue un rôle important dans la pathogénie de la maladie métabolique. L'obésité est associée à l'hypertrophie excessive d'adipocyte et à l'hypoxie cellulaire, aux défauts dans le métabolisme cellulaire d'adipocyte, et au reticulum et à l'inflammation d'endoplasmique de tissu adipeux. Bien que mal compris, ces processus complexes conspirent pour altérer la capacité de tamponde de nutriment de tissu adipeux, menant au débordement nutritif du tissu adipeux, à la toxicité dans les tissus multiples, et à la maladie métabolique systémique3,4 ,5. La séquence des événements et des mécanismes spécifiques qui sous-tendent l'échec de tissu adipeux sont mal compris, mais des altérations dans l'ECM de tissu adipeux ont été impliquées. La composition d'ECM est modifiée dans le tissu adipeux dans l'obésité humaine et murine, avec le dépôt accru de protéine d'ECM avec les différences biochimiques et structurales qualitatives dans le tissu adipeux ECM lié à la maladie métabolique humaine, y compris diabète de type 2 et hyperlipidémie6,7,8,9,10,11.
En dépit de ces observations, le rôle de l'ECM de tissu adipeux en médiatisant le dysfonctionnement adipeux de tissu n'est pas bien défini. Cela est dû en partie à un manque de modèles expérimentaux traitables qui permettent la dissection des rôles spécifiques de l'ECM et des adipocytes dans la régulation de la fonction ultime du tissu adipeux. La culture eCM-adipocyte simule mieux l'environnement in vivo du tissu adipeux indigène à au moins deux égards. Tout d'abord, la culture ECM fournit un environnement moléculaire similaire au tissu adipeux indigène, y compris les collagènes indigènes, les élastines et autres protéines matricielles absentes dans la culture 2D standard. Deuxièmement, la culture sur le plastique 2D a été montré pour modifier le métabolisme des adipocytes par des effets mécaniques en raison de l'élasticité diminuée du substrat plastique12, qui ECM-culture élimine.
Les méthodes pour concevoir des échafaudages biologiques par l'isolement de l'ECM de l'adipose décellularisé et d'autres tissus ont été étudiées dans le contexte de la médecine régénératrice et reconstructive et de l'ingénierie tissulaire13,14, 15,16,17,18. Nous avons déjà publié une méthodologie dans laquelle nous avons adapté ces méthodes pour développer un modèle 3D in vitro de la culture humaine ECM-adipocyte, en utilisant des cellules souches ECM et adipocytes (préadipocytes) dérivés de tissus adipeux viscéraux humains11. Dans le présent article, nous décrivons ces méthodes en détail. La procédure de décellularisation du tissu adipeux humain est un processus de quatre jours qui implique des traitements mécaniques et enzymatiques pour enlever les cellules et les lipides, laissant un échafaudage biologique qui maintient les caractéristiques du tissu à partir duquel il est dérivé. L'ECM décellularisé soutient la différenciation adipogénique des préadipocytes humains, et lorsqu'il est reconstitué avec des adipocytes, maintient la microarchitecture et les caractéristiques biochimiques et spécifiques à la maladie du tissu adipeux intact et s'engage dans le métabolisme fonctions caractéristiques du tissu adipeux indigène. Cette matrice peut être étudiée seule ou réensemencée avec des cellules, permettant l'étude des interactions et du croisement entre les composants cellulaires et extra-cellulaires du tissu adipeux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial tube</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#02-682-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon mesh filter</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td>
			<td>Cat#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 nM 3,3&#8217;-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciglitizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#C3974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-</td>
			<td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#NET328A250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP231</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA</td>
			<td>Cat#DSP-MD.43</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#G5882</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisalizane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#440191</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A415</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5627</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S25484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipase from porcine pancreas, type VI-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#L0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK</td>
			<td>Cat# AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Solution (ORO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#O1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Stain Kit</td>
			<td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td>
			<td>Cat#KTORO-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#201030</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#93482</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#R5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, forceps, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorensen&#39;s phosphate buffer</td>
			<td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td>
			<td>CAS #: 10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 culture flask</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10062-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>Cat#D1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyceride Determination Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#TR0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#WHA5201150</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk

La matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle central dans la régulation de l'homéostasie tissulaire, s'engageant dans le crosstalk avec les cellules et régulant de multiples aspects de la fonction cellulaire. L'ECM joue un rôle particulièrement important dans la fonction de tissu adipeux dans l'obésité, et des changements dans le dépôt et la composition d'ECM de tissu adipeux sont associés à la maladie métabolique chez les souris et les humains. Les modèles in vitro traitables qui permettent la dissection des rôles de l'ECM et des cellules en contribuant au phénotype global de tissu sont clairsemés. Nous décrivons un nouveau modèle in vitro 3D de la culture humaine d'ECM-adipocyte qui permet l'étude des rôles spécifiques de l'ECM et des adipocytes en régulant le phénotype métabolique de tissu adipeux. Le tissu adipeux humain est décellularisé pour isoler l'ECM, qui est ensuite repeuplé avec des prédipocytes qui sont ensuite différenciés dans l'ECM en adipocytes matures. Cette méthode crée des constructions ECM-adipocyte qui sont métaboliquement actives et conservent des caractéristiques des tissus et des patients dont ils sont dérivés. Nous avons utilisé ce système pour démontrer la maladie spécifique ECM-adipocyte crosstalk dans le tissu adipeux humain. Ce modèle de culture fournit un outil pour disséquer les rôles de l'ECM et des adipocytes en contribuant au phénotype métabolique global de tissu adipeux et permet l'étude du rôle de l'ECM en réglant l'homéostasie de tissu adipeux.

La préparation de l'ECM du tissu adipeux, l'ensemencement avec des préadipocytes et la différenciation in vitro en adipocytes matures entraînent des changements morphologiques séquentiaux clairs dans les tissus qui permettent l'évaluation visuelle des progrès tout au long du protocole (Figure 1) . Les prédipocytes utilisés pour semer l'ECM sont isolés à l'aide de la digestion de collagène à partir d'échantillons de TVA distincts (<strong class="...

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A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Nous décrivons un système de culture in vitro de matrice-adipocyte extracellulaire humain 3D qui permet la dissection des rôles de la matrice et des adipocytes en contribuant au phénotype métabolique de tissu adipeux.

Un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3D pour étudier matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Notre protocole démontre que l’ECM peut favoriser la différenciation adipogenic en l’absence des médiateurs adipogenic classiques et est le premier à démontrer la régulation maladie-spécifique du métabolisme cellulaire par l’ECM. Notre technique fournit un outil pour disséquer les rôles de l’ECM et des adipocytes dans le métabolisme des tissus adipeux et permettre l’étude du rôle de l’ECM dans la régulation de l’homéostasie des tissus adipeux. Comparé à la culture standard de cellules 2D, notre modèle 3D permet l’examen et la dissection plus robustes de la conversation croisée entre les adipocytes et l’ECM de tissu adipeux dans le contexte du diabète de type 2.Nous recommandons de commencer par des échantillons plus petits pour évaluer dans quelle mesure il est cellulaire. Gardez à l’esprit qu’il existe une variabilité interpatiale dans la façon dont les cellules se développent et dans quelle mesure le tissu se décellularise. Il est important d’observer le tissu avant et après chaque étape pour s’assurer que le tissu est en train de se décellulariser et pour comprendre les différences potentielles entre les échantillons.Après avoir obtenu le tissu adipeux viscéral ou la TVA de la chirurgie, préparez-le pour le stockage en ajoutant 5-10 grammes du tissu à 15-25 millilitres de solution tampon de congélation dans un tube conique de 50 millilitres. Immerger complètement l’échantillon et le conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la décellularisation. Pour l’isolement des préadipocytes, placez deux grammes d’un échantillon frais de TVA intacte dans 20 millilitres de solution de type II de collagène, puis insérez des ciseaux stériles dans le tube et hachez soigneusement le tissu.Une fois haché dans une boue fine, l’incuber dans la solution de collagène à 37 degrés Celsius sur un shaker orbital pendant 60 minutes. Après l’incubation, filtrer le résultat digéré à travers un maillage en nylon de 100 micromètres dans un tube conique frais de 50 millilitres. Le digéré doit être un liquide jaune-orange avec une viscosité modérée et une petite quantité de brins résiduels de tissu non digéré.Centrifuger l’échantillon à 270 fois g pendant 10 minutes, enlever le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire en deux millilitres de solution de lysage RBC 1X avec une pipette. Incuber la solution pendant une minute à 25 degrés Celsius, puis ajouter 10 millilitres de 15%FBS DMEM F12 et la centrifuger à 270 fois g pendant 10 minutes. Pour préparer l’ECM, congeler/décongeler l’échantillon de TVA préalablement congelé à 37 degrés Celsius en l’incubant dans un bain d’eau préchauffé pendant 20 minutes avec une agitation manuelle périodique douce.Une fois décongelé, transférez le tissu à moins 80 degrés Celsius pendant 20 minutes et répétez le processus de gel/dégel trois fois se terminant par la décongélation. Utilisez des forceps stériles pour transférer l’échantillon de TVA dans un tube conique frais de 50 millilitres contenant de 15 à 25 millilitres de solution enzymatique 1 en s’assurant que l’échantillon est complètement immergé. Puis l’incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius tout en secouant à 130 RPM.Le lendemain, lavez l’échantillon trois fois avec 15-25 millilitres de solution tampon de rinçage, versant la solution après chaque lavage. Transférer l’échantillon dans un tube frais de 50 millilitres avec 15-25 millilitres de solution enzymatique 2 et l’incuber pendant la nuit. Répétez les lavages avec la solution tampon de rinçage et transférez l’échantillon dans un tube frais contenant de 15 à 25 millilitres de solution d’extraction de solvant polaire.Incuber l’échantillon toute la nuit en secouant. Après incubation avec la solution de solvant polaire, il est important d’examiner l’échantillon pour l’élimination des lipides. Si la majeure partie du lipide n’est pas enlevée, il peut être nécessaire de répéter cette étape.Un temps d’incubation plus court peut être utilisé. Après l’incubation, transférer l’échantillon dans un tube frais contenant de 15 à 25 millilitres de solution tampon de rinçage et laver l’échantillon trois fois sur le shaker. Lavez ensuite l’échantillon trois fois avec une solution à 70 % d’éthanol, en versant l’éthanol après chaque lavage.Lavez l’échantillon une fois avec la solution de stockage, puis utilisez des forceps stériles pour transférer dans un tube frais contenant 15-25 millilitres de solution de stockage en s’assurant de l’immerger complètement. L’échantillon peut ensuite être conservé à quatre degrés Celsius pendant une période d’un mois. L’isopropanol et l’éthanol sont inflammables et doivent être à température ambiante et éliminés dans des déchets inflammables.Tous les déchets humains doivent être éliminés séparément des déchets biorisques habituels. Transférer les fragments d’ECM stockés dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits avec des forceps stériles ajoutant autant de fragments que nécessaire pour les analyses prévues en aval. Lavez-les trois fois avec 500 microlitres de 70% d’éthanol sur un shaker orbital, puis réhydratez-les en les lavant trois fois avec du PBS.Utilisez des ciseaux stériles pour couper l’ECM en fragments de 100 milligrammes. Placez chaque fragment dans un puits d’une plaque de 24 puits et incubez la plaque à 25 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre à l’excès de PBS d’extruder des fragments. Retirez ensuite soigneusement les restes de PBS des puits à l’aide d’une pipette.Ensemencer chaque fragment avec 20 microlitres de suspension cellulaire préadipocyte en pipetant les cellules directement dans l’ECM. Placez la pointe de pipette dans l’ECM et expulsez-la doucement au centre de la matrice en vous assurant que la suspension cellulaire ne déborde pas et ne se retrouve pas au fond du puits. Si la suspension cellulaire déborde de l’ECM, retirez la pointe pipette de cet endroit et insérez-la ailleurs dans l’ECM.Après l’ensemencement cellulaire, incuber l’ECM pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius. Remplissez chaque puits de 500 microlitres de supports de croissance pour couvrir les fragments d’ECM ensemencés. Culture des cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures.Après 72 heures, aspirez soigneusement le média de croissance sans perturber le fragment d’ECM. Ajouter 500 microlitres de médias de différenciation et de culture des cellules pendant 14 jours en changeant les médias tous les deux à trois jours. Vérifiez la différenciation à l’aide d’une microscopie légère.Les cellules accumuleront des lipides, deviendront de couleur brun-jaune et deviendront plus sphériques à mesure qu’elles se différencieront. La préparation de l’ECM de tissu adipeux, l’ensemencement avec des preadipocytes, et la différenciation in vitro dans les adipocytes mûrs ont été surveillés avec la microscopie électronique de balayage qui a indiqué la dcellularisation de l’ECM et la récapitulation suivante des lipides contenant des adipocytes sur le résédage et la différenciation. Le collagène 1 immunohistochimie spécifique de l’ECM décellularisé a montré le maintien de la micro-architecture de collagène tandis que la coloration rouge-o d’huile des constructions vivantes et fixes d’ECM-adipocyte de 3D a montré le lipide contenant des adipocytes.Les adipocytes différenciés dans ECM ont été examinés pour des gènes adipogenic utilisant le PCR en temps réel quantitatif qui a démontré que ces gènes sont upregulated dans les cellules différenciées par rapport aux préadipocytes indifférenciés cultivés dans ECM. La différence complète dans les niveaux de transcription est indiquée. Quatre combinaisons d’ECM et d’adipocytes des sujets diabétiques et nondiabetic ont été soumises au phénotypage métabolique.L’absorption altérée de glucose dans la fonction lipolytique a été découverte dans des constructions des tissus diabétiques. Fait important, il a été constaté que l’ECM nondiabetic sauve l’absorption insuline-stimulée de glucose et la capacité lipolytique dans les adipocytes diabétiques. La contamination des préadipocytes isolés, du tissu décellulaire et de l’ECM réséqué n’est pas rare.La stérilité doit être maintenue avec diligence tout au long du protocole.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Recherche

Bio-ingénierie

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Rotation systèmes de culture cellulaire de la culture de cellules humaines: les cellules du trophoblaste humain comme modèle

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Production, la caractérisation et utilisations potentielles d&#39;un humain de l&#39;oesophage muqueux modèle 3D de l&#39;ingénierie tissulaire

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

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Un modèle 3D Culture hormone-sensibles de la glande mammaire humaine épithélium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

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Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

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It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

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