Name: quantitative measurement of intrathecally synthesized proteins in mice
Uploaded: 2019-11-29T13:00:00
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लेखक इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल चूहों की अपनी विशेषज्ञ देखभाल के लिए डार्टमाउथ में तुलनात्मक चिकित्सा और अनुसंधान (CCMR) के लिए केंद्र के कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करते हैं । बोर्नस्टीन रिसर्च फंड ने इस शोध को वित्त पोषित किया ।

डार्टमाउथ में गीसेल स्कूल ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा समीक्षा और अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करता है।
1. तरल पदार्थों का संग्रह
नोट: सीरम औ?...

<ol>
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R., Li, L., Gilli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+biomarkers+in+central+nervous+system+tissue+and+cerebrospinal+fluid+in+the+Theiler's+virus+model+mirror+those+in+multiple+sclerosis.">Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis.</a> Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).</li><li>Gerbi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+concentration+in+the+arterial+and+venous+renal+blood+serum+of+the+rabbit.">Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. 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सीएसएफ प्रोटीन सांद्रता के मूल्यांकन के लिए मात्रात्मक तरीके सीएनएस के शारीरिक और रोग राज्य के लक्षण वर्णन में उपयोगी उपकरण हैं। हालांकि, सीएसएफ प्रोटीन के स्तर के विश्वसनीय मात्राकरण से परे, सीएसएफ...

मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के आसपास एक स्पष्ट और बेरंग तरल सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (सीएसएफ) महान नैदानिक और बुनियादी वैज्ञानिक महत्व रखता है। सीएसएफ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के इलेक्ट्रोलाइटिक वातावरण को बरकरार रखता है, प्रणालीगत एसिड-आधार स्थिति को संतुलित करता है, न्यूरोनल और ग्लियल कोशिकाओं को पोषक तत्वों की आपूर्ति करता है, सीएनएस के लिए एक लिम्फेटिक सिस्टम के रूप में कार्य करता है, और सीएनएस1में हार्मोन, न्यूरोट्रांसमीटर, साइटोकिन्स और अन्य न्यूरोपेप्टाइड्स का परिवहन करता है। इस प्रकार, चूंकि सीएसएफ संरचना सीएनएस की गतिविधि को दर्शाती है, यह तरल पदार्थ एक मूल्यवान प्रदान करता है, हालांकि अप्रत्यक्ष रूप से, सीएनएस के शारीरिक और रोग राज्य की विशेषता के लिए पहुंच।
सीएसएफ का उपयोग उन स्थितियों का निदान करने के लिए किया गया है जो सौ से अधिक वर्षों तक सीएनएस को प्रभावित करती हैं, और अधिकांश समय के लिए, इसका मुख्य रूप से चिकित्सकों द्वारा एक नैदानिक उपकरण के रूप में अध्ययन किया गया था। हालांकि, हाल के वर्षों में न्यूरोबायोलॉजिस्ट ने सीएनएस के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए सीएसएफ की क्षमता को पहचाना है। विशेष रूप से, सीएसएफ की प्रोटीन संरचना के विस्तृत अध्ययन की अनुमति देने वाले तंत्रिका विज्ञान दायरे में कई उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन विश्लेषण उपकरण पेश किए गए हैं, इस उम्मीद के साथ कि यह विश्लेषण गतिशील परिवर्तनों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद कर सकता है सीएनएस के भीतर होने वाली।
ल्यूमिनेक्स और सिमोआ टेक्नोलॉजीज2,3जैसी मल्टीप्लेक्स इम्यूनोसे तकनीकों में तकनीकी विकास आज शोधकर्ताओं को बहुत कम सांद्रता पर सैकड़ों प्रोटीन का पता लगाने की क्षमता प्रदान करते हैं। इसके अलावा, ये एक ही प्रौद्योगिकियां छोटे नमूना मात्रा के उपयोग की अनुमति देती हैं, जिससे चूहों सहित छोटे जानवरों में अध्ययन को बढ़ावा मिलता है, जिसमें सीएसएफ के सीमित नमूना मात्रा ने हाल ही में जब तक तरल पदार्थ के विस्तृत लक्षण ों को पहले से ही किया है।
फिर भी, एक चेतावनी यह है कि सीएसएफ में मापा प्रोटीन एक क्षतिग्रस्त रक्त मस्तिष्क इंटरफेस (BBI) के कारण सीरम से इंट्राथेकल संश्लेषण और/या ट्रांसड्यूेशन से प्राप्त हो सकता है । दुर्भाग्य से, अकेले सीएसएफ का प्रोटीन विश्लेषण केवल इन दो घटकों का योग निर्धारित कर सकता है। ट्रांसड्यूडेट और इंट्राथेकैली उत्पादित प्रोटीन के बीच भेदभाव करने के लिए, सीएसएफ प्रोटीन माप किसी भी उपलब्ध प्रोटीन विश्लेषण उपकरण का उपयोग करसीरम सांद्रता में व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के साथ-साथ बाधा अखंडता के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। हालांकि, हालांकि इस समायोजन का उपयोग आमतौर पर नैदानिक अभ्यास में किया जाता है, उदाहरण के लिए, सीएसएफ आईजीजी इंडेक्स, जिसमें इंट्राथेकल आईजीजी संश्लेषण4,5,6का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता है, आज तक बहुत कम शोध अध्ययनों ने सीआरएफ प्रोटीन सांद्रता को सीरम एकाग्रता और बाधा अखंडता7,8के लिए सही किया है।
वर्तमान में, रेबर्गराम दृष्टिकोण प्रोटीन के बाधा समारोह और इंट्राथेकल संश्लेषण को निर्धारित करने का सबसे अच्छा तरीका है। यह सीएसएफ/सीरम भागफल आरेख में एक चित्रमय मूल्यांकन है जो एक एकीकृत तरीके से, बाधा (डीआईएस) कार्य और इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण दोनों का विश्लेषण करता है, जो विशेष रूप से रक्त-व्युत्पन्न प्रोटीन9,10का जिक्र करता है । अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन एल्बुमिन आमतौर पर संदर्भ प्रोटीन के रूप में चुना जाता है क्योंकि यह केवल जिगर में उत्पादित होता है और क्योंकि इसका आकार, लगभग 70 केडीए, छोटे और बड़े प्रोटीन11के बीच मध्यवर्ती होता है। विश्लेषण आरेख को पहली बार 1 9 87 में रीबर और फेल्गेनहॉयर द्वारा इम्यूनोग्लोबुलिन (आईजीएस)11की प्रमुख कक्षाओं के लिए परिभाषित किया गया था, जो हजारों मानव नमूनोंकेविश्लेषण से प्राप्त परिणामों के आधार पर अनुभवजन्य रूप से 9। बाद में आणविक प्रसार/प्रवाह दर12के सिद्धांत में प्रसार के दो Fick कानूनों के आवेदन से इस दृष्टिकोण की पुष्टि की गई । इस तरह के सिद्धांत से यह दर्शाता है कि बाधा के माध्यम से प्रोटीन के प्रसार में हाइपरबोलिक वितरण होता है और यह सीएनएस9,13में प्रोटीन की गतिशीलता को मात्रात्मक रूप से समझा सकता है । कुल मिलाकर, इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण का प्रदर्शन करने के लिए रीबर्गराम का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह समवर्ती रूप से प्रोटीन अंश की पहचान करता है जो सीआरएफ से सीएसएफ में प्रवेश करता है और साथ ही स्थानीय उत्पादन के कारण सीएसएफ में पाए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा भी।
वर्तमान लेख और संबंधित प्रोटोकॉल पूरी प्रक्रिया का वर्णन, सीएसएफ और रक्त संग्रह से अंतिम गणना के लिए सीएसएफ प्रोटीन के स्तर को सही, तंत्रिका विज्ञान के माउस मॉडल में इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण के मात्रात्मक माप के लिए विकारों. यह प्रक्रिया एक आधार रेखा प्रदान करती है जिसके खिलाफ किसी भी सीएसएफ प्रोटीन की रोगविज्ञानी उत्पत्ति का आकलन (1) और बाधा अखंडता की स्थिरता और कार्यात्मक महत्व ( 2) प्रदान करता है। यह प्रक्रिया और प्रोटोकॉल न केवल माउस सीएसएफ नमूनों का आकलन करने के लिए उपयोगी हैं बल्कि न्यूरोलॉजिकल रोगों और मानव रोगियों के पशु मॉडलों की एक भीड़ में सीएसएफ का विश्लेषण करने में भी उपयोगी हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1484px;" width="1482">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">1 mL insulin syringe</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">329650</td>
			<td style="width:847px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">329622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">25 gauge needle</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">309582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">30 gauge insulin needle</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Absorbent pads</td>
			<td style="width:184px;">Any suitable brand</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">BioPlex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;">171020100</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">BioPlex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;">171015001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">BioPlex Pro Flat Bottom Plates</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;">171025001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Biotinilated detection antibody</td>
			<td style="width:184px;">Any suitable source</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td style="width:184px;">PAR Pharmaceutical</td>
			<td style="width:127px;">NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Capillary Tubes</td>
			<td style="width:184px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:127px;">B100-75-10</td>
			<td>OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Centrifuge tube, 0.2 mL</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Centrifuge tube, 0.5 mL</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">87003-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Centrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Chlorhexidine diacetate</td>
			<td style="width:184px;">Nolvasan</td>
			<td style="width:127px;">E004272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Disposable pipettes tips</td>
			<td style="width:184px;">Any suitable brand</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Ear bars</td>
			<td style="width:184px;">KOPF Instruments</td>
			<td style="width:127px;">1921 or 1922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Ethanol</td>
			<td style="width:184px;">Kopter</td>
			<td style="width:127px;">V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Freezer</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">VWR32086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Gauze</td>
			<td style="width:184px;">Medline</td>
			<td style="width:127px;">NON25212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Heating pad</td>
			<td style="width:184px;">Sunbeam</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Induction Chamber</td>
			<td style="width:184px;">VETEQUIP</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td style="width:127px;">NDC 14043-704-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Ketamine (KetaVed)</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagPlex Microspheres (antibody-coupled)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:847px;">Antibody-coupled magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Microplate Shaker</td>
			<td style="width:184px;">Southwest Scientific</td>
			<td>SBT1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Microretractors</td>
			<td style="width:184px;">Carfill Quality</td>
			<td style="width:127px;">ACD-010</td>
			<td>Blunt - 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Microsoft Office (Excel)</td>
			<td style="width:184px;">Microsoft</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel</td>
			<td style="width:184px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:127px;">MGAMMAG-300K</td>
			<td>Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mouse Albumin capture ELISA kit</td>
			<td style="width:184px;">Novus Biological</td>
			<td style="width:127px;">NBP2-60484</td>
			<td>Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Non-Sterile swabs</td>
			<td style="width:184px;">MediChoice</td>
			<td style="width:127px;">WOD1002</td>
			<td>Need to be autoclaved for sterility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Oxygen</td>
			<td style="width:184px;">AIRGAS</td>
			<td style="width:127px;">OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Pasteur Pippettes</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:127px;">13-678-20A</td>
			<td>5 &#38; 3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet</td>
			<td style="width:127px;">8695G</td>
			<td>P-3 Reverse Cutting, 18&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">PE-Streptavidin</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">554061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Pipetters</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">Research seriers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:184px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:127px;">ALLEGRA X-12R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Scale</td>
			<td style="width:184px;">Uline</td>
			<td style="width:127px;">H2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Scalpel</td>
			<td style="width:184px;">Feather</td>
			<td style="width:127px;">EF7281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Shaver</td>
			<td style="width:184px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:127px;">52-5204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Standard proteins</td>
			<td>Any suitable source</td>
			<td></td>
			<td>The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:184px;">KOPF Instruments</td>
			<td style="width:127px;">Model 900LS</td>
			<td>Standard Accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Sterile 1 x PBS</td>
			<td style="width:184px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:127px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Sterile saline</td>
			<td style="width:184px;">Baxter</td>
			<td style="width:127px;">0338-0048-02</td>
			<td>0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Surgical Forceps Curved, 7 (2)</td>
			<td style="width:184px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:127px;">11271-30</td>
			<td>Dumont</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:184px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:127px;">14094-11</td>
			<td>Stainless 25x</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Vaporizer + Flow meter</td>
			<td style="width:184px;">Moduflex Anhestesia Instruments</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Vortex</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Warming pad</td>
			<td style="width:184px;">Kent Scientific Corporation</td>
			<td style="width:127px;">RT-JR-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Water Sonicator</td>
			<td style="width:184px;">Cole Parmer</td>
			<td>EW-08895-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xylazine</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of intrathecally synthesized proteins in mice

मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में पाया जाने वाला तरल पदार्थ सेरेब्रोस्पाइनल फ्लूइड (सीएसएफ) बुनियादी और नैदानिक विज्ञान दोनों के लिए बहुत महत्वरखपूर्ण है। सीएसएफ प्रोटीन संरचना का विश्लेषण बुनियादी तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के साथ-साथ न्यूरोलॉजिकल रोगों में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है। एक चेतावनी यह है कि सीएसएफ में मापा गया प्रोटीन सीरम से इंट्राथेकल संश्लेषण और ट्रांस्युरेशन दोनों से प्राप्त हो सकता है, और सीएसएफ का प्रोटीन विश्लेषण केवल इन दो घटकों का योग निर्धारित कर सकता है। रक्त और इंट्राथेकैली से प्रोटीन ट्रांसुएशन के बीच भेदभाव करने के लिए पशु मॉडल ों के साथ-साथ मनुष्यों में प्रोटीन का उत्पादन किया जाता है, पारंपरिक प्रोटीन विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करके सीएसएफ प्रोटीन प्रोफाइलिंग मापमें एल्बुमिन सीएसएफ/सीरम भागफल (क्यूएल्बुमिन),रक्त-मस्तिष्क इंटरफेस (बीबीआई) की अखंडता का एक मार्कर, और प्रोटीन इंडेक्स (क्यूप्रोटीन/क्यूएल्बुमिन),इंट्राथेलिन प्रोटीन का अनुमान शामिल होना चाहिए । यह प्रोटोकॉल न्यूरोलॉजिकल विकारों के माउस मॉडल में इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण और बीबीआई हानि के मात्रात्मक माप के लिए सीएसएफ और रक्त संग्रह से लेकर भागफल और सूचकांकों की गणना तक पूरी प्रक्रिया को दर्शाता है।

इस प्रतिनिधि प्रयोग के उद्देश्य से कई काठिन्य (एमएस) के दो चिकित्सकीय प्रासंगिक कृंतक मॉडलों में आईजीजी के इंट्राथेकल संश्लेषण की तुलना करना है: पीएलपी139-151-प्रेरितप्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफेल?...

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Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

ऊंचा रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ प्रोटीन का स्तर या तो एक बदल रक्त मस्तिष्क बाधा या इंट्राथेकल संश्लेषण भर में प्लाज्मा प्रोटीन के प्रसार का परिणाम हो सकता है । इस लेख में एक अनुकूलित परीक्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है जो दोनों मामलों को भेदभाव करने में मदद करता है और इंट्राथेकैली संश्लेषित प्रोटीन के मात्रात्मक माप प्रदान करता है।

चूहों में इंट्राथेकैली संश्लेषित प्रोटीन का मात्रात्मक माप

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

यह प्रोटोकॉल सीएसएफ प्रोटीन के स्तर के मात्रात्मक सुधार में सीएसएफ और रक्त संग्रह को न्यूरोलॉजिकल विकारों के माउस मॉडल में एक थेकल प्रोटीन संश्लेषण में मापने की अनुमति देता है। यह प्रक्रिया एक आधार रेखा प्रदान करती है, जिसके खिलाफ सीएसएफ प्रोटीन की पैथोफिजियोलॉजिकल उत्पत्ति, और रक्त सीएसएफ एहसान अखंडता की स्थिरता और कार्यात्मक महत्व का आकलन किया जा सकता है। इंटरथेकल प्रोटीन संश्लेषण और बाधा अखंडता का विश्लेषण अन्य पशु मॉडल और मानव अध्ययन पर लागू किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रोगों की जांच करने के लिए। स्वच्छ सीएसएफ की महत्वपूर्ण मात्रा एकत्र करना चूहों में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है, इसलिए जब तक अदूषित नमूने की बड़ी मात्रा प्राप्त नहीं की जा सकती तब तक तकनीक का अभ्यास करने की सलाह दी जाती है। प्रक्रियाओं का प्रदर्शन मिचेल लिंज़ी, डार्टमाउथ में प्रयोगात्मक और आणविक चिकित्सा में कार्यक्रम से एक स्नातक छात्र, हमारे नए इम्यूनोलॉजी अनुसंधान समूह में होगा ।रेट्रो कक्षीय रक्तस्राव के माध्यम से सीरम संग्रह के लिए। 15 ग्राम से अधिक एनेस्थेटाइज्ड माउस में पेडल पलटा के जवाब की कमी की पुष्टि करने के बाद, अंगूठे और गैर प्रमुख हाथ की तर्जनी के साथ कान के पीछे ढीली त्वचा को समझें, और आंखों के ऊपर त्वचा को वापस खींचने के लिए इंडेक्स फिंगर का उपयोग करें। आंखों के नीचे त्वचा को वापस खींचने के लिए अंगूठे का उपयोग करना, उंगलियों के बीच पिपेट घुमाते हुए, आंखों के सॉकेट के बीच की ओर निर्देशित, आंखों की पुतली के नीचे आंखों के सॉकेट में लगभग 45 डिग्री कोण पर आयोजित एक पाश्चर पिपेट की नोक रखें।फिर रक्त को पिपेट में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए संक्षिप्त, कोमल दबाव और रिहाई लागू करें। जब रक्त नमूना एकत्र किया गया है, धीरे से आंख को घायल किए बिना केशिका को हटा दें, और रक्त को 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। पलक को बंद करने के बाद, आगे रक्तस्राव को रोकने के लिए धुंध के साथ हल्का दबाव लागू करें।अपकेंद्रित्र द्वारा नमूना नीचे कताई से पहले कमरे के तापमान पर 30 से ६० मिनट के लिए रक्त थक्का करने के लिए अनुमति दें । एक साफ पिपेट तकनीक का उपयोग करके, अलग सीरम को एक नए, लेबल 500 माइक्रोलीटर शीशी में इकट्ठा करें, और तुरंत सीरम को 80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। पेडल पलटा के जवाब की कमी की पुष्टि करने के बाद, बालों के एक बड़े पर्याप्त क्षेत्र को हटाने के लिए मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ के संग्रह की अनुमति तुरंत एनेस्थेटाइज्ड माउस की खोपड़ी के कौडल अंत में ।बाँझ परिस्थितियों में एक स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस पर एक प्रवण स्थिति में माउस रखें, और कान सलाखों के साथ सिर स्थिर। 30% क्लोरहेक्सीडीन डायसेटेट के साथ सर्जिकल साइट झाड़ू, और एक sagittal त्वचा चीरा cisterna मैग्ना overlying मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए ऑक्सीपुट से कमतर बनाते हैं । संदंश का उपयोग करना, चमड़े के नीचे के ऊतकों और मांसपेशियों को कुंद करना, और सिस्टर्ना मैग्ना पर ड्यूरा मेटर मेनिंगियल परत को बेनकाब करने के लिए मांसपेशियों को पकड़ने के लिए माइक्रो रिट्रैक्टर्स का उपयोग करें।किसी भी संभावित रक्त संदूषण को दूर करने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ ऊतक को धीरे से धोएं, और ड्यूरा मेटर सूखी को दागने के लिए बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करें। सीस्टर्ना मैग्ना में प्रारंभिक पंचर स्थिति प्रचुर मात्रा में, गैर दूषित सीएसएफ प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। एक 30 गेज सुई का उपयोग करना, धीरे-धीरे सिस्टर्ना मैग्ना को कवर झिल्ली पंचर, और जल्दी और धीरे पंचर में एक छोटे से गिलास केशिका ट्यूब डालें।जब सीएसएफ के पांच से 12 माइक्रोलीटर एकत्र किए गए हैं, तो सावधानी से झिल्ली से ट्यूब को हटा दें और ट्यूब को तीन मिलीलीटर सिरिंज से जोड़ने के लिए पॉलीथीन ट्यूबिंग के टुकड़े का उपयोग करें। एकत्र CSF को बर्फ पर एक लेबल 500 माइक्रोलीटर ट्यूब में इंजेक्ट करें, और चीरा बंद करने के लिए डिस्पोजेबल सुई और विभिन्न पॉलीडियोक्सानोन टांके का उपयोग करें। किसी भी सूखे रक्त या ऊतक के क्षेत्र को साफ करें, और माउस को पूर्ण अनुनय तक निगरानी के साथ एक साफ, गर्म पिंजरे में रखें।अपकेंद्रित्र द्वारा सीएसएफ ले लीजिए, और नेत्रहीन गोली का निरीक्षण और रक्त संदूषण के किसी भी संकेत के लिए यह supernate । फिर स्वच्छ पिपेट तकनीक का उपयोग करके, सीएसएफ युक्त सुपरनेट को एक नए 200 माइक्रोलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 80 डिग्री सेल्सियस पर तत्काल भंडारण के लिए पीबीएस के साथ एक से तीन अनुपात में सीएसएफ को पतला करें। कार्डियक पंचर द्वारा सीरम संग्रह के लिए, सीएसएफ संग्रह के तुरंत बाद, जैसा कि अभी प्रदर्शित किया गया है, माउस को रीढ़ की स्थिति में रखें।70% शराब के साथ पेट की त्वचा झाड़ू। वक्ष गुहा को खोलने के लिए कैंची का उपयोग करें, दिल को उजागर करें, और बाएं वेंट्रिकल में 3 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 25 गेज सुई डालें। फिर धीरे-धीरे सिरिंज प्लंजर पर नकारात्मक दबाव लागू करें, रक्त एकत्र होने के बाद सुई को वापस लें।1.5 मिलीलीटर शीशी में एकत्रित रक्त को बाहर निकालने के लिए प्लंजर को दबाना। अब, सीरम को अपकेंद्रित्र द्वारा अलग करने से पहले कमरे के तापमान पर 30 से 60 मिनट तक रक्त को थक्का लगाने दें। फिर, एक साफ पिपेट तकनीक का उपयोग करके, सीरम को 80 डिग्री सेल्सियस पर तत्काल भंडारण के लिए एक नए लेबल 500 माइक्रोलीटर शीशी में स्थानांतरित करें।मिलान सीरम और सीएसएफ नमूनों में लक्ष्य प्रोटीन और एल्बुमन की मात्रा निर्धारित करने के लिए, ब्याज के प्रत्येक प्रोटीन के लिए एक मानक वक्र तैयार करने के लिए संदर्भित मानक प्रोटीन का उपयोग करते हुए, एक मानक प्रोटीन मात्राकरण परख का उपयोग करें। विश्लेषण के बाद, कच्चे डेटा को एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर ग्राफिंग प्रोग्राम में निर्यात करें, और ब्याज के प्रत्येक प्रोटीन के लिए एक मानक वक्र बनाने के लिए मानक प्रोटीन सांद्रता बनाम डिटेक्शन सिग्नल फ्लोरेसेंस तीव्रता को ग्राफ करें। फिर, नमूनों में रुचि के प्रत्येक विश्लेषण की सांद्रता की गणना करने के लिए मानक घटता का उपयोग करें।अंत में, क्यू मूल्यों और इंट्राथेकल इंडेक्स की गणना करने के लिए एल्बमन का उपयोग करें और विश्लेषणांत सांद्रता को लक्षित करें। इसी उम्र से मेल खाने वाले नकली नियंत्रणों की तुलना में मल्टीपल स्केलेरोसिस के दो परीक्षण कृंतक मॉडल के सीएसएफ में कुल आईजीजी के वास्तविक स्तर में काफी वृद्धि हुई है। आर-EAE चूहों काफी बढ़ाया एल्बमन भागफल मूल्यों को दिखाने के लिए, इन चूहों में रक्त मस्तिष्क बाधा की एक वृद्धि की पारगम्यता का संकेत है ।टीएमईवी-आइडी चूहों में एक अक्षुण्ण बाधा के पिछले निष्कर्षों की पुष्टि करते हुए, टीएमईवी-आइडी चूहों के बीच एल्बमन भागफल में कोई अंतर मौजूद नहीं है। इसके अलावा, टीएमईवी-आइडी जानवरों में, काफी अधिक आईजीजी सूचकांक मूल्य और इसलिए, इंट्राथेकल आईजीजी उत्पादन देखा जाता है। प्रोटीन इंडेक्स की गणना न्यूरोइंफ्लामैरेटरी और न्यूरोडीजेनेरेटिव दोनों बीमारियों के लिए प्रारंभिक निदान, परिणाम भविष्यवाणी और रोग पाठ्यक्रम निगरानी के लिए उपयोगी उपन्यास प्रोटीन बायोमार्कर की पहचान की सुविधा प्रदान करती है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

सेंवई और Capellini हैंडलिंग टेस्ट: चूहों और चूहों में निपुण forepaw समारोह के सरल मात्रात्मक उपायों

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

चूहे में ठंड संवेदनशीलता और अनुकूलन के निर्धारण के लिए एक सरल और सस्ता तरीका

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

E8.5 भ्रूण और neurosphere संस्कृतियों में सापेक्ष retinoic एसिड स्तर के मात्रात्मक मापन F9 दुर्लभ lacZ सेल आधारित रिपोर्टर परख का उपयोग

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Electroporation द्वारा कृंतक Sciatic तंत्रिका में श्वान कोशिकाओं को विवो जीन स्थानांतरण में

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

कोशिका-आधारित Luciferase रिपोर्टर परख प्लेटफार्मों में γ-Secretase-मध्यस्थता Amyloid प्रणेता प्रोटीन और पायदान दरार की मात्रात्मक माप

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Drosophila में न्यूरॉनी वृक्ष Arborization जटिलता का मात्रात्मक विश्लेषण

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

मात्रात्मक सेल Neurodegeneration की Drosophila में फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन ImageJ का उपयोग कर के निष्पक्ष विश्लेषण के माध्यम से जीवविज्ञान

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

उत्पादित माउस टिबियल नर्व में न्यूरोफिलमेंट परिवहन की इमेजिंग और विश्लेषण

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

सेरेब्रल कॉर्टेक्स क्षेत्रों की इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफिक रिकॉर्डिंग चूहों में कोफिलिन को लक्षित करने वाले एडेनो-एसोसिएटेड वायरस का उपयोग करके हेरफेर किया गया

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

स्वचालित छवि विश्लेषण का उपयोग कर कृंतक मॉडल के सब्सटेंटिया निग्रा में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन घनत्व का अर्ध-मात्रात्मक निर्धारण

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...