Name: quantitative measurement of intrathecally synthesized proteins in mice
Uploaded: 2019-11-29T13:00:00
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Gli autori ringraziano il personale del Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) di Dartmouth per la cura esperta dei topi utilizzati per questi studi. Il Fondo di Ricerca Bornstein ha finanziato questa ricerca.

Tutto il lavoro sugli animali utilizza protocolli esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Geisel School of Medicine di Dartmouth.
1. Raccolta di fluidi
NOTA: sono necessari sia il siero che il CSF. Due protocolli per ogni raccolta di fluidi sono necessari per la sopravvivenza e necropsia.
<ol><li>Raccolta di siero e CSF con procedure di sopravvivenza NOTA: Per la raccolta dei fluidi di sopravvivenza, la raccolta del ...

<ol>
	<li>Whedon, J. M., Glassey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+stasis+and+its+clinical+significance.">Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance.</a> Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).</li><li>Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. 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B., Gilli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+a+molecular+signature+in+inflammatory+demyelinating+disease.">Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease.</a> Neurology, Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 6 (1), 520 (2019).</li><li>Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+biomarkers+in+central+nervous+system+tissue+and+cerebrospinal+fluid+in+the+Theiler's+virus+model+mirror+those+in+multiple+sclerosis.">Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis.</a> Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).</li><li>Gerbi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+concentration+in+the+arterial+and+venous+renal+blood+serum+of+the+rabbit.">Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. 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Essentials in neurology and psychiatry.</a> Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).</li><li>Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+neopterin+is+brain-derived+and+not+associated+with+blood-CSF+barrier+dysfunction+in+non-inflammatory+affective+and+schizophrenic+spectrum+disorders.">Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders.</a> Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).</li><li>Bromader, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+serum+and+cerebrospinal+fluif+cytokines+in+response+to+non-neurological+surgery:+an+observational+study.">Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).</li><li>Starhof, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+pro-inflammatory+cytokines+differentiate+parkinsonian+syndromes.">Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305 (2018).</li></ol>

I metodi quantitativi per la valutazione delle maggiori concentrazioni di proteine CSF sono strumenti utili per la caratterizzazione dello stato fisiologico e patologico del SNC. Tuttavia, al di là della quantificazione affidabile dei livelli di proteine CSF, il rilevamento delle proteine CSF richiede un'espressione dei risultati che discriminano tra le frazioni derivate dal sangue e il SNC nel CSF. Tuttavia, ad oggi, i saggi di quantificazione delle proteine comunemente utilizzati non consentono la discriminazione tra ...

Il liquido cerebrospinale (CSF), un liquido chiaro e incolore che circonda il cervello e il midollo spinale, ha una grande importanza clinica e scientifica di base. Il CSF conserva l'ambiente elettrolitico del sistema nervoso centrale (CNS), bilancia lo stato di base dell'acido sistemico, fornisce nutrienti alle cellule neuronali e gliali, funziona come sistema linfatico per il SNC e trasporta ormoni, neurotrasmettitori, citochine e altri neuropepti in tutto il CNS1. Così, poiché la composizione csF riflette l'attività del SNC, questo fluido offre un prezioso, anche se indiretto, accesso per caratterizzare lo stato fisiologico e patologico del SNC.
CSF è stato utilizzato per diagnosticare condizioni che colpiscono il SNC per oltre un centinaio di anni, e per la maggior parte di questo tempo, è stato studiato principalmente dai medici come strumento diagnostico. Tuttavia, negli ultimi anni i neurobiologi hanno riconosciuto il potenziale della CSF per studiare la fisiopatologia del SNC. In particolare, nel regno delle neuroscienze sono stati introdotti diversi strumenti di analisi delle proteine ad alto contenuto di velocità, consentendo uno studio dettagliato della composizione delle proteine del CSF, con l'aspettativa che questa analisi possa contribuire a fornire informazioni sui cambiamenti dinamici all'interno del SNC.
Gli sviluppi tecnologici nelle tecniche di immunoanalisi multiplex come le tecnologie Luminex e Simoa2,3, forniscono ai ricercatori oggi la capacità di rilevare centinaia di proteine a concentrazioni molto basse. Inoltre, queste stesse tecnologie consentono l'uso di piccoli volumi di campioni, promuovendo così studi su piccoli animali, compresi i topi, in cui volumi di campioni limitati di CSF hanno impedito caratterizzazioni dettagliate del fluido fino a poco tempo fa.
Tuttavia, un avvertimento è che le proteine misurate in CSF possono derivare da sintesi intrateca e/o trasuda dal siero a causa di un'interfaccia emato-encefalica danneggiata (BBI). Sfortunatamente, l'analisi delle proteine del CSF da sola può determinare solo la somma di questi due componenti. Per distinguere tra proteine prodotte innodate e intratelamente, le misurazioni delle proteine CSF utilizzando qualsiasi strumento di analisi delle proteine disponibile devono essere regolate per la variabilità individuale nelle concentrazioni di siero e l'integrità delle barriere. Tuttavia, anche se questa regolazione è comunemente utilizzata nella pratica clinica, ad esempio, l'indice CSF IgG, che ha un'elevata sensibilità per rilevare la sintesi intrateca IgG4,5,6, ad oggi pochissimi studi di ricerca hanno corretto le concentrazioni di proteine CSF per la concentrazione di siero e l'integrità della barriera7,8.
Attualmente, l'approccio Reibergram è il modo migliore per determinare la funzione di barriera e la sintesi intratecala delle proteine. Si tratta di una valutazione grafica nei diagrammi quoziente CSF/siero che analizza, in modo integrato, sia la barriera (di)funzione che la sintesi delle proteine intrateche, riferendosi a una proteina esclusivamente derivata dal sangue9,10. L'abbondante albumina proteica è solitamente scelta come proteina di riferimento perché è prodotta solo nel fegato e perché la sua dimensione, circa 70 kDa, è intermedia tra proteine piccole e grandi11. Il diagramma di analisi è stato definito per la prima volta da Reiber e Felgenhauer nel 1987 per le principali classi di immunoglobuine (Igs)11, essendo empiricamente basate sui risultati ottenuti dall'analisi di migliaia di campioni umani9. L'approccio è stato successivamente confermato dall'applicazione delle due leggi di diffusione dei due Fick nella teoria della diffusione molecolare/velocità di flusso12. Tale teoria dimostra la diffusione di una proteina attraverso la barriera ha una distribuzione iperbolica e può spiegare quantitativamente la dinamica delle proteine nel CNS9,13. Nel complesso, il vantaggio di utilizzare il Reibergram per dimostrare la sintesi delle proteine intratecali è che identifica contemporaneamente la frazione proteica che entra nel CSF dal siero e la quantità di proteine presenti nel CSF a causa della produzione locale.
Il presente articolo e il relativo protocollo descrivono l'intera procedura, dalla raccolta del CSF e del sangue ai calcoli finali che correggono i livelli di proteine CSF, per la misurazione quantitativa della sintesi delle proteine intrateche in modelli murini di neurologia Disturbi. Questa procedura fornisce una linea di base rispetto alla quale valutare (1) l'origine patofisiologica di qualsiasi proteina CSF e (2) la stabilità e il significato funzionale dell'integrità della barriera. Questa procedura e questo protocollo non sono solo utili per valutare campioni di CSF dei topi, ma sono anche utili nell'analisi della CSF in una moltitudine di modelli animali di malattie neurologiche e pazienti umani.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1484px;" width="1482">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">1 mL insulin syringe</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">329650</td>
			<td style="width:847px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">329622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">25 gauge needle</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">309582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">30 gauge insulin needle</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Absorbent pads</td>
			<td style="width:184px;">Any suitable brand</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">BioPlex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;">171020100</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">BioPlex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;">171015001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">BioPlex Pro Flat Bottom Plates</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;">171025001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Biotinilated detection antibody</td>
			<td style="width:184px;">Any suitable source</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td style="width:184px;">PAR Pharmaceutical</td>
			<td style="width:127px;">NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Capillary Tubes</td>
			<td style="width:184px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:127px;">B100-75-10</td>
			<td>OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Centrifuge tube, 0.2 mL</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Centrifuge tube, 0.5 mL</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">87003-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Centrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Chlorhexidine diacetate</td>
			<td style="width:184px;">Nolvasan</td>
			<td style="width:127px;">E004272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Disposable pipettes tips</td>
			<td style="width:184px;">Any suitable brand</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Ear bars</td>
			<td style="width:184px;">KOPF Instruments</td>
			<td style="width:127px;">1921 or 1922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Ethanol</td>
			<td style="width:184px;">Kopter</td>
			<td style="width:127px;">V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Freezer</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">VWR32086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Gauze</td>
			<td style="width:184px;">Medline</td>
			<td style="width:127px;">NON25212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Heating pad</td>
			<td style="width:184px;">Sunbeam</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Induction Chamber</td>
			<td style="width:184px;">VETEQUIP</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td style="width:127px;">NDC 14043-704-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Ketamine (KetaVed)</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagPlex Microspheres (antibody-coupled)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:847px;">Antibody-coupled magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Microplate Shaker</td>
			<td style="width:184px;">Southwest Scientific</td>
			<td>SBT1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Microretractors</td>
			<td style="width:184px;">Carfill Quality</td>
			<td style="width:127px;">ACD-010</td>
			<td>Blunt - 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Microsoft Office (Excel)</td>
			<td style="width:184px;">Microsoft</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel</td>
			<td style="width:184px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:127px;">MGAMMAG-300K</td>
			<td>Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mouse Albumin capture ELISA kit</td>
			<td style="width:184px;">Novus Biological</td>
			<td style="width:127px;">NBP2-60484</td>
			<td>Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Non-Sterile swabs</td>
			<td style="width:184px;">MediChoice</td>
			<td style="width:127px;">WOD1002</td>
			<td>Need to be autoclaved for sterility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Oxygen</td>
			<td style="width:184px;">AIRGAS</td>
			<td style="width:127px;">OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Pasteur Pippettes</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:127px;">13-678-20A</td>
			<td>5 &#38; 3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet</td>
			<td style="width:127px;">8695G</td>
			<td>P-3 Reverse Cutting, 18&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">PE-Streptavidin</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">554061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Pipetters</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">Research seriers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:184px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:127px;">ALLEGRA X-12R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Scale</td>
			<td style="width:184px;">Uline</td>
			<td style="width:127px;">H2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Scalpel</td>
			<td style="width:184px;">Feather</td>
			<td style="width:127px;">EF7281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Shaver</td>
			<td style="width:184px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:127px;">52-5204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Standard proteins</td>
			<td>Any suitable source</td>
			<td></td>
			<td>The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:184px;">KOPF Instruments</td>
			<td style="width:127px;">Model 900LS</td>
			<td>Standard Accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Sterile 1 x PBS</td>
			<td style="width:184px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:127px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Sterile saline</td>
			<td style="width:184px;">Baxter</td>
			<td style="width:127px;">0338-0048-02</td>
			<td>0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Surgical Forceps Curved, 7 (2)</td>
			<td style="width:184px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:127px;">11271-30</td>
			<td>Dumont</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:184px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:127px;">14094-11</td>
			<td>Stainless 25x</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Vaporizer + Flow meter</td>
			<td style="width:184px;">Moduflex Anhestesia Instruments</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Vortex</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Warming pad</td>
			<td style="width:184px;">Kent Scientific Corporation</td>
			<td style="width:127px;">RT-JR-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Water Sonicator</td>
			<td style="width:184px;">Cole Parmer</td>
			<td>EW-08895-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xylazine</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of intrathecally synthesized proteins in mice

Il liquido cerebrospinale (CSF), un fluido trovato nel cervello e nel midollo spinale, è di grande importanza sia per la scienza di base che clinica. L'analisi della composizione delle proteine CSF fornisce informazioni cruciali nella ricerca sulle neuroscienze di base e sulle malattie neurologiche. Un avvertimento è che le proteine misurate in CSF possono derivare sia dalla sintesi intrateca che dalla trasposizione dal siero, e l'analisi delle proteine del CSF può determinare solo la somma di questi due componenti. Per distinguere tra la trasposizione proteica dal sangue e le proteine prodotte intratelamente nei modelli animali e negli esseri umani, le misurazioni di profilazione delle proteine CSF utilizzando strumenti di analisi delle proteine convenzionali devono includere il calcolo dell'albumina CSF/serum quotient (Qalbumin),un marcatore dell'integrità dell'interfaccia emato-encefalica (BBI), e l'indice proteico(proteinaQ /Qalbumin ), una stima della sintesi di proteine intrateche. Questo protocollo illustra l'intera procedura, dalla raccolta del CSF e del sangue ai calcoli dei quozienti e degli indici, per la misurazione quantitativa della sintesi delle proteine intrateche e la compromissione della BBI nei modelli murini di disturbi neurologici.

Questo esperimento rappresentativo mirava a confrontare la sintesi intratecala di IgG in due modelli di roditori clinicamente rilevanti della sclerosi multipla (MS): il PLP139-151-indotta recissa sperimentale di encefalomiesi (R-EAE) e la progressiva cronica, La malattia demielinante indotta dal virus dell'encefalomielisi del Telemanolio (TMEV-IDD). R-EAE è un modello utile per comprendere la recidiva delle MS, mentre il modello TMEV-IDD è dotato di MS19progressivo cronico.
<p cla...

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Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Livelli elevati di proteine del fluido spinale possono essere il risultato della diffusione della proteina plasmatica attraverso una barriera emato-encefalica alterata o sintesi intratea. In questo articolo viene presentato un protocollo di test ottimizzato che aiuta a discriminare entrambi i casi e fornisce misurazioni quantitative delle proteine sintetizzate intrathecally.

Misurazione quantitativa delle proteine intratecalliamente sintetizzate nei topi

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Questo protocollo consente al CSF e alla raccolta del sangue nella correzione quantitativa dei livelli proteici csf di misurare in una sintesi proteica tecale nei modelli di topo di disturbi neurologici. Questa procedura fornisce una linea di base, contro la quale è possibile valutare l'origine fisiopatologici delle proteine CSF di interesse e la stabilità e il significato funzionale del QCS del sangue favoriscono l'integrità. L'analisi della sintesi intertecale delle proteine e dell'integrità della barriera può essere applicata ad altri modelli animali e studi sull'uomo.Ad esempio, per verificare la presenza di malattie del sistema nervoso centrale. Raccogliere volumi significativi di CSF pulito può essere tecnicamente impegnativo nei topi, quindi si consiglia di praticare la tecnica fino a quando non è possibile ottenere grandi volumi di campione incontaminato. A dimostrare le procedure sarà Micheal Linzey, studente laureato del programma di medicina sperimentale e molecolare al Dartmouth, nel nostro nuovo gruppo di ricerca immunologica.Per la raccolta del siero tramite sanguinamento orbitale retrò. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale in un topo anestetizzato superiore a 15 grammi, afferrare la pelle sciolta dietro le orecchie con il pollice e l'indice della mano non dominante e utilizzare l'indice per disegnare la pelle sopra gli occhi. Usando il pollice per disegnare indietro la pelle sotto gli occhi, posizionare la punta di una pipetta Pasteur, tenuta con un angolo di circa 45 gradi, nella presa degli occhi sotto il bulbo oculare, diretta verso il centro dell'orbita oculare, mentre si ruota la pipetta tra le dita.Quindi applicare una pressione breve e delicata e rilasciare per consentire al sangue di entrare nella pipetta. Una volta raccolto il campione di sangue, rimuovere delicatamente il capillare senza ferire l'occhio e trasferire il sangue in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Dopo aver chiuso la palpebra, applicare una leggera pressione con garza per prevenire ulteriori sanguinamenti.Lasciare coagulare il sangue per 30-60 minuti a temperatura ambiente prima di filare il campione per centrifugazione. Utilizzando una tecnica di pipetta pulita, raccogliere il siero separato in una nuova fiala a 500 microliter etichettata e congelare immediatamente il siero a 80 gradi Celsius. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, rimuovere una superficie di capelli abbastanza ampia da consentire la raccolta del liquido spinale cerebrale immediatamente all'estremità caudale del cranio del topo anestetizzato.Posizionare il mouse in una posizione soggetta a protezione su un dispositivo stereotassico in condizioni sterili e stabilizzare la testa con le barre dell'orecchio. Tamponare il sito chirurgico con il 30% di diacetato di clorexidina e rendere un'incisione cutanea sagittale inferiore all'occipite per esporre i muscoli sovrastano la cisterna magna. Usando le forcep, sezionare contundente il tessuto sottocutaneo e i muscoli e utilizzare micro retrattili per tenere separati i muscoli per esporre lo strato meningeo dura mater sulla cisterna magna.Lavare delicatamente il tessuto con PBS sterile per rimuovere qualsiasi possibile contaminazione del sangue e utilizzare un batuffolo di cotone sterile per asciugare il dura mater. Il posizionamento della puntura iniziale alla cisterna magna è essenziale per ottenere un QCS abbondante e non contaminato. Utilizzando un ago calibro 30, forare delicatamente la membrana che copre la cisterna magna e inserire rapidamente e delicatamente un piccolo tubo capillare in vetro nella puntura.Una volta raccolti da cinque a 12 microlitri di CSF, rimuovere con cura il tubo dalla membrana e utilizzare un pezzo di tubi in polietilene per collegare il tubo a una siringa da tre millilitri. Iniettare il QCS raccolto in un tubo di 500 microliter etichettato su ghiaccio e utilizzare un ago monouso e varie suture di polidioxanone per chiudere l'incisione. Pulire l'area di qualsiasi sangue o tessuto essiccato e posizionare il mouse in una gabbia pulita e calda con monitoraggio fino a piena reclinamento.Raccogliere il CSF per centrifugazione e ispezionare visivamente il pellet e sovrapporlo per eventuali segni di contaminazione del sangue. Quindi, utilizzando la tecnica della pipetta pulita, trasferire il supernato contenente CSF in un nuovo tubo da 200 microliter e diluire il CSF a un rapporto uno o tre con PBS per lo stoccaggio immediato a 80 gradi Celsius. Per la raccolta del siero per puntura cardiaca, subito dopo la raccolta del CSF, come appena dimostrato, posizionare il mouse in posizione supina.Tamponare la pelle addominale con il 70% di alcol. Utilizzare le forbici per aprire la cavità toracica, esponendo il cuore, e inserire un ago calibro 25 attaccato a una siringa da 3 millilitri nel ventricolo sinistro. Quindi applicare delicatamente la pressione negativa allo stantuffo della siringa, ritirando l'ago dopo che il sangue è stato raccolto.Deprimere lo stantuffo per espellere il sangue raccolto in una fiala da 1,5 millilitri. Ora, lasciare coagulare il sangue per 30-60 minuti a temperatura ambiente prima di separare il siero per centrifugazione. Quindi, utilizzando una tecnica di pipetta pulita, trasferire il siero in una nuova fiala a 500 microliter etichettata per una conservazione immediata a 80 gradi Celsius.Per quantificare le proteine bersaglio e l'albumina in campioni di siero e CSF abbinati, utilizzare un saggio standard di quantificazione delle proteine, utilizzando proteine standard referenziate per preparare una curva standard per ogni proteina di interesse. Dopo l'analisi, esportare i dati grezzi in un programma di grafica software appropriato e grafare l'intensità della fluorescenza del segnale di rilevamento rispetto alle concentrazioni proteiche standard per creare una curva standard per ogni proteina di interesse. Quindi, utilizzare le curve standard per calcolare le concentrazioni di ogni alita di interesse nei campioni.Infine, utilizzare le concentrazioni di albume e di aliti target per calcolare i valori Q e l'indice intratecale. I livelli effettivi di IgG totale sono significativamente aumentati nel CSF di due modelli di roditori testati di sclerosi multipla, rispetto ai corrispondenti controlli fittizi abbinati all'età. I topi R-EAE mostrano valori quozienti di albumine significativamente migliorati, indicando una maggiore permeabilità della barriera emiencefalica in questi topi.Al contrario, non esistono differenze nel quoziente di albume tra TMEV-IDD e topi fittizi, a conferma dei precedenti risultati di una barriera intatta nei topi TMEV-IDD. Inoltre, negli animali TMEV-IDD si osservano valori di indice IgG significativamente più elevati e, pertanto, la produzione intrateca di IgG. Il calcolo di un indice proteico facilita l'identificazione di nuovi biomarcatori proteici utili per la diagnosi precoce, la previsione dei risultati e il monitoraggio dei decorso delle malattie sia per le malattie neuroinfiammatorie che neurodegenerative.

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