Name: spatial temporal analysis of fieldwise flow in microvasculature
Uploaded: 2019-11-18T14:00:00
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Los estudios presentados aquí fueron apoyados por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (NIH U01 GM111243 y NIH NIDDK P30 DK079312). Se realizaron estudios de microscopía intravital en el Centro de Microscopía Biológica de Indiana. Agradecemos a la Dra. Malgorzata Kamocka por la asistencia técnica con microscopía.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Indiana, y se adhirieron a la guía NRC para el cuidado y uso de animales.
1. Preparación quirúrgica para la microscopía intravital
NOTA: Esto no es una cirugía de supervivencia. Una vez iniciada la sección 1 "Preparación quirúrgica para la microscopía intravital", el ...

<ol>
	<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclinical+Vascular+Dysfunction+Associated+with+Metabolic+Syndrome+in+African+Americans+and+Whites.">Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites.</a> The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).</li><li>Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+microvascular+changes+associated+with+development+of+liver+fibrosis+and+cirrhosis.">Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).</li><li>Zafrani, L., Ince, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+in+Acute+and+Chronic+Kidney+Diseases.">Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases.</a> American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).</li><li>Nielsen, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+dysfunction+is+associated+with+symptom+severity+and+neurodegeneration+in+Alzheimer's+disease.">Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).</li><li>Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+Microvascular+Function+in+Humans+from+a+Chronic+Disease+Perspective.">Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).</li><li>Clemens, M., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Sinusoidal+Perfusion:+In+Vivo+Methodology+and+Control+by+Endothelins.">Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins.</a> Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).</li><li>Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+hepatic+microcirculation+by+in+vivo+microscopy.">Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy.</a> Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multiphoton+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy.</a> Current protocols in cytometry. , (2012).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Huang, Z. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization-based+super-resolution+microscopy+with+an+sCMOS+camera.">Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera.</a> Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).</li><li>Clendenon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+automated+method+for+continuous+fieldwise+measurement+of+microvascular+hemodynamics.">A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics.</a> Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Liu, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+space+approach+to+directional+analysis+of+images.">Scale space approach to directional analysis of images.</a> Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+microvascular+changes+associated+with+development+of+liver+fibrosis+and+cirrhosis.">Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).</li><li>Babbey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+microscopy+of+hepatic+transport.">Quantitative intravital microscopy of hepatic transport.</a> IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).</li><li>Dunn, K. W., Ryan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+quantitative+intravital+multiphoton+microscopy+to+dissect+hepatic+transport+in+rats.">Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats.</a> Methods. 128, 40-51 (2017).</li><li>Ryan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Multiphoton+Microscopy+with+Fluorescent+Bile+Salts+in+Rats+as+an+In+Vivo+Biomarker+for+Hepatobiliary+Transport+Inhibition.">Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition.</a> Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Glomerular+Permeability+of+Fluorescent+Macromolecules+Using+2-Photon+Microscopy+in+Munich+Wistar+Rats.">Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).</li><li>Chhatbar, P. Y., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blood+velocity+measurements+with+a+hybrid+image+filtering+and+iterative+Radon+transform+algorithm.">Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm.</a> Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).</li><li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform.">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li><li>Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy+Imaging+of+the+Liver+following+Leishmania+Infection:+An+Assessment+of+Hepatic+Hemodynamics.">Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).</li><li>Hoshikawa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Flow+Velocity+Mapping+from+Fluorescent+Dye+Transit+Times+in+the+Brain+Surface+Microcirculation+of+Anesthetized+Rats+and+Mice.">Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice.</a> Microcirculation. 23 (6), 416-425 (2016).</li><li>Sironi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+flow+mapping+in+complex+vessel+networks+by+single+image+correlation.">In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation.</a> Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).</li><li>Kamoun, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+RBC+velocity,+flux,+hematocrit+and+shear+rate+in+vascular+networks.">Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks.</a> Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).</li></ol>

Hay varios pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, la minimización del movimiento durante la toma de imágenes intravitales del hígado es esencial para generar películas que se pueden utilizar para el análisis de flujo capilar utilizando STAFF. Debido a la proximidad del diafragma, se producen períodos cortos de movimiento inducido por la respiración, con el hígado asegurado regresando a su posición inicial después de cada respiración. Asegurar el hígado expuesto quirúrgicamente contra el plato co...

La microvasculatura desempeña un papel crítico en la fisiología, asegurando la perfusión efectiva de los tejidos en condiciones cambiantes. La disfunción microvascular se asocia con innumerables afecciones, incluyendo la morbilidad cardiovascular y mortalidad a largo plazo, el desarrollo de la demencia y la enfermedad tanto del hígado como del riñón y, por lo tanto, es un factor clave de interés en una amplia gama de investigaciones biomédicas1,2,3,4,5. Mientras que se han utilizado múltiples técnicas para evaluar la perfusión tisular, sólo la microscopía intravital permite la recopilación de datos a la resolución temporal y espacial necesaria para caracterizar el flujo sanguíneo a nivel de capilares individuales.
El flujo microvascular se puede visualizar en microscopía de fluorescencia ya sea por el movimiento de microesferas fluorescentes o por el movimiento de glóbulos rojos en el fondo de marcadores fluorescentes impermeant de membrana (por ejemplo, dextran o albúmina con etiqueta fluorescente)6,7. El flujo microvascular se puede fotografiar en capas celulares superficiales utilizando microscopía de campo ancho, o a profundidad mediante microscopía confocal o multifotona. Sin embargo, los caudales capilares son tales que el paso de glóbulos rojos generalmente no se puede capturar a velocidades inferiores a 60 fotogramas/s. Dado que la mayoría de los microscopios confocales y multifotónicos de escaneo láser requieren 1–5 s para escanear un campo de imagen completo, esta velocidad generalmente se puede lograr sólo limitando el campo de visión, a veces a una sola línea de escaneo8. El proceso de limitar las mediciones a segmentos capilares seleccionados (1) tiene el potencial de introducir sesgo de selección y (2) hace imposible capturar la heterogeneidad espacial y temporal en las tasas de flujo sanguíneo capilar. Por el contrario, las imágenes de redes capilares se pueden recoger a velocidades superiores a 100 fps utilizando microscopios digitales de campo ancho equipados con cámaras científicas complementarias complementarias de semiconductores de óxido metálico (sCMOS)9,10. Estos sistemas baratos, comunes en los laboratorios biomédicos típicos, permiten crear imágenes del flujo microvascular a través de redes bidimensionales enteras, esencialmente de forma continua. El problema se convierte entonces en encontrar un enfoque de análisis que sea capaz de extraer datos cuantitativos significativos de los conjuntos de datos de imágenes masivos y complejos generados por la microscopía de vídeo de alta velocidad.
Para permitir el análisis de los datos de flujo de campo completo hemos desarrollado STAFF, un novedoso software de análisis de imágenes que puede medir continuamente el flujo microvascular a través de campos de microscopio completos de series de imágenes recopiladas a alta velocidad11. El enfoque es compatible con una variedad de diferentes sistemas experimentales y modalidades de imagen y el software de análisis de imágenes STAFF se implementa como un conjunto de herramientas macro para la implementación FIJI de ImageJ12. El principio subyacente utilizado aquí para visualizar el flujo microvascular es que, en primer lugar, se debe proporcionar cierto contraste para poder tomar imágenes de los glóbulos rojos dentro de los capilares. En nuestros estudios, el contraste es proporcionado por una sonda fluorescente a granel que es excluida por los glóbulos rojos. La velocidad del flujo se puede cuantificar a partir del desplazamiento de los glóbulos rojos que aparecen como una mancha negativa dentro del plasma etiquetado fluorescentemente en imágenes recogidas a alta velocidad de un animal vivo8. A continuación, utilizamos STAFF para hacer parcelas de distancia a lo largo de cada segmento capilar en múltiples intervalos de tiempo llamados kymographs, luego detectamos las pendientes presentes en loskymographs 13,y a partir de esas pendientes calcular las tasas de flujo microvascular. El enfoque se puede aplicar a las imágenes recogidas desde cualquier lecho capilar al que se pueda acceder para obtener imágenes. Aquí describimos la aplicación de IVM y STAFF a los estudios de flujo sanguíneo en el hígado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1020px;" width="1021">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">#5 forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:120px;">11251-20</td>
			<td style="width:431px;">Dumont #5 Inox Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:211px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>male 9-12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Cannula</td>
			<td style="width:211px;">Instech</td>
			<td style="width:120px;">BTPE-10</td>
			<td>Polyethylene Tubing .011x.024in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CMOS camera</td>
			<td style="width:211px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:120px;">C11440-42U30</td>
			<td>4.0LT Scientific CMOS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Coverslip-bottomed dish</td>
			<td style="width:211px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>WillCo Dish glass bottom GWST5040</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fiji ImageJ Image analysis software</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fluorescein dextran</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher, Invitrogen</td>
			<td style="width:120px;">D1822</td>
			<td>Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Gauze sponge</td>
			<td style="width:211px;">Fisher</td>
			<td>22-415-504</td>
			<td>2x2 inch Dukal sterile gauze sponges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Heating pad</td>
			<td style="width:211px;">Reptitherm</td>
			<td style="width:120px;">RH-4</td>
			<td>between mouse and stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Heating pad</td>
			<td style="width:211px;">Sunbeam</td>
			<td>000732-500-000U</td>
			<td>over mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>Nikon TiE inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Isis Rodent electric shaver</td>
			<td style="width:211px;">Braun Aesculap</td>
			<td style="width:120px;">GT420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:211px;">Abbott GmbH</td>
			<td style="width:120px;">PZN4831850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Luer stub adapter</td>
			<td style="width:211px;">Fisher</td>
			<td>14-826-19E</td>
			<td>Catheter adapter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Micro scissors</td>
			<td>Castro Viejo</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Microscope objective</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Needle</td>
			<td style="width:211px;">Fisher</td>
			<td></td>
			<td>30 Ga.x1/2&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Needle holder</td>
			<td style="width:211px;">Olsen-Hegar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Objective heater</td>
			<td style="width:211px;">BioScience Tools</td>
			<td style="width:120px;">MTC-HLS-025</td>
			<td>Temperature controller with objective heater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Rectal thermometer</td>
			<td style="width:211px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:120px;">TH-5A</td>
			<td>Mouse Body Temperature monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">STAFF macros</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>https://github.com/icbm-iupui/STAFF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Suture string</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td style="width:120px;">723288</td>
			<td>silk black suture, 6-0, spool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial temporal analysis of fieldwise flow in microvasculature

Los cambios en la velocidad y distribución del flujo sanguíneo son vitales para mantener la perfusión de tejidos y órganos en respuesta a las diferentes necesidades celulares. Además, la aparición de defectos en la microcirculación puede ser un indicador principal en el desarrollo de múltiples patologías. Los avances en la imagen óptica han hecho de la microscopía intravital (IVM) un enfoque práctico, permitiendo la toma de imágenes a nivel celular y subcelular en animales vivos a alta velocidad en el tiempo. Sin embargo, a pesar de la importancia de mantener una perfusión de tejido adecuada, rara vez se documenta la variabilidad espacial y temporal en el flujo capilar. En el enfoque estándar, se elige un pequeño número de segmentos capilares para la toma de imágenes durante un tiempo limitado. Para cuantificar exhaustivamente el flujo capilar de una manera imparcial, desarrollamos el Análisis Temporal Espacial del Flujo Fieldwise (STAFF), una macro para el software de análisis de imágenes de código abierto fiji. Utilizando secuencias de imágenes de alta velocidad de campos completos de flujo sanguíneo dentro de los capilares, STAFF produce imágenes que representan movimiento a lo largo del tiempo llamados kymographs para cada intervalo de tiempo para cada segmento vascular. A partir de los kymographs, STAFF calcula las velocidades a partir de la distancia a la que se mueven los glóbulos rojos a lo largo del tiempo y genera los datos de velocidad como una secuencia de mapas espaciales codificados por colores para la visualización y la salida tabular para análisis cuantitativos. En los hígados de ratón normales, STAFF analiza las diferencias profundas cuantificadas en la velocidad de flujo entre las regiones pericentrales y periportal dentro de los lóbulos. Aún más inesperadas son las diferencias en la velocidad de flujo que se ven entre los sinusoides que están lado a lado y las fluctuaciones que se ven dentro de segmentos vasculares individuales durante segundos. STAFF es una nueva herramienta poderosa capaz de proporcionar nuevos conocimientos al permitir la medición de la compleja dinámica espaciotemporal del flujo capilar.

El análisis de personal genera un censo completo de velocidades microvasculares en campos de microscopio según el período de tiempo que se extiende de segundos a minutos. Los resultados representativos se presentan en la Figura 1, la Figura 2, la Figura 3y la Figura 4. La Figura 1 muestra un ejemplo de una serie temporal de la red microvascular en el hígado de un ratón...

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Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature

Para cuantificar el flujo microvascular a partir de secuencias de imágenes de flujo capilar de alta velocidad, desarrollamos el software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). A lo largo del campo de imagen completo y a lo largo del tiempo, STAFF evalúa las velocidades de flujo y genera una secuencia de mapas espaciales codificados por colores para la visualización y la salida tabular para análisis cuantitativos.

Análisis temporal espacial del flujo de campo en la microvasculatura

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, ...

Dado que el flujo microvascular varía entre capilares y cambios a lo largo de un tiempo de segundos, se necesita un método para la cuantificación continua del flujo en campos enteros. El personal permite una medición casi continua de las velocidades de flujo en campos de microscopio completos, en cuestión de horas, que de otro modo tardarían meses en obtenerse manualmente. Aunque estos procedimientos son sencillos, la demostración visual ayudará significativamente a los nuevos usuarios a navegar por el personal por primera vez.Para utilizar TrakEM2 para definir la red vascular, seleccione primero Archivo, Nuevo y TrakEM2 en blanco para configurar un nuevo proyecto TrakEM2 en blanco y seleccione la nueva carpeta que contiene la imagen única de la película como carpeta del proyecto. Se abrirán las ventanas TrakEM2. Haga clic con el botón derecho en el área de trabajo principal y seleccione Importar e importar imagen.Navegue hasta la única imagen guardada y seleccione la imagen. Haga clic con el botón derecho en el área de trabajo principal de nuevo y seleccione Mostrar y Cambiar el tamaño automático de Canvas/LayerSet. A continuación, haga clic con el botón izquierdo en la ventana de trabajo principal.La imagen rellenará el área de trabajo. Para seleccionar las áreas de la imagen que contienen la red vascular, en la ventana TrakEM2 más pequeña, haga clic con el botón derecho en la plantilla Cualquier cosa y seleccione Agregar nueva lista secundaria y de área. En la ventana TrakEM2 más pequeña, arrastre la plantilla Anything a Project Objects, proyecto sin título.A continuación, arrastre la plantilla Cualquier cosa, lista de áreas, a Objetos de proyecto, proyectos sin título, Cualquier cosa. En Objetos de proyecto, proyecto sin título, ahora estará presente la lista de áreas Cualquier cosa. En la ventana principal de TrakEM2, en la pestaña Espacio Z, se habrá creado una barra con la etiqueta Lista de áreas.Haga clic para seleccionar la lista. En la ventana principal de TrakEM2, seleccione la herramienta de pincel y haga clic en Mayús mientras rueda la rueda del ratón para seleccionar un tamaño de pincel menor que el diámetro de la vasculatura de interés. Presione Control S para guardar el proyecto.Con la herramienta de pincel, pinte la red vascular, excluyendo las regiones fuera de foco. Cuando finalice el etiquetado, haga clic con el botón derecho en la ventana principal de TrakEM2 y seleccione Exportar y listas de áreas como etiquetas. En la ventana emergente, seleccione Escala, 100% y exporte toda la lista de áreas.Cierre las ventanas TrakEM2 y seleccione Sí para guardar el proyecto. La imagen de la lista de áreas se abrirá y puede aparecer como una imagen en blanco y negra. En el menú principal de Fiji, seleccione Imagen, Ajustar y Brillo/Contraste.En la ventana Brillo y contraste, haga clic en Automático y la lista de áreas se hará visible. En el menú principal de Fiji, seleccione Imagen, Tablas de búsqueda e Invertir tabla de búsqueda. Guarde esta imagen de etiquetas negras sobre fondo blanco como un archivo t-i-f y cierre la imagen.Abra el archivo Etiquetas en Fiji y seleccione Plugins, Skeleton y Skeleton Eyes. A continuación, guarde la imagen De Skeleton Eyes como un archivo t-i-f. Para crear un nuevo proyecto de personal, seleccione Plugins, Macros y Abrir/Crear proyecto y siga las indicaciones para crear o actualizar un archivo de configuración.En el menú Abrir/Crear proyecto, desplácese hasta la carpeta Archivo de entrada del directorio del proyecto y los archivos Entrada película y Esqueleto. Introduzca los valores de la velocidad máxima medida, la velocidad máxima asignada, la longitud mínima del segmento, el tamaño de píxel y la velocidad de fotogramas. Marque la casilla corrección de parpadeo si las imágenes tienen parpadeo periódico de intensidad de fondo y haga clic en Aceptar. Ajuste los parámetros para la mejor visualización de los datos.Establezca la velocidad máxima asignada para incluir aproximadamente el 95 por ciento de los datos, de modo que los datos se asignen en todo el rango de la escala de colores. Para analizar el esqueleto, seleccione Plugins, Macros y Analizar esqueleto. El archivo esqueleto se abrirá y el administrador de la región de interés se abrirá y ejecutará.En el Administrador de regiones de interés, haga clic en Mostrar todo y etiquetar y haga clic en Aceptar. Para seleccionar los intervalos de tiempo, seleccione Plugins, Macros y Editar intervalos de tiempo y espere a que la macro genere un cifógrafo a partir de un único segmento durante el tiempo total de la película. Utilice las teclas Control más y menos para aumentar el tamaño del cifógrafo según sea necesario y utilice la herramienta de selección Rectángulo para dibujar un rectángulo alrededor de cada intervalo de tiempo. Pulse la tecla T o haga clic en el botón Agregar para grabar una selección de intervalo de tiempo y repetir la selección durante tantos intervalos de tiempo como desee.Para evaluar las opciones de parámetros, seleccione de tres a cuatro intervalos de tiempo y complete el análisis solo para esos intervalos. Haga clic en Aceptar cuando se haya completado la selección del intervalo de tiempo. Aparecerá una ventana emergente cuando se hayan guardado los intervalos seleccionados en la carpeta del proyecto.Haga clic en Aceptar. Para analizar el flujo, seleccione Plugins, Macros y Analizar flujo. El cuadro de diálogo Analizar parámetros de flujo se abrirá y mostrará los valores introducidos en el paso Abrir/Crear proyecto. Edite estos valores si es necesario y haga clic en Aceptar. El cuadro de diálogo Nombres de archivo de salida se abrirá y mostrará los nombres introducidos en el paso Abrir/Crear proyecto.Edite estos nombres según sea necesario y haga clic en Aceptar para iniciar el análisis de flujo. Cuando aparezca un cuadro de diálogo que indica que se ha analizado el flujo, haga clic en Aceptar para almacenar los resultados del análisis en archivos de hoja de cálculo CSV. Para generar mapas espaciales, seleccione Plugins, Macros y Produce Spatial Map.Se abrirá la ventana Parámetros de mapa espacial que muestra los valores introducidos en el paso Abrir/Crear proyecto. Edite estos valores según sea necesario y haga clic en Aceptar. Se generará una secuencia temporal de mapas espaciales de velocidades de flujo con cada color que indica una velocidad de flujo. Desplácese por la pila generada de una imagen por intervalo para visualizar las variaciones espaciales y temporales en el flujo y guarde la pila como un archivo a-v-i para compartir el archivo como una película.El análisis del personal genera el censo completo de las velocidades microvasculares en campos enteros del microscopio, durante períodos de tiempo que se extienden de segundos a minutos. Por ejemplo, utilizando una sola imagen en esta serie temporal de la red microvascular en el hígado de un ratón, la imagen esqueletizada generada se utilizó para definir el eje del flujo microvascular, permitiendo identificar el mapa generado por el pentagrama de segmentos vasculares individuales para la cuantificación posterior del flujo. A partir de los segmentos vasculares individuales generados a partir de la imagen esqueletizada, se pueden generar cifógrafos que representan la intensidad a lo largo de cada segmento de línea a lo largo del tiempo.Los intervalos de tiempo Esqueleto y Suministro de usuario se pueden utilizar para dividir el cifógrafo de cada segmento en intervalos de tiempo de segmento individuales. A continuación, el pentagrama identifica el ángulo predominante en el cifógrafo de cada intervalo de tiempo de segmento y proporciona las mediciones de velocidad calculadas como archivos de datos CSV. La salida CSV del pentagrama se puede utilizar para analizar la distribución de velocidad general para permitir el trazado de la velocidad en los segmentos vasculares individuales a lo largo del tiempo.Y se puede visualizar como pilas de imágenes de mapa de velocidad codificadas por colores. Tenga en cuenta que los resultados que provienen del personal dependen de la calidad de la serie de imágenes, con respecto a la estabilidad de la muestra, la velocidad de fotogramas, la resolución y la relación señal-ruido. Las salidas del mapa de velocidad del pentagrama permiten una exploración intuitiva de los patrones de flujo espacial, mientras que las salidas CSV del pentagrama permiten el análisis estadístico de las velocidades de flujo, tanto dentro como entre los grupos de tratamiento.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Investigación

Bioingeniería

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Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

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Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

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Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

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