Denne protokollen tillater studiet av kreft i bukspyttkjertelen på det innfødte vevsstedet, samtidig som den minimerer betennelse under tumorcelleinjeksjon og gir en høy gjennomstrømningsmetode for å generere store kohorter av mus. Ved hjelp av ultralydveiledning elimineres behovet for abdominal kirurgi. I våre hender har UG-OTIM en mye lavere hastighet på peritoneal veggsåing sammenlignet med tradisjonell ortotopisk implantasjon.
UG-OTIM produserer svulster som rekafulerer histologiske og immunbiologiske egenskaper som er karakteristiske for bukspyttkjertelsvulstens mikromiljø og kan derfor brukes til å undersøke nye terapeutiske kombinasjoner i en klinisk relevant setting. Vi utviklet denne protokollen for immuno-onkologi og kreftbiologi terapi, men det kan brukes i andre forskningsområder, inkludert undersøkelser av normal bukspyttkjertelfunksjon eller sykdomsstater som diabetes. Sanntid ultralyd avbildning av nålen innsetting og injeksjon er en integrert del av denne metoden.
Så visuell demonstrasjon av trinnet er avgjørende for riktig teknikk. Før du begynner prosedyren, suspenderer vi bukspyttkjertelen duktil adenokarsinomcellelinje av interesse i et passende volum sterilt, kaldt PBS på is. Plasser bur på en 37 graders Celsius oppvarmingsplate, og rengjør det biologiske sikkerhetskabinettet, induksjonskammeret og ultralydstadiet grundig med et passende sterilt middel.
Sett oppvarmingsfunksjonen til ultralydstadiet til 37 grader Celsius, og etter induksjon av anestesi, bruk salve på det første dyrets øyne. Plasser musen i ryggrekonsekvens på ultralydstadiet, og fest forsiktig øvre og nedre ekstremiteter til scenen med tape. Bruk en steril bomullsspissapplikator til å påføre et sjenerøst lag med hårfjerningskrem på øvre venstre kvadrant av magen over milten til midtlinjen.
Etter ett minutt, bruk en tørr gasbindpute for å forsiktig fjerne håret før du fjerner overflødig hårfjerningskrem med saltvanns våt gasbind. Plasser deretter musen i en av de nye, rene burene på varmeren. For ultralydstyrt tumorcelleimplantasjon, juster ultralydplattformen slik at overflaten er parallell til gulvet, og stå til venstre side av dyret med musens hode vendt mot høyre.
Juster transduserposisjonen slik at et tverrgående bukbilde oppnås, og fest muselemmer til plattformen med tape. Senk svingeren forsiktig for å komme i kontakt med musemagen og juster svingeren til bukspyttkjertelen er godt synlig. Finn venstre nyre og milt for å gi en nøyaktig orientering i bukhulen.
Når injeksjonsstedet er plassert, legg i en 29 gage 1/2 tommers insulinsprøyte med 25 mikro liter tumorcellesuspensjon, og tørk av nålespissen med en steril alkoholprepppute. Bruk sløv kant tang for å gripe musehuden og bukhinneveggen for å øke spenningen på injeksjonsstedet. Hold sprøyten i en ca 25 til 45 graders vinkel til ultralydplattformoverflaten, sakte fremme nålen gjennom huden og bukhinnenveggen.
Kontroller at nålen har punktert gjennom bukhinnens vegg før du bruker ultralydvisualisering for å lede nålen direkte inn i bukspyttkjertelen. Når nålen er på plass, sakte injisere tumorcellene. Dannelsen av en flytende bolus i bukspyttkjertelen vil være tydelig i en korrekt injisert bukspyttkjertel ved ultralyd.
Når hele volumet av suspensjon er injisert, og væske bolus kan observeres ved ultralyd, hold sprøyten veldig stille i flere sekunder før sakte trekke nålen fra muselivet, pass på ikke å forstyrre injiserte celler. Plasser deretter musen i et nytt, rent bur på varmeren med overvåking til full gjenoppretting. Riktig nåleplassering i bukspyttkjertelen, inkludert nålesybde og vinkel er et kritisk skritt i denne protokollen.
Visualisering av væskebolus bidrar til å bekrefte en vellykket tumorinjeksjon. Kontrollere dybden av injeksjon er det vanskeligste aspektet. Mitt råd er å øve med tripamboo injeksjoner og bekrefte væske bolus av både ultralyd og necropsy.
Overvåking av tumorimplantasjon og vekstrate ved ukentlig ultralydavbildning avslører svulster som finnes innenfor bukspyttkjertelens grenser gjennom hele eksperimentelle perioden. Høye titer tumor injeksjoner resultere i en høyere andel av tumorbærende dyr tre uker etter injeksjon sammenlignet med lav titer kohort. Til tross for forsinkelsen i tumorinnsett, er den totale tumorveksthastigheten ikke signifikant forskjellig mellom de to dosene.
På samme måte, mens overlevelsesraten mellom de to kohortene ikke er signifikant forskjellig, har de en tendens til å trend mot litt bedre overlevelse i den lave titerkohorten. Den høye titerkohorten produserer også en større andel mus med svulster som kan rulles ut i prekliniske studier, med fire uker etter injeksjon. Ved offer er den grove anatomien til ultralydstyrte ortotopiske tumorimplantasjonsmodellsvulster lik spontane KPC-svulster og histologiske analyser viser et mønster av unormale ductal strukturer som ligner i begge modellene, og som rekatolerer morfologien til den menneskelige sykdommen.
I begge modellene er svulstene dårlig infiltrert av T-celler, men svært infiltrert av makrofager. Husk å holde sprøyten i riktig vinkel for å tillate jevn inntreden i bukspyttkjertelen, og for å bekrefte at nålen er i bukspyttkjertelen før du fortsetter med injeksjonen. Tumorvekst kan overvåkes og svulster kan høstes for analyse av pho cytometri eller immunohistochemistry for å bestemme virkningen av en intervensjon.