Name: quantitative measurement of intrathecally synthesized proteins in mice
Uploaded: 2019-11-29T13:00:00
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Os autores agradecem à equipe do Centro de Medicina e Pesquisa Comparativa (CCMR) em Dartmouth por seu cuidado especializado com os camundongos usados para esses estudos. O Fundo de Pesquisa Bornstein financiou esta pesquisa.

Todo o trabalho animal utiliza protocolos revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Geisel School of Medicine em Dartmouth.
1. Coleta de fluidos
NOTA: Tanto o soro quanto o CSF são necessários. Dois protocolos para cada coleta de fluidos são necessários para a sobrevivência e necropsia.
<ol><li>Coleta de soro e CSF usando procedimentos de sobrevivência NOTA: Para a coleta de fluidos de sobrevivência, a coleta de so...

<ol>
	<li>Whedon, J. M., Glassey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+stasis+and+its+clinical+significance.">Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance.</a> Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).</li><li>Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+cerebrospinal+fluid+biomarkers+using+microsphere-based+xMAP+multiplex+technology+for+early+detection+of+Alzheimer's+disease.">Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease.</a> Methods. 56 (4), 484-493 (2012).</li><li>Barro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+biomarker+and+electrophysiological+outcome+measures+for+progressive+MS+trials.">Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials.</a> Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).</li><li>Tourtellotte, W. 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Report from an EFNS task force.</a> European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).</li><li>Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-cerebrospinal+fluid+barrier:+structure+and+functional+significance.">The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance.</a> Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).</li><li>Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. 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B., Gilli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+a+molecular+signature+in+inflammatory+demyelinating+disease.">Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease.</a> Neurology, Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 6 (1), 520 (2019).</li><li>Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+biomarkers+in+central+nervous+system+tissue+and+cerebrospinal+fluid+in+the+Theiler's+virus+model+mirror+those+in+multiple+sclerosis.">Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis.</a> Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).</li><li>Gerbi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+concentration+in+the+arterial+and+venous+renal+blood+serum+of+the+rabbit.">Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. 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Essentials in neurology and psychiatry.</a> Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).</li><li>Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+neopterin+is+brain-derived+and+not+associated+with+blood-CSF+barrier+dysfunction+in+non-inflammatory+affective+and+schizophrenic+spectrum+disorders.">Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders.</a> Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).</li><li>Bromader, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+serum+and+cerebrospinal+fluif+cytokines+in+response+to+non-neurological+surgery:+an+observational+study.">Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).</li><li>Starhof, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+pro-inflammatory+cytokines+differentiate+parkinsonian+syndromes.">Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305 (2018).</li></ol>

Métodos quantitativos para a avaliação do aumento das concentrações de proteínas CSF são ferramentas úteis na caracterização do estado fisiológico e patológico do SNC. No entanto, além da quantificação confiável dos níveis de proteína CSF, a detecção de proteínas CSF requer uma expressão de resultados que discrimina entre frações derivadas do sangue e do SNC no CSF. No entanto, até à data, os ensaios de quantificação de proteínas comumente utilizados não permitem a discriminação entre os d...

O líquido cefalorraquidiano (CSF), um líquido claro e incolor em torno do cérebro e da medula espinhal, tem grande importância científica clínica e básica. O CSF preserva o ambiente eletrólitico do sistema nervoso central (SNC), equilibra o estado sistêmico de base ácida, fornece nutrientes para células neuronais e gliais, funciona como um sistema linfático para o SNC, e transporta hormônios, neurotransmissores, citocinas e outros neuropeptídeos em todo o CNS1. Assim, como a composição do CSF reflete a atividade do SNC, esse fluido oferece um acesso valioso, embora indireto, para caracterizar o estado fisiológico e patológico do SNC.
A CSF tem sido usada para diagnosticar condições que afetam o SNC há mais de cem anos, e durante a maior parte desse tempo, foi estudada principalmente pelos clínicos como uma ferramenta de diagnóstico. No entanto, nos últimos anos, os neurobiólogos reconheceram o potencial da CSF para estudar a fisiopatologia do SNC. Em particular, várias ferramentas de análise de proteína de alta taxa de vesperção foram introduzidas no reino da neurociência, permitindo um estudo detalhado da composição proteica do CSF, com a expectativa de que esta análise possa ajudar a fornecer informações sobre as mudanças dinâmicas ocorrendo dentro do SNC.
Desenvolvimentos tecnológicos em técnicas de imunoensaio multiplex, como luminex e simoa tecnologias2,3, fornecer pesquisadores hoje com a capacidade de detectar centenas de proteínas em concentrações muito baixas. Além disso, essas mesmas tecnologias permitem o uso de pequenos volumes de amostras, promovendo assim estudos em pequenos animais, incluindo camundongos, nos quais volumes de amostras limitados de CSF impediram caracterizações detalhadas do fluido até recentemente.
No entanto, uma ressalva é que as proteínas medidas em CSF podem derivar da síntese intrathecal e/ou transudação do soro devido a uma interface sangue-cérebro danificada (BBI). Infelizmente, a análise de proteínas da CSF por si só só pode determinar a soma desses dois componentes. Para discriminar entre proteínas produzidas transudate e intrathecally, as medidas da proteína de CSF usando toda a ferramenta disponível da análise da proteína devem ser ajustadas para a variabilidade individual em concentrações do soro assim como a integridade da barreira. No entanto, embora esse ajuste seja comumente usado na prática clínica, por exemplo, o índice CSF IgG, que tem alta sensibilidade para detectar a síntese intrathecal igg4,5,6, até o momento, muito poucos estudos de pesquisa corrigiram concentrações de proteína CSF para concentração de soro e integridade de barreira7,8.
Atualmente, a abordagem Reibergram é a melhor maneira de determinar a função de barreira e síntese intratérica de proteínas. É uma avaliação gráfica em diagramas quocientes csf/sérico que analisa, de forma integrada, tanto a função de barreira (dys) quanto a síntese intratais de proteínas, referindo-se a uma proteína exclusivamente derivada do sangue9,10. A albumina de proteína altamente abundante é geralmente escolhida como proteína de referência porque é produzida apenas no fígado e porque seu tamanho, aproximadamente 70 kDa, é intermediário entre proteínas pequenas e grandes11. O diagrama de análise foi definido pela primeira vez por Reiber e Felgenhauer em 1987 para as principais classes de imunoglobulinas (Igs)11, sendo empiricamente com base nos resultados obtidos a partir da análise de milhares de amostras humanas9. A abordagem foi posteriormente confirmada pela aplicação das duas leis de difusão de Fick na teoria da difusão molecular/taxa de fluxo12. Tal teoria demonstra que a difusão de uma proteína através da barreira tem uma distribuição hiperbólica e pode explicar quantitativamente a dinâmica das proteínas no SNC9,13. No geral, a vantagem de usar o Reibergram para demonstrar a síntese intrathecal de proteínaé que ela identifica simultaneamente a fração de proteína que entra no CSF do soro, bem como a quantidade de proteína encontrada no CSF por causa da produção local.
O presente artigo e o protocolo relacionado descrevem todo o procedimento, desde csf e coleta de sangue até os cálculos finais corrigindo os níveis de proteína CSF, para a medição quantitativa da síntese intrathecal de proteínas em modelos de camundongos de Distúrbios. Este procedimento fornece uma linha de base contra a qual avaliar (1) a origem fisiopatológica de qualquer proteína CSF e (2) a estabilidade e o significado funcional da integridade da barreira. Este procedimento e protocolo não são apenas úteis para avaliar amostras de CSF de camundongos, mas também são úteis na análise de CSF em uma infinidade de modelos animais de doenças neurológicas e pacientes humanos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1484px;" width="1482">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">1 mL insulin syringe</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">329650</td>
			<td style="width:847px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">329622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">25 gauge needle</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">309582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">30 gauge insulin needle</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Absorbent pads</td>
			<td style="width:184px;">Any suitable brand</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">BioPlex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;">171020100</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">BioPlex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;">171015001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">BioPlex Pro Flat Bottom Plates</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;">171025001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Biotinilated detection antibody</td>
			<td style="width:184px;">Any suitable source</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td style="width:184px;">PAR Pharmaceutical</td>
			<td style="width:127px;">NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Capillary Tubes</td>
			<td style="width:184px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:127px;">B100-75-10</td>
			<td>OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Centrifuge tube, 0.2 mL</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Centrifuge tube, 0.5 mL</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">87003-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Centrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Chlorhexidine diacetate</td>
			<td style="width:184px;">Nolvasan</td>
			<td style="width:127px;">E004272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Disposable pipettes tips</td>
			<td style="width:184px;">Any suitable brand</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Ear bars</td>
			<td style="width:184px;">KOPF Instruments</td>
			<td style="width:127px;">1921 or 1922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Ethanol</td>
			<td style="width:184px;">Kopter</td>
			<td style="width:127px;">V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Freezer</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">VWR32086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Gauze</td>
			<td style="width:184px;">Medline</td>
			<td style="width:127px;">NON25212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Heating pad</td>
			<td style="width:184px;">Sunbeam</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Induction Chamber</td>
			<td style="width:184px;">VETEQUIP</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td style="width:127px;">NDC 14043-704-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Ketamine (KetaVed)</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagPlex Microspheres (antibody-coupled)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:847px;">Antibody-coupled magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Microplate Shaker</td>
			<td style="width:184px;">Southwest Scientific</td>
			<td>SBT1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Microretractors</td>
			<td style="width:184px;">Carfill Quality</td>
			<td style="width:127px;">ACD-010</td>
			<td>Blunt - 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Microsoft Office (Excel)</td>
			<td style="width:184px;">Microsoft</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel</td>
			<td style="width:184px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:127px;">MGAMMAG-300K</td>
			<td>Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mouse Albumin capture ELISA kit</td>
			<td style="width:184px;">Novus Biological</td>
			<td style="width:127px;">NBP2-60484</td>
			<td>Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Non-Sterile swabs</td>
			<td style="width:184px;">MediChoice</td>
			<td style="width:127px;">WOD1002</td>
			<td>Need to be autoclaved for sterility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Oxygen</td>
			<td style="width:184px;">AIRGAS</td>
			<td style="width:127px;">OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Pasteur Pippettes</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:127px;">13-678-20A</td>
			<td>5 &#38; 3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet</td>
			<td style="width:127px;">8695G</td>
			<td>P-3 Reverse Cutting, 18&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">PE-Streptavidin</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">554061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Pipetters</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">Research seriers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:184px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:127px;">ALLEGRA X-12R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Scale</td>
			<td style="width:184px;">Uline</td>
			<td style="width:127px;">H2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Scalpel</td>
			<td style="width:184px;">Feather</td>
			<td style="width:127px;">EF7281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Shaver</td>
			<td style="width:184px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:127px;">52-5204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Standard proteins</td>
			<td>Any suitable source</td>
			<td></td>
			<td>The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:184px;">KOPF Instruments</td>
			<td style="width:127px;">Model 900LS</td>
			<td>Standard Accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Sterile 1 x PBS</td>
			<td style="width:184px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:127px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Sterile saline</td>
			<td style="width:184px;">Baxter</td>
			<td style="width:127px;">0338-0048-02</td>
			<td>0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Surgical Forceps Curved, 7 (2)</td>
			<td style="width:184px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:127px;">11271-30</td>
			<td>Dumont</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:184px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:127px;">14094-11</td>
			<td>Stainless 25x</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Vaporizer + Flow meter</td>
			<td style="width:184px;">Moduflex Anhestesia Instruments</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Vortex</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Warming pad</td>
			<td style="width:184px;">Kent Scientific Corporation</td>
			<td style="width:127px;">RT-JR-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Water Sonicator</td>
			<td style="width:184px;">Cole Parmer</td>
			<td>EW-08895-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xylazine</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of intrathecally synthesized proteins in mice

O líquido cefalorraquidiano (CSF), um fluido encontrado no cérebro e na medula espinhal, é de grande importância para a ciência básica e clínica. A análise da composição da proteína CSF fornece informações cruciais na pesquisa básica de neurociência, bem como doenças neurológicas. Uma ressalva é que as proteínas medidas em CSF podem derivar da síntese intrathecal e da transudação do soro, e a análise da proteína de CSF pode somente determinar a soma destes dois componentes. Para discriminar entre a transudação de proteínas do sangue e proteínas intrathecally produzidas em modelos animais, bem como em seres humanos, as medições de perfil de proteína CSF usando ferramentas convencionais de análise de proteínadevem incluir o cálculo do quociente de csf/soro albumina(q albumina),um marcador da integridade da interface sangue-cérebro (BBI) e do índice de proteína(q proteína/q albumina), uma estimativa de síntese de proteína intrathecal. Este protocolo ilustra todo o procedimento, desde csf e coleta de sangue para quocientes e cálculos de índices, para a medição quantitativa da síntese intratês de proteínas e imparidade BBI em modelos de camundongos de distúrbios neurológicos.

Este experimento representativo teve como objetivo comparar a síntese intratítica do IgG em dois modelos de roedores clinicamente relevantes de esclerose múltipla (EM): a PLP139-151-induzida pela encefalomielite autoimune experimental (TMEV-IDD) e a doença de desmielinação induzida pelo vírus de Theiler. R-EAE é um modelo útil para a compreensão de EmS remitindo-remitindo-remitindo, visto que o modelo de TMEV-IDD caracteriza oM9progressivo crônico.
<p class="jove_content"...

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Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Níveis elevados de proteína do fluido espinhal podem ser o resultado da difusão da proteína plasmática através de uma barreira hemato-cerebral alterada ou síntese intratérica. Um protocolo de teste otimizado é apresentado neste artigo que ajuda a discriminar ambos os casos e fornece medições quantitativas de proteínas sintetizadas intrathecally.

Medição quantitativa de proteínas sintetizadas intrathecally em camundongos

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Este protocolo permite que csf e coleta de sangue na correção quantitativa dos níveis de proteína CSF para medir em uma síntese de proteínas ocal em modelos de camundongos de distúrbios neurológicos. Este procedimento fornece uma linha de base, contra a qual a origem fisiopatológica das proteínas CSF de interesse, e a estabilidade e a significância funcional do CSF sanguíneo favorecem a integridade. A análise da síntese de proteínas interteca e da integridade da barreira pode ser aplicada a outros modelos animais e estudos humanos.Por exemplo, para verificar se há doenças do sistema nervoso central. A coleta de volumes significativos de CSF limpo pode ser tecnicamente desafiadora em camundongos, por isso é aconselhável praticar a técnica até que grandes volumes de amostra não contaminada possam ser obtidos. Demonstrando os procedimentos estará Micheal Linzey, estudante de pós-graduação do programa de medicina experimental e molecular em Dartmouth, em nosso novo grupo de pesquisa em imunologia.Para coleta de soro através de sangramento orbital retrô. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal em um rato anesthetizado superior a 15 gramas, segure a pele solta atrás das orelhas com o polegar e o dedo indicador da mão não dominante, e use o dedo indicador para retirar a pele acima dos olhos. Usando o polegar para retirar a pele abaixo dos olhos, coloque a ponta de uma pipeta Pasteur, mantida em um ângulo de aproximadamente 45 graus, na órbita ocular sob o globo ocular, direcionada para o meio da órbita ocular, enquanto gira a pipeta entre os dedos.Em seguida, aplique pressão breve e suave e solte para permitir que o sangue entre na pipeta. Quando a amostra de sangue tiver sido coletada, remova suavemente o capilar sem ferir o olho, e transfira o sangue para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Depois de fechar a pálpebra, aplique pressão leve com gaze para evitar maior sangramento.Deixe o sangue coagular por 30 a 60 minutos à temperatura ambiente antes de girar a amostra por centrifugação. Usando uma técnica de pipeta limpa, colete o soro separado em um novo frasco de 500 microliter, e congele imediatamente o soro a 80 graus Celsius. Após confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, remova uma grande área de cabelo suficiente para permitir a coleta do fluido espinhal cerebral imediatamente na extremidade caudal do crânio do rato anestesiado.Coloque o mouse em uma posição propensa em um dispositivo estereotaxico em condições estéreis e estalou a cabeça com barras de ouvido. Co swab o local cirúrgico com diacetato de 30% de clorexidina, e faça uma incisão de pele sagital inferior à occiput para expor os músculos sobrepostos à cisterna magna. Usando fórceps, disseque o tecido e os músculos subcutâneos e use micro retráteis para segurar os músculos para expor a camada meningeal dura mater sobre a cisterna magna.Lave suavemente o tecido com PBS estéril para remover qualquer possível contaminação sanguínea, e use um cotonete estéril para borrar o dura mater seco. O posicionamento da punção inicial na cisterna magna é essencial para a obtenção de CSF abundante e não contaminado. Usando uma agulha de calibre 30, puna suavemente a membrana que cobre a cisterna magna, e insira rapidamente e suavemente um pequeno tubo capilar de vidro na punção.Quando cinco a 12 microliters de CSF tiverem sido coletados, remova cuidadosamente o tubo da membrana e use um pedaço de tubo de polietileno para conectar o tubo a uma seringa de três mililitros. Injete o CSF coletado em um tubo de 500 microliteres rotulado no gelo, e use uma agulha descartável e variadas suturas de polidioxanona para fechar a incisão. Limpe a área de qualquer sangue ou tecido seco, e coloque o rato em uma gaiola limpa e quente com monitoramento até a recumbência total.Colete o CSF por centrifugação, e inspecione visualmente a pelota e sobrenize-a para qualquer sinal de contaminação sanguínea. Em seguida, usando a técnica de pipeta limpa, transfira o supernato contendo CSF em um novo tubo de 200 microliter, e dilua o CSF em uma proporção de um a três com PBS para armazenamento imediato a 80 graus Celsius. Para coleta de soro por punção cardíaca, imediatamente após a coleta de CSF, como apenas demonstrado, coloque o rato na posição supina.Cotonete a pele abdominal com 70% de álcool. Use uma tesoura para abrir a cavidade torácica, expondo o coração, e inserir uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de 3 mililitros no ventrículo esquerdo. Em seguida, aplique suavemente pressão negativa no êmbolo da seringa, retirando a agulha depois que o sangue tiver sido coletado.Deprimir o êmbolo para ejetar o sangue coletado em um frasco de 1,5 mililitro. Agora, deixe o sangue coagular por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente antes de separar o soro por centrifugação. Em seguida, usando uma técnica de pipeta limpa, transfira o soro para um novo frasco de 500 microliter rotulado para armazenamento imediato a 80 graus Celsius.Para quantificar as proteínas-alvo e o albumen em amostras de soro e CSF combinadas, use um ensaio padrão de quantificação de proteínas, utilizando proteínas padrão referenciadas para preparar uma curva padrão para cada proteína de interesse. Após a análise, exporte os dados brutos para um programa de grafização de software apropriado, e gráfico a intensidade de fluorescência do sinal de detecção versus as concentrações de proteína padrão para criar uma curva padrão para cada proteína de interesse. Em seguida, use as curvas padrão para calcular as concentrações de cada analito de interesse nas amostras.Finalmente, use as concentrações de albumen e analitos de destino para calcular valores Q e índice intratecal. Os níveis reais de IgG totais são significativamente aumentados no CSF de dois modelos de roedores testados de esclerose múltipla, em comparação com a idade correspondente aos controles falsos correspondentes. Os camundongos R-EAE mostram valores quocientes de albumen significativamente aprimorados, indicando uma maior permeabilidade da barreira cerebral sanguínea nesses camundongos.Não versáticamente, não existem diferenças no quociente de albumen entre TMEV-IDD e ratos falsos, corroborando descobertas anteriores de uma barreira intacta em ratos TMEV-IDD. Além disso, em animais TMEV-IDD, valores significativamente mais elevados do índice IgG e, portanto, a produção de IgG intrathecal são observadas. O cálculo de um índice proteico facilita a identificação de novos biomarcadores proteicos úteis para diagnóstico precoce, previsão de desfechos e monitoramento de cursos de doenças para doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

O Vermicelli e Testes Handling Capellini: Simple medidas quantitativas da função forepaw dexterous em ratos e camundongos

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Neurociência

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Medição quantitativa de níveis relativos ácido retinóico em E8.5 embriões e neurosphere culturas Usando a F9 RARE-Lacz baseado em células de Ensaio Reporter

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Em Gene Vivo Transferência de células de Schwann no nervo ciático de roedores por Eletroporação

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Medida quantitativa da proteína precursora amiloide γ-Secretase-mediada e clivagem de entalhe em plataformas de ensaio baseada em célula Luciferase Reporter

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Análise quantitativa da arborização dendrítica Neuronal complexidade em Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Registro eletrocorticográfico de áreas do córtex cerebral manipulado usando um vírus associado ao Adeno visando cofilina em camundongos

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...