Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par le National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) et l'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). Les auteurs remercient le Biorepository and Pathology Core pour l'accès à la plate-forme Leica LMD 6500 à l'école de médecine Icahn à Mount Sinai.

Les tissus de souris ont été obtenus conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, et les protocoles d'étude ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'École de médecine Icahn du Mont Sinaï.
1. Préparation de spécimens congelés frais
<ol><li>Disséquer l'embryon ou le tissu d'intérêt. Intégrer l'échantillon dans un moule d'intégration jetable avec une température de coupe opti...

LCM permet l'isolement des populations cellulaires enrichies ou homogènes des tissus hétérogènes. Ses avantages incluent la capture rapide et précise des cellules dans leur contexte in vivo, tandis que les inconvénients potentiels incluent qu'il est long, coûteux, et limité par la nécessité pour l'utilisateur de reconnaître les sous-populations distinctes dans un échantillon spécifié30. Ce protocole fournit des détails de LCM du cartilage embryonnaire de souris et de l'os, ...

Le système musculo-squelettique est un système multicomposant composé de muscle, tissu conjonctif, tendon, ligament, cartilage et os, innervé par les nerfs et vascularisé par les vaisseaux sanguins1. Les tissus squelettiques se développent avec l'hétérogénéité cellulaire croissante et la complexité structurale. Le cartilage et l'os se développent à partir de la même lignée osteochondroprogenitor et sont fortement liés. Le cartilage et l'os embryonnaires se développent en association avec des muscles, des nerfs, des vaisseaux sanguins, et le mésenchyme indifférencié. Le cartilage peut également être entouré par l'os, tel que le cartilage de Meckel et le cartilage condylar dans l'os mandibulaire. Ces tissus sont anatomiquement associés et interagissent les uns avec les autres par des signaux extracellulaires au cours du développement. Dans l'étude de l'expression génique dans le développement du cartilage et de l'os, un obstacle est l'hétérogénéité des structures squelettiques composées de plusieurs types de tissus. L'isolement précis du tissu spécifique d'intérêt est la clé pour l'analyse transcriptionnelle réussie.
La microdissection de capture au laser (LCM) est un outil puissant pour isoler les types de cellules ou les régions d'intérêt dans les tissus hétérogènes, et est reproductible et est sensible au niveau cellulaire unique2. Il peut précisément cibler et capturer des cellules d'intérêt pour un large éventail d'essais en aval dans la transcriptomique, la génomique et la protéomique3,4. La qualité de l'ARN, de l'ADN ou de la protéine isolés peut être évaluée à l'aide d'un bioanalyseur ou d'une plate-forme équivalente. Par exemple, la qualité de l'ARN est indiquée par le numéro d'intégrité de l'ARN (RIN)5.
Ici, nous fournissons un protocole pour la coloration rapide et l'isolement du cartilage et de l'os par LCM des tissus congelés frais. Nous utilisons l'embryon de souris pour démontrer que ce protocole donne de l'ARN de haute qualité pour l'analyse transcriptomique ultérieure, comme le séquençage de l'ARN (ARN-seq).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

La microdissection de capture au laser (LCM) est un outil puissant pour isoler des types de cellules ou des régions d'intérêt spécifiques des tissus hétérogènes. La complexité cellulaire et moléculaire des éléments squelettiques augmente avec le développement. L'hétérogénéité tissulaire, comme à l'interface des éléments cartilagineux et osseux les uns avec les autres ou avec les tissus environnants, est un obstacle à l'étude du développement du cartilage et des os. Notre protocole fournit une méthode rapide de traitement des tissus et l'isolement du cartilage et des os qui donne un ARN de haute qualité pour l'analyse de l'expression génique. Les tissus congelés frais des embryons de souris sont sectionnés et de brèves taches violettes cresyl est utilisée pour visualiser le cartilage et les os avec des couleurs distinctes des tissus environnants. Les glissements sont alors rapidement déshydratés, et le cartilage et l'os sont isolés par la suite par LCM. La minimisation de l'exposition aux solutions aqueuses au cours de ce processus maintient l'intégrité de l'ARN. Le cartilage et l'os mandibulaire de Mouse Meckel à E16.5 ont été avec succès rassemblés et l'analyse d'expression de gène a montré l'expression différentielle des gènes de marqueur pour des ostéoblastes, des osteocytes, des osteoclastes, et des chondrocytes. L'ARN de haute qualité a également été isolé à partir d'une gamme de tissus et d'âges embryonnaires. Ce protocole détaille la préparation de l'échantillon pour le LCM, y compris la cryoembedding, le sectionnement, la coloration et la déshydratation des tissus frais congelés, et l'isolement précis du cartilage et de l'os par LCM ayant pour résultat l'ARN de haute qualité pour l'analyse transcriptomique.

Des sections coronales des tissus congelés frais de souris à E16.5 ont été employées pour démontrer l'isolement et la collection du cartilage de Meckel (MC), du cartilage condylar, et de l'os mandibulaire par LCM. Les embryons de souris à E16.5 ont été disséqués et incorporés dans des moules cryogéniques avec composé d'OCT. Les échantillons dans les moules ont été rapidement congelés dans un bain de glace sèche et de méthyl-2-butane et stockés à -80 oC.
Pour démontrer la...

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Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Ce protocole décrit la microdissection de capture de laser pour l'isolement du cartilage et de l'os des sections congelées fraîches de l'embryon de souris. Le cartilage et l'os peuvent être rapidement visualisés par la coloration violette de cresyl et rassemblés précisément pour produire l'ARN de haute qualité pour l'analyse transcriptomique.

Microdissection de capture laser du cartilage embryonnaire de souris et de l'os pour l'analyse d'expression génique

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

L’hétérogénéité des structures squelettiques est un obstacle à l’étude de l’expression des gènes dans le développement du cartilage et des os. Ce protocole fournit une méthode pour l’isolement précis des tissus adjacents mais différents. Nous optimisons la microdissection de capture laser pour le cartilage et l’os à l’aide de taches violettes cresyl pour visualiser ces tissus pour une collecte précise en maintenant une intégrité élevée de l’ARN pour une analyse ultérieure.D’autres tissus peuvent être isolés si la violette cresyl fournit une distinction suffisante du tissu cible et que la qualité de l’ARN reste élevée après notre méthode de traitement. Ces tissus comprennent les sutures craniofaciales et le cerveau. Cryosectioning est la compétence la plus exigeante dans ce protocole.Assurez-vous que le tissu est disséqué et intégré rapidement pour maintenir la plus haute intégrité de l’ARN. Pour commencer cette procédure, disséquer l’embryon ou le tissu d’intérêt. Intégrir l’échantillon dans un moule d’intégration jetable avec un composé optimal de température de coupe, et ajuster l’orientation de l’échantillon avec une pointe ou une aiguille.Congeler rapidement les échantillons dans un bain de glace sèche et de méthyle-2 butène. Ensuite, préparez un contenant lidded avec de la glace sèche en plaçant une feuille de papier d’aluminium sur la glace sèche pour l’entreposage temporaire des glissières d’échantillon de dissection pendant la cryosection. Transférer le spécimen frais congelé dans le seau de glace sèche.Placez une couche de composé optimal de température de coupe sur un porte-spécimen cryostat, et placez immédiatement le spécimen sur le dessus du composé optimal de température de coupe avec une pression douce. Lorsque le composé optimal de température de coupe est complètement congelé, attachez le support avec le spécimen dans le bras de coupe cryostat. Laisser l’échantillon dans le cryostat pendant 15 minutes pour l’équilibrer à la température de coupe.Ensuite, sectionnez le tissu à une épaisseur de 12 micromètres et recueillez les tranches sur les diapositives de la membrane PEN. Aligner les sections consécutives sur la membrane. Une fois la glissade terminée, laissez sécher les sections pendant quelques minutes, puis transférez la glissade sur le papier d’aluminium dans le contenant de glace sèche jusqu’à ce que toutes les glissières requises soient recueillies.Rangez les glissières à moins 80 degrés Celsius dans une boîte à diapositives. Pour commencer, préparez trois tubes de centrifugeuse de 15 millilitres étiquetés. Ajouter 45 millilitres de 80 % d’éthanol à chaque tube.Placer trois tubes sur la glace. Placez un tube contenant 45 millilitres d’éthanol à 95 % et un tube contenant 100 % d’éthanol sur la glace. Ensuite, ajoutez 45 millilitres de xylène à un tube centrifugeuse de 50 millilitres à température ambiante.Décongeler brièvement une membrane PEN en la plaçant contre une main gantée et la laver deux fois pendant 30 secondes dans chacun des tubes contenant 80 % d’éthanol avec agitation pour enlever le composé optimal de température de coupe. Ensuite, mentez la glissière sur une feuille de papier d’aluminium. Pipette 8 millilitres de 1% de violette crésyle et 50% d’éthanol sur la lame et la tache pendant 30 secondes.Lavez la lame dans le troisième tube contenant 80 % d’éthanol pendant 30 secondes. Déshydratez la glissière en la passant à travers le tube contenant 95% d’éthanol pendant 30 secondes, le tube contenant 100% d’éthanol pendant 30 secondes, et enfin, le tube contenant du xylène pendant 30 secondes. Après cela, placez les glissières sur un essuie-glace délicat pendant cinq minutes pour laisser le xylène s’écouler et laisser sécher les sections.Tout d’abord, allumez le microscope à microdissection de capture laser, le laser et l’ordinateur. Connectez-vous à l’ordinateur et démarrez le logiciel. Lorsque la lumière verte est allumée, appuyez sur le bouton rouge pour activer le laser.Lorsque la lumière devient rouge, le laser est prêt à l’emploi. Insérez le bouchon d’un tube PCR de 5 millilitres dans le collecteur. Pipette 50 microlitres de tampon d’extraction dans le bouchon et insérer le dispositif de collecte dans le microscope.Dans la fenêtre de l’appareil collecteur de modification, cliquez sur le bouton passer au point de référence pour déplacer le collecteur vers le point de référence. Ajustez l’accent pour afficher clairement le point de référence. Ensuite, cliquez sur le bouton de déchargement gauche dans la barre d’outils pour abaisser le support de diapositives.Placez la glissière dans le support avec la section de tissu orientée vers le bas, et insérez le support de nouveau dans la scène. Cliquez sur continuer dans la fenêtre de l’échantillon de modification. Pour configurer les paramètres laser, sélectionnez l’option de contrôle du menu laser ou cliquez sur l’icône laser.Ajustez les paramètres suivants comme vous le souhaitez, la puissance, qui est la puissance du laser, l’ouverture, qui est la largeur du laser, et la vitesse, qui est la vitesse de coupe en mode tirage et coupe. Commencez par un objectif 5X pour trouver les domaines d’intérêt, et passez à l’objectif qui montre le mieux le domaine d’intérêt. Choisissez le tube pour la collection en cliquant sur la marque au collecteur, puis choisissez déplacer et couper ou dessiner et couper.Une fois la coupe terminée, le tissu cible avec membrane PEN tombera dans le capuchon du tube de collecte par gravité. Répétez ce processus de sélection et de coupe pour tirer plusieurs domaines d’intérêt si nécessaire. Après cela, déchargez le collecteur et fermez soigneusement le tube PCR.Déposer les tissus microdissectés sur la glace sèche. Décongeler brièvement les tissus microdissectés à température ambiante, puis les centrifuger brièvement, et incuber les échantillons à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, faites tourner le tampon de lyse vers le bas dans le tube PCR de 5 millilitres.Effectuer le traitement de la DNase et l’extraction de l’ARN à l’aide d’une trousse d’isolation de l’ARN, suivant les instructions du fabricant. Dans cette étude, une microdissection optimisée de capture de laser du cartilage et de l’os est exécutée, soulignant l’utilisation de la coloration de violette de cresyl dans une procédure rapide pour visualiser le cartilage et l’os pour la collecte précise de tissu tout en maintenant l’intégrité élevée d’ARN pour l’analyse suivante. L’observation des diapositives montre que tous les cartilages examinés sont des magenta tachés, et tous les tissus minéralisés sont tachés de brun ou de noir.Le cartilage et l’os sont facilement distingués des autres tissus aux emplacements anatomiques multiples. Le cartilage de Meckel, le cartilage condylar, et les régions mandibulaires d’os sont choisis et isolés par microdissection de capture de laser. Pour obtenir suffisamment d’ARN pour le séquençage, tirez 10 régions du cartilage de Meckel, 10 régions de cartilage condylar, ou quatre régions de l’os mandibulaire dans trois tubes individuels de collecte respectivement.L’ARN est ensuite extrait, et l’ARN total est analysé à l’aide d’un bioanalyseur. Ce protocole de microdissection de capture laser est utilisé sur divers tissus à différents stades de développement, et les mesures du nombre d’intégrité de l’ARN indiquent une qualité d’ARN élevée. L’analyse différentielle de l’expression des gènes est ensuite effectuée.Il y a 4006 gènes significativement et différemment exprimés entre l’os mandibulaire et le cartilage de Meckel. Les gènes spécifiques aux ostéoblastes ou aux ostéocytes sont plus fortement exprimés dans l’os mandibulaire tandis que les gènes spécifiques aux chondrocytes sont plus fortement exprimés dans le cartilage de Meckel. En outre, les marqueurs ostéoclastes sont plus fortement exprimés dans l’os mandibulaire, indiquant l’isolement réussi des tissus ciblés.Après cette procédure, l’analyse de l’expression des gènes, y compris qPCR et ARN-seq, peut être effectuée. Ces méthodes peuvent analyser l’expression génétique du transcriptome dans des tissus ou des régions d’intérêt spécifiques dans les tissus hétérogènes.

Research

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