Name: quantitative measurement of intrathecally synthesized proteins in mice
Uploaded: 2019-11-29T13:00:00
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Los autores agradecen al personal del Centro de Medicina Comparada e Investigación (CCMR) de Dartmouth por su cuidado experto de los ratones utilizados para estos estudios. El Fondo de Investigación Bornstein financió esta investigación.

Todo el trabajo animal utiliza protocolos revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Escuela de Medicina Geisel en Dartmouth.
1. Recolección de líquidos
NOTA: Se requieren tanto suero como LSC. Se necesitan dos protocolos para cada recolección de fluidos para la supervivencia y la necropsia.
<ol><li>Recolección de suero y CSF mediante procedimientos de supervivencia NOTA: Para la recolección de fluidos de ...

<ol>
	<li>Whedon, J. M., Glassey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+stasis+and+its+clinical+significance.">Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance.</a> Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).</li><li>Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+cerebrospinal+fluid+biomarkers+using+microsphere-based+xMAP+multiplex+technology+for+early+detection+of+Alzheimer's+disease.">Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease.</a> Methods. 56 (4), 484-493 (2012).</li><li>Barro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+biomarker+and+electrophysiological+outcome+measures+for+progressive+MS+trials.">Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials.</a> Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).</li><li>Tourtellotte, W. 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Report from an EFNS task force.</a> European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).</li><li>Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-cerebrospinal+fluid+barrier:+structure+and+functional+significance.">The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance.</a> Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).</li><li>Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. 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B., Gilli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+a+molecular+signature+in+inflammatory+demyelinating+disease.">Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease.</a> Neurology, Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 6 (1), 520 (2019).</li><li>Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+biomarkers+in+central+nervous+system+tissue+and+cerebrospinal+fluid+in+the+Theiler's+virus+model+mirror+those+in+multiple+sclerosis.">Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis.</a> Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).</li><li>Gerbi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+concentration+in+the+arterial+and+venous+renal+blood+serum+of+the+rabbit.">Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. 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Essentials in neurology and psychiatry.</a> Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).</li><li>Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+neopterin+is+brain-derived+and+not+associated+with+blood-CSF+barrier+dysfunction+in+non-inflammatory+affective+and+schizophrenic+spectrum+disorders.">Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders.</a> Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).</li><li>Bromader, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+serum+and+cerebrospinal+fluif+cytokines+in+response+to+non-neurological+surgery:+an+observational+study.">Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).</li><li>Starhof, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+pro-inflammatory+cytokines+differentiate+parkinsonian+syndromes.">Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305 (2018).</li></ol>

Los métodos cuantitativos para la evaluación del aumento de las concentraciones de proteínas del LSC son herramientas útiles en la caracterización del estado fisiológico y patológico del SNC. Sin embargo, más allá de la cuantificación fiable de los niveles de proteína sofo, la detección de proteínas del LIF requiere una expresión de resultados que discriminen entre las fracciones derivadas de la sangre y del SNC en el LRESULT. Sin embargo, hasta la fecha, los ensayos de cuantificación de proteínas comúnm...

El líquido cefalorraquídeo (LCR), un líquido transparente e incoloro que rodea el cerebro y la médula espinal, tiene una gran importancia clínica y científica básica. El LSN preserva el entorno electrolítico del sistema nervioso central (SNC), equilibra el estado sistémico de la base de ácidos, suministra nutrientes a las células neuronales y gliales, funciona como un sistema linfático para el SNC, y transporta hormonas, neurotransmisores, citoquinas y otros neuropéptidos a lo largo del SNC1. Así, como la composición del LSNC refleja la actividad del SNC, este fluido ofrece un valioso, aunque indirecto, acceso para caracterizar el estado fisiológico y patológico del SNC.
El LSN se ha utilizado para diagnosticar afecciones que afectan al SNC durante más de cien años, y durante la mayor parte de este tiempo, fue estudiado principalmente por los médicos como una herramienta de diagnóstico. Sin embargo, en los últimos años los neurobiólogos han reconocido el potencial del LIF para estudiar la fisiopatología del SNC. En particular, se han introducido varias herramientas de análisis de proteínas de alto rendimiento en el ámbito de la neurociencia, lo que permite un estudio detallado de la composición proteica del LSCA, con la expectativa de que este análisis puede ayudar a proporcionar información sobre los cambios dinámicos que ocurre dentro del SNC.
Los desarrollos tecnológicos en técnicas de inmunoensayo multiplex como Luminex y Simoa technologies2,3, proporcionan a los investigadores hoy en día la capacidad de detectar cientos de proteínas a concentraciones muy bajas. Además, estas mismas tecnologías permiten el uso de pequeños volúmenes de muestra, promoviendo así estudios en animales pequeños, incluidos ratones, en los que volúmenes de muestras limitados de LIF han impedido caracterizaciones detalladas del fluido hasta hace poco.
Sin embargo, una advertencia es que las proteínas medidas en el LCC pueden derivar de la síntesis intratecal y/o la transudación del suero debido a una interfaz hematoencefálica (BBI) dañada. Desafortunadamente, el análisis proteico del LIF por sí solo sólo puede determinar la suma de estos dos componentes. Para discriminar entre las proteínas transsufechadas y producidas intratecalmente, las mediciones de proteínas CSF que utilicen cualquier herramienta de análisis de proteínas disponible deben ajustarse para la variabilidad individual en las concentraciones séricas, así como para la integridad de la barrera. Sin embargo, aunque este ajuste se utiliza comúnmente en la práctica clínica, por ejemplo, el índice IgG de La CSF, que tiene alta sensibilidad para detectar la síntesis intratecal de IgG4,5,6, hasta la fecha muy pocos estudios de investigación han corregido las concentraciones de proteína CSF para la concentración sérica y la integridad de la barrera7,8.
Actualmente, el enfoque Reibergram es la mejor manera de determinar la función de barrera y la síntesis intratecal de proteínas. Se trata de una evaluación gráfica en diagramas de cocientes CSF/suero que analiza, de forma integrada, tanto la función de barrera (dys) como la síntesis de proteínas intratecales, refiriéndose a una proteína exclusivamente derivada de la sangre9,10. La albúmina proteica muy abundante suele ser elegida como proteína de referencia porque se produce sólo en el hígado y porque su tamaño, de aproximadamente 70 kDa, es intermedio entre proteínas pequeñas y grandes11. El diagrama de análisis fue definido por primera vez por Reiber y Felgenhauer en 1987 para las principales clases de inmunoglobulinas (Igs)11,siendo empíricamente basado en los resultados obtenidos del análisis de miles de muestras humanas9. El enfoque fue confirmado posteriormente por la aplicación de las dos leyes de difusión de Fick en la teoría de la difusión molecular/velocidad de flujo12. Tal teoría demuestra la difusión de una proteína a través de la barrera tiene una distribución hiperbólica y puede explicar cuantitativamente la dinámica de las proteínas en el SNC9,13. En general, la ventaja de utilizar el Reibergram para demostrar la síntesis de proteínas intratecales es que identifica simultáneamente la fracción proteica que entra en el LRESULT desde el suero, así como la cantidad de proteína que se encuentra en el LIF debido a la producción local.
El presente artículo y el protocolo relacionado describen todo el procedimiento, desde el LC y la recolección de sangre hasta los cálculos finales que corrigen los niveles de proteína CSF, para la medición cuantitativa de la síntesis de proteínas intratecales en modelos de ratón de Trastornos. Este procedimiento proporciona una línea de base para evaluar (1) el origen fisiopatológico de cualquier proteína del LCP y (2) la estabilidad y la importancia funcional de la integridad de la barrera. Este procedimiento y protocolo no sólo son útiles para evaluar muestras de CSF de ratón, sino que también son útiles en el análisis de la CSF en una multitud de modelos animales de enfermedades neurológicas y pacientes humanos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1484px;" width="1482">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">1 mL insulin syringe</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">329650</td>
			<td style="width:847px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">329622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">25 gauge needle</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">309582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">30 gauge insulin needle</td>
			<td style="width:184px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Absorbent pads</td>
			<td style="width:184px;">Any suitable brand</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">BioPlex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;">171020100</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">BioPlex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;">171015001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">BioPlex Pro Flat Bottom Plates</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;">171025001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Biotinilated detection antibody</td>
			<td style="width:184px;">Any suitable source</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td style="width:184px;">PAR Pharmaceutical</td>
			<td style="width:127px;">NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Capillary Tubes</td>
			<td style="width:184px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:127px;">B100-75-10</td>
			<td>OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Centrifuge tube, 0.2 mL</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Centrifuge tube, 0.5 mL</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">87003-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Centrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Chlorhexidine diacetate</td>
			<td style="width:184px;">Nolvasan</td>
			<td style="width:127px;">E004272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Disposable pipettes tips</td>
			<td style="width:184px;">Any suitable brand</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Ear bars</td>
			<td style="width:184px;">KOPF Instruments</td>
			<td style="width:127px;">1921 or 1922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Ethanol</td>
			<td style="width:184px;">Kopter</td>
			<td style="width:127px;">V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Freezer</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">VWR32086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Gauze</td>
			<td style="width:184px;">Medline</td>
			<td style="width:127px;">NON25212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Heating pad</td>
			<td style="width:184px;">Sunbeam</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Induction Chamber</td>
			<td style="width:184px;">VETEQUIP</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td style="width:127px;">NDC 14043-704-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Ketamine (KetaVed)</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagPlex Microspheres (antibody-coupled)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:847px;">Antibody-coupled magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Microplate Shaker</td>
			<td style="width:184px;">Southwest Scientific</td>
			<td>SBT1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Microretractors</td>
			<td style="width:184px;">Carfill Quality</td>
			<td style="width:127px;">ACD-010</td>
			<td>Blunt - 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Microsoft Office (Excel)</td>
			<td style="width:184px;">Microsoft</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel</td>
			<td style="width:184px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:127px;">MGAMMAG-300K</td>
			<td>Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mouse Albumin capture ELISA kit</td>
			<td style="width:184px;">Novus Biological</td>
			<td style="width:127px;">NBP2-60484</td>
			<td>Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Non-Sterile swabs</td>
			<td style="width:184px;">MediChoice</td>
			<td style="width:127px;">WOD1002</td>
			<td>Need to be autoclaved for sterility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Oxygen</td>
			<td style="width:184px;">AIRGAS</td>
			<td style="width:127px;">OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Pasteur Pippettes</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td style="width:127px;">13-678-20A</td>
			<td>5 &#38; 3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet</td>
			<td style="width:127px;">8695G</td>
			<td>P-3 Reverse Cutting, 18&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">PE-Streptavidin</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">554061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Pipetters</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">Research seriers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:184px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:127px;">ALLEGRA X-12R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Scale</td>
			<td style="width:184px;">Uline</td>
			<td style="width:127px;">H2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Scalpel</td>
			<td style="width:184px;">Feather</td>
			<td style="width:127px;">EF7281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Shaver</td>
			<td style="width:184px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:127px;">52-5204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Standard proteins</td>
			<td>Any suitable source</td>
			<td></td>
			<td>The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:184px;">KOPF Instruments</td>
			<td style="width:127px;">Model 900LS</td>
			<td>Standard Accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Sterile 1 x PBS</td>
			<td style="width:184px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:127px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Sterile saline</td>
			<td style="width:184px;">Baxter</td>
			<td style="width:127px;">0338-0048-02</td>
			<td>0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Surgical Forceps Curved, 7 (2)</td>
			<td style="width:184px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:127px;">11271-30</td>
			<td>Dumont</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:184px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:127px;">14094-11</td>
			<td>Stainless 25x</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Vaporizer + Flow meter</td>
			<td style="width:184px;">Moduflex Anhestesia Instruments</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Vortex</td>
			<td style="width:184px;">Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Warming pad</td>
			<td style="width:184px;">Kent Scientific Corporation</td>
			<td style="width:127px;">RT-JR-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Water Sonicator</td>
			<td style="width:184px;">Cole Parmer</td>
			<td>EW-08895-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xylazine</td>
			<td style="width:184px;">Patterson Vet Supply Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of intrathecally synthesized proteins in mice

El líquido cefalorraquídeo (LCR), un líquido que se encuentra en el cerebro y la médula espinal, es de gran importancia para la ciencia básica y clínica. El análisis de la composición de proteínas del LIF proporciona información crucial en la investigación básica de neurociencia, así como en enfermedades neurológicas. Una advertencia es que las proteínas medidas en el LSC pueden derivar tanto de la síntesis intratecal como de la transudación del suero, y el análisis proteico del LSC sólo puede determinar la suma de estos dos componentes. Para discriminar entre la transudación de proteínas de la sangre y las proteínas producidas intratecalmente en modelos animales, así como en humanos, las mediciones de perfilado de proteínas CSF utilizando herramientas convencionales de análisis de proteínas deben incluir el cálculo del cociente cSF/suero de albúmina (Qalbúmina),un marcador de la integridad de la interfaz hematoencefálico (BBI) y el índice de proteínas(proteínaQ /Qalbumin),una estimación de la síntesis de proteínas intralacales. Este protocolo ilustra todo el procedimiento, desde el LCM y la recolección de sangre hasta los cálculos de cocientes e índices, para la medición cuantitativa de la síntesis de proteínas intratecales y el deterioro de la BBI en modelos de ratón de trastornos neurológicos.

Este experimento representativo tenía como objetivo comparar la síntesis intratecal de IgG en dos modelos de esclerosis múltiple (EM) clínicamente relevantes: la enfermedad desmielinizante inducida por el virus de la encefalomielitis de la encefalomielitis murinitis PLP139-151-inducida por la relaperante experimental (R-EAE) y la enfermedad desmielinizante inducida por el virus de la encefalomielitis murine de Theiler(PT-IDD). R-EAE es un modelo útil para entender la EM recurrente-remitente, mientras que ...

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Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Los niveles elevados de proteína de líquido cefalorraquídeo pueden ser el resultado de la difusión de proteína plasmática a través de una barrera hematoencefálica alterada o de la síntesis intratecal. En este artículo se presenta un protocolo de prueba optimizado que ayuda a discriminar ambos casos y proporciona mediciones cuantitativas de proteínas sintetizadas intratecalmente.

Medición cuantitativa de proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Este protocolo permite que el FSB y la recolección de sangre en la corrección cuantitativa de los niveles de proteína del FCA mida en una síntesis de proteínas del ratón en modelos de ratón de trastornos neurológicos. Este procedimiento proporciona una línea de base, contra la cual se puede evaluar el origen fisiopatológico de las proteínas de interés del CSF, y la estabilidad y la importancia funcional del cáncer de contraprocidad en sangre. El análisis de la síntesis de proteínas interteales y la integridad de la barrera se puede aplicar a otros modelos animales y estudios en humanos.Por ejemplo, para comprobar si hay enfermedades del sistema nervioso central. La recolección de volúmenes significativos de FPC limpio puede ser técnicamente difícil en ratones, por lo que se recomienda practicar la técnica hasta obtener grandes volúmenes de muestras no contaminadas. Demostrando los procedimientos estará Micheal Linzey, un estudiante de posgrado del programa de medicina experimental y molecular de Dartmouth, en nuestro nuevo grupo de investigación en inmunología.Para la recolección de suero a través de sangrado orbital retro. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal en un ratón anestesiado de más de 15 gramos, agarre la piel suelta detrás de las orejas con el pulgar y el dedo índice de la mano no dominante, y utilice el dedo índice para extraer la piel por encima de los ojos. Usando el pulgar para extraer la piel debajo de los ojos, coloque la punta de una pipeta Pasteur, sostenida en un ángulo de aproximadamente 45 grados, en la cavidad del ojo debajo del globo ocular, dirigida hacia el centro de la cavidad ocular, mientras gira la pipeta entre los dedos.A continuación, aplique una presión suave y suave y suéltelo para permitir que la sangre entre en la pipeta. Cuando se haya recogido la muestra de sangre, retire suavemente el capilar sin herir el ojo y transfiera la sangre a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Después de cerrar el párpado, aplique una presión leve con gasa para evitar más sangrado.Deje que la sangre coagule durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente antes de girar la muestra por centrifugación. Con una técnica de pipeta limpia, recoja el suero separado en un nuevo vial de 500 microlitrotro etiquetado e inmediatamente congele el suero a 80 grados centígrados. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, retire un área lo suficientemente grande del cabello para permitir la recolección del líquido cefalorraquídeo inmediatamente en el extremo caudal del cráneo del ratón anestesiado.Coloque el ratón en una posición propensa en un dispositivo estereotaxico en condiciones estériles y estacione la cabeza con barras de oído. Swab el sitio quirúrgico con 30%clorhexidina diacetate, y hacer una incisión de la piel sagital inferior al occipucio para exponer los músculos que sobrepasan la cisterna magna. Usando fórceps, disecciona el tejido subcutáneo y los músculos, y usa micro retractores para mantener los músculos separados para exponer la capa meningeal dura mater sobre la cisterna magna.Lave suavemente el tejido con PBS estéril para eliminar cualquier posible contaminación de la sangre, y use un hisopo de algodón estéril para borrar la dura mater seca. Colocar la punción inicial en la cisterna magna es esencial para obtener un CSF abundante y no contaminado. Con una aguja de calibre 30, perfore suavemente la membrana que cubre la cisterna magna, e inserte rápida y suavemente un pequeño tubo capilar de vidrio en la punción.Cuando se hayan recogido cinco a 12 microlitros de líquido cefalondidor, retire cuidadosamente el tubo de la membrana y utilice un trozo de tubo de polietileno para conectar el tubo a una jeringa de tres mililitros. Inyecte el lesc sobre hielo en un tubo de 500 microlitros etiquetado y utilice una aguja desechable y suturas variadas de polidioxanona para cerrar la incisión. Limpie el área de cualquier sangre o tejido seco, y coloque el ratón en una jaula limpia y cálida con monitoreo hasta la recumbencia completa.Recoger el FV por centrifugación, e inspeccionar visualmente el pellet y supernarlo en busca de cualquier signo de contaminación de la sangre. A continuación, utilizando la técnica de pipeta limpia, transfiera el supernato que contiene CSF a un nuevo tubo de 200 microlitros, y diluya el CSF en una proporción de uno a tres con PBS para su almacenamiento inmediato a 80 grados centígrados. Para la recolección de suero por punción cardíaca, inmediatamente después de la recolección de CSF, como acaba de demostrar, coloque el ratón en la posición supina.Frota la piel abdominal con 70%alcohol. Use tijeras para abrir la cavidad torácica, exponiendo el corazón e inserte una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de 3 mililitros en el ventrículo izquierdo. A continuación, aplique suavemente presión negativa en el émbolo de la jeringa, retirando la aguja después de que se haya recogido la sangre.Presione el émbolo para expulsar la sangre recogida en un vial de 1,5 mililitros. Ahora, deje que la sangre coagule durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente antes de separar el suero por centrifugación. A continuación, utilizando una técnica de pipeta limpia, transfiera el suero a un nuevo vial de 500 microlitro etiquetados para su almacenamiento inmediato a 80 grados centígrados.Para cuantificar las proteínas objetivo y albúmina en muestras de suero y CSF coincidentes, utilice un ensayo de cuantificación de proteínas estándar, utilizando proteínas estándar referenciadas para preparar una curva estándar para cada proteína de interés. Después del análisis, exporte los datos sin procesar a un programa de gráficos de software adecuado y grafique la intensidad de fluorescencia de la señal de detección frente a las concentraciones de proteína estándar para crear una curva estándar para cada proteína de interés. A continuación, utilice las curvas estándar para calcular las concentraciones de cada analito de interés en las muestras.Por último, utilice las concentraciones de analito de albúmina y de destino para calcular los valores Q y el índice intratecal. Los niveles reales de IgG total se incrementan significativamente en el CSF de dos modelos de roedores probados de esclerosis múltiple, en comparación con los controles falsos coincidentes con la edad correspondiente. Los ratones R-EAE muestran valores de cociente de albúmina significativamente mejorados, lo que indica una mayor permeabilidad de la barrera hematoencefálica en estos ratones.No esversa que no existan diferencias en el cociente del albúmina entre TMEV-IDD y los ratones falsos, corroborando los hallazgos anteriores de una barrera intacta en ratones TMEV-IDD. Además, en los animales TMEV-IDD, se observan valores de índice IgG significativamente más altos y, por lo tanto, la producción intratecal de IgG. El cálculo de un índice de proteínas facilita la identificación de nuevos biomarcadores proteicos útiles para el diagnóstico precoz, la predicción de resultados y el seguimiento de los cursos de enfermedades para enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

El grano y Pruebas de Manejo de Capellini: Simple medidas cuantitativas de la función de las patas delanteras diestro en ratas y ratones

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Investigación

Neurociencias

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Un método simple y barato para la Determinación de la sensibilidad al frío y Adaptación en ratones

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

La medición cuantitativa de los niveles relativos de ácido retinoico en E8.5 embriones y Neurosphere culturas utilizando el ensayo indicador basado en células raras-lacZ F9

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

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En Vivo Transferencia de genes a células de Schwann en el nervio ciático de roedores mediante electroporación

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