Name: leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

وقد دعمت هذه الدراسة وزارة التعليم والبحوث الاتحادية الألمانية (BMBF) 01GL1746E كجزء من اتحاد بريمال. يعترف المؤلفان ببريتا هيكمان وسيلفيا بزر للحصول على مساعدة تقنية ماهرة.

تم إيواء الحيوانات تحت ظروف خاضعة للرقابة وخالية من مسببات الأمراض في IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung)، هايدلبرغ. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المذكورة هنا من قبل IRB المحلية وRegierungspraesidium كارلسروه، بادن فورتمبرغ، ألمانيا.
1. إدارة التخدير
<ol><li>تُشَعَيّر الفأرة عن طريق حق?...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia.">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo.">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C.">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422 (2014).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner.">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner.">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).</li><li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis.">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li><li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo.">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li><li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time.">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear.">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li><li>von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+peripheral+lymph+node+microcirculation+in+mice.">Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice.</a> Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).</li><li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice.">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li><li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+(IRI)+of+the+rat+cremaster+muscle.">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).</li><li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice.">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457 (2019).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).</li><li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels.">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li><li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology.">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny.">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li></ol>

وقد استخدمت على نطاق واسع IVM كوسيلة لدراسة أنواع مختلفة من الخلايا في أجهزة مختلفة، وقد وصفت على نطاق واسع ونوقشت19. والهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو توفير نهج فعال لإعداد وتنفيذ IVM في العضلات cremaster. ممارسة هذه الطريقة سوف تسفر عن نتائج موثوقة وقابلة للاستنساخ. وبالتالي، فإن الت...

المجهر الفيتفيلي (IVM) هو أداة تطبق عادة في مجال علم الأحياء الكريات البيض. تجنيد الكريات البيض يلي سلسلة من الأحداث المحددة جيدا التي بدأتها التقاط الكريات البيض، المتداول والالتصاق إلى الجدار الانبهي، وأخيرا نقل الهجرة وextravasation من الكريات البيض إلى الموقع الفعلي للالتهاب1. يتم التوسط في كل خطوة والتحكم فيها من قبل مختلف chemokines (على سبيل المثال، IL-8/CXCL8)، ومستقبلات (على سبيل المثال، LFA-1، ماك-1) والجزيئات الالتصاق الخلايا الانفحلية المقابلة (على سبيل المثال، ICAM-1، VCAM-1 و E-Selectin)2،,3. التفاعل بين المواقع التنظيمية المختلفة، والعوامل المسيطرة والوسطاء من الكريات البيضاء تجنيد سلسلة مثل مستقبلات المنتجات النهائية الجليسيشن المتقدمة (الغضب)، جزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1)، C-X-C عزر ligand (CXCL)1/2 وتم الكشف عن مستقبلاتهم CXCR2 باستخدام IVM44،5،,6،,7،,8،99.
وقد وصفت طريقة IVM لكثير من الأجهزة والأنسجة المختلفة مثل الأمعاء10، الجلد11، الغدد الليمفاوية12، كيس صفار الجنينية13 وغيرها. ومع ذلك، فإن الطريقة الأكثر دراسة على نطاق واسع من IVM هو نموذج cremaster، وصفت لأول مرة في الفئران14. في حين لا تزال تستخدم في الفئران15، يتم تطبيق هذه الطريقة في الوقت الحاضر بشكل رئيسي في الفئران بسبب وفرة عالية من خطوط المعدلة وراثيا مختلفة. وقد أبرزت مجموعتنا مؤخرا الدور المحتمل للcremaster IVM في مجال الموسكولاثات الالتهابية مثل دوشين ضمور العضلات (DMD) دراسة dystrophin ناقص mdx الفئران16. نظرًا لتكوين الألياف الرقيق المتشابك ة والسهل الوصول إليه ، تمثل عضلة الكريماستر العضلات المرشحة المثالية التي يجب دراستها كجبل كامل باستخدام المجهر الخفيف أو الفلوري. تجنيد الكريات البيض وextravasation أساسا تجري في الأفيين ما بعد الشعرية، والتي يمكن بسهولة أن تحدد على طبقة العضلات المستمرفي العضلات الكريماستر.
ميزة في التصوير الحي مقارنة مع غيرها من المقالات في المختبر هو سياقها البيولوجي في كائن حي. في الوقت نفسه، قد يتطلب تحديد المساهمات الخاصة بالخلايا في توظيف الكريات البيض المعدلة نماذج إضافية في المختبر مثل غرف التدفق أو المقالات البطانية. إن الجمع بين أساليب متعددة سوف ينتج بيانات أكثر إقناعاً. يجب أن يكون العلماء على بينة من القيود المفروضة على نموذج cremaster كما أي تلاعب الجراحية سيؤدي إلى زيادة الاتجار الكريات البيض والتجنيد. ومن ثم، يصعب تقدير التوظيف الأساسي بهذه الطريقة. على الرغم من تطبيقه على نطاق واسع ، يمكن أن يكون IVM من cremaster تحديًا وقد يستغرق الإعداد الجديد وقتًا وموارد لإنشاء. نحن نقدم الآن بروتوكول سهل من شأنه أن يساعد على تجنب بعض الأخطاء الشائعة في IVM. كما سيتم مناقشة القيود وسيتم تسليط الضوء على الطرق المجانية عند الاقتضاء.
IVM من الكريماستر يمثل نهجا مثاليا ليتم تنفيذه في مجال الدراسات الالتهابية والمعدية. وبشكل أكثر تحديدا، قد يكون نموذج cremaster ذات أهمية عالية للعلماء الذين يدرسون بيولوجيا العضلات الهيكل العظمي في سياق الأمراض الالتهابية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="874">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketanest S</td>
			<td style="width:204px;">Pfizer Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">PZN: 08509909</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Xylazine</td>
			<td style="width:204px;">CP-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Article-nr.: 1205&#160;</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Saline Solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td>PZN 02737756</td>
			<td>surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe needle Omnican F</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td style="width:175px;">REF 9161502</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Suture 6/0 USP</td>
			<td style="width:204px;">Resorba</td>
			<td style="width:175px;">REF 4217</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Polyethylene tube #10&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427401</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Polyethylene tube #90&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427421</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td style="width:175px;">CAS Number 989-38-8&#160;</td>
			<td>leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Setup Equipment</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">BX51W1</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">40-fold objective&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">Achroplan 40 &#215; /0.80 W</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImSpector software</td>
			<td style="width:204px;">Lavision Biotec GmbH</td>
			<td style="width:175px;">ver. 4.0.469</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">National Institute of Health, USA</td>
			<td style="width:175px;">ver. 1.51j8</td>
			<td>software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy

يستخدم المجهر اللاحيفي (IVM) على نطاق واسع لمراقبة العمليات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية داخل سلسلة توظيف الكريات البيض في الجسم الحي. يمثل البروتوكول الحالي طريقة عملية وقابلة للاستنساخ لتصور تفاعل البطانة البيض الكريات البيض مما يؤدي إلى تجنيد الكريات البيض في الأنسجة المشتقة من العضلات الهيكلية داخل الكائن السليم للفأرة. النموذج ينطبق على جميع مجالات البحوث التي تركز على تنشيط الحبيبية ودورها في المرض.
نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتوجيه من خلال الأسلوب وتسليط الضوء على المزالق المحتملة والصعوبات التقنية. يغطي البروتوكول الجوانب التالية: الإعدادات التجريبية والمواد المطلوبة ، وتخدير الماوس ، وتشريح عضلة cremaster وكذلك القصبة الهوائية والإزالة السباتية ، وتسجيلات IVM والتحليل غير المتصل بالإنترنت. يتم شرح تنسيقات البيانات مثل الكريات البيض الملتصقة ، وتدفق المتداول (RF) وكسر التدفق المتداول (RFF) بالتفصيل ويتم مناقشة التطبيقات المناسبة. يتم توفير النتائج التمثيلية من الفئران mdx mdx dystrophin ناقص في قسم النتائج.
IVM هو أداة قوية لتقييم تجنيد الكريات البيض في وضع في الجسم الحي; ومع ذلك، قد يتطلب تحديد على سبيل المثال وظيفة الانبوثيوليال والكريات البيض مزيجًا مع الإعدادات القابلة للقافية مثل تجارب غرفة التدفق. وعلاوة على ذلك، فإن الخلفية الوراثية للحيوانات ذات الأهمية قد تؤثر تأثيرا كبيرا على التوظيف الأساسي، مما يتطلب ضبطا دقيقا فرديا للبروتوكول المقدم. على الرغم من قيوده، قد تكون IVM بمثابة منصة لترجمة النتائج المختبرية بسهولة إلى كائن حي الفقاريات.

سوف IVM وفقا للبروتوكول المقدمة تسفر عن رؤى فريدة من نوعها في سلسلة من تجنيد الكريات البيض في العضلات الهيكل العظمي. وسيركز قسم النتائج على النتائج النموذجية التي حصل عليها مركز الإدارة المكانية للنتائج ويسلط الضوء على المشاكل المحتملة التي قد تواجهها.
ويرد الإعداد التجريب?...

Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

هنا، نعرض كيفية إجراء المجهر intravital على الأفير ما بعد الشعرية من العضلات كريسماستر الماوس. تطبق عادة على نماذج مختلفة من الالتهاب والإنتان، وخاصة تلك الناجمة عن chemokines والسيتوكينيات، ونحن تسليط الضوء على أهميتها في دراسة الموسكولوباثالتي التي تنطوي على تسرب الكريات البيض العضلي مبالغ فيها.

تسرب الكريات البيض من العضلات الكريماستر في الفئران التي تم تقييمها من قبل المجهر Intravital

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

يمكن استخدام هذه الطريقة العملية والقابلة للاستنساخ لتصور تفاعلات الكريات البيض البطين التي تؤدي إلى تجنيد الكريات البيض داخل فأرة سليمة. هذه التقنية أيضاً تقدم أداة قوية لرصد العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجية في داخل سلسلة تجنيد الكريات البيض في الجسم الحي. يمكن تطبيق هذه الطريقة في نماذج الالتهابات والتعفن المختلفة.على سبيل المثال، لقد أبرزنا مؤخراً أهميتها في دراسة العضلات التي تنطوي على تسلل مبالغ فيه في الكريات البيض العضلية. اقتراحنا لزملائه العلماء الذين يفكرون في استخدام هذه التقنية هو الحصول على أكبر قدر ممكن من الخبرة العملية حيث أن الطريقة عرضة جدا للانحرافات الطفيفة. إثبات الإجراء سيكون سيمون كرانيغ، طبيب كبير وعالم كبير من مختبري.بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع في الحيوان التجريبي المُغدّر، قم بإصلاح الفأرة في موضع إعادة خياطة الظهر على وسادة تسخين 37 درجة مئوية واستخدام خياطة معقم غير قابلة للتأكم 6-0 لرياح حلقة بسيطة حول الأسنان الأمامية. الشريط نهايات الانضمام من خياطة إلى وسادة التدفئة واستخدام ملاقط لرفع بلطف الجلد في خط الوسط. بعد ذلك، جعل فتحة دائرية قطرها 1-2 سنتيمتر فوق الرقبة والصدر العلوي واستخدام ملاقط لتشريح بعناية العضلات المحيطة، والدهون، والأنسجة الضامة.ضع خياطة تحت القصبة الهوائية. استخدم مقصًا جراحيًا صغيرًا لصنع مقطع عرضي 1.3 ملليمتر تقريبًا في القصبة الهوائية وإدخال أنبوب البولي إيثيلين في نهاية القصبة الهوائية لتأمين الشعب الهوائية العليا. إصلاح أنبوب الموجود مع خياطة عقدة دائرية واحدة وتحديد موقع الشريان السباتي على طول الجانب الأيمن من القصبة الهوائية.تشريح الأنسجة المحيطة من جدار الشريان السباتي وتمرير قطعتين من خياطة تحت الشريان. ربط أول خياطة الجمجمة قريبة إلى تشعب الشرايين السباتية ووضع خياطة الثانية حوالي خمسة إلى ثمانية ملليمترات من الخياطة الأولى دون ربط. بعد ذلك، قم بإرفاق قطعة من أنابيب البولي إيثيلين طولها 30 سنتيمترًا بإبرة حقنة ملليلتر واحدة مليئة بالملح واستخدام مقطع وعاء من سبعة ملليمترات لتضييق الشريان السباتي بشكل سوي على الغرزة الثانية.جعل ما يقرب من 0.5 ملليمتر قطع عرضية في الشريان السباتي وإدخال أنبوب البولي ايثيلين العقيمة في الشريان. تأمين أنبوب مع خياطة الثانية وإزالة مقطع السفينة. ثم الاكتئاب بلطف المكبس حقنة لطرد المالحة في السفينة.لتحضير عضلة كريمستر، قم بنقل الفأرة إلى إطار مجهر بلاستيكي مصنوع خصيصًا مع كيس الصفن الذي يواجه مرحلة المجهر، واتّهم بعناية كيس الصفن في نهايته الأكثر اتّجاهًا مع ملاقط. سحب كيس الصفن بلطف، وإزالة دائرية حول مقطع قطره خمسة ملليمترات من الجلد النحوي حفظ الأنسجة المفتوحة رطبة جيدا مع المالحة. استخدام اثنين من ملاقط لتشريح النسيج الضام فضفاضة وتحديد موقع كل الخصيتين.فهم واحد الخصية و بلطف تبدأ سحب الأنسجة التناسلية إزالة أي الأنسجة الضامة المحيطة خطوة بخطوة. بمجرد أن يتم اسخاء الخصية، قم بتم تثبيت نهاية الأنسجة البعيدة في الحلقة المطاطية المحيطة بالمرحلة وهيدرات الأنسجة بالملوحة المالحة. بعد ذلك، قم بإزالة الأنسجة الضامة بعناية دون الإضرار بالعضلات الأساسية.من المهم إزالة جميع الأنسجة الضامة التي من شأنها أن تؤدي إلى صور ضبابية دون الإضرار بالعضلات الكامنة في كريمستر. عندما تمت إزالة جميع الأنسجة، وجعل شق عرضي ملليمتر واحد لفتح العضلات cremaster قبل إجراء شق طولي من مجردة جدا إلى نهاية قريبة من الأنسجة. يجب أن تفتح العضلات كرويا.نشر العضلات بعناية على مرحلة الزجاج وثب العضلات على حلقة المطاط مع الحرص على عدم لمس أو إيذاء المنطقة الوسطى من الأنسجة. ثم قم بتعلق الخصية المتبقية على الجانب لإعطاء الوصول إلى المنطقة ذات الاهتمام وهيدرات الأنسجة مع PSS. للتصور داخل مدينة الأوعية العضلية، ضع عضلات cremaster المثبتة في المجهر المستقيم وحدد الهدف 40X.تنفيذ التسجيلات تحت القذف المستمر مع 35 إلى 37 درجة مئوية PSS من خلال قطعة من أنابيب صغيرة التي تم تسجيلها إلى الهدف من تستقيم من المجهر للسماح نازف مستمر من PSS جنبا إلى جنب مع الهدف إلى أسفل على العضلات والأنسجة. تحديد في سن ما بعد الشعرية الدموية. قياس دوران الدقيقة على venules مع 20 إلى 40 ميكرومتر القطر.ثم تسجيل صور عالية الدقة من دوران الدقيقة من العضلات cremaster على مدى فترة 30 ثانية تعديل التركيز باستمرار بسبب تغييرات طفيفة في انكماش وتخفيف الأنسجة العضلية. يمكن أن يؤدي النسيج الضام الزائد إلى صور مجهرية ضبابية. في هذه الصورة المجهرية التمثيلية، يمكن تحديد فينومي ما بعد الشعرية التي ينبغي أن تكون بين 20 إلى 40 ميكرومتر في القطر من قبل التقاء اثنين من أصغر السفن.يمكن تصور الكريات البيض الملتمَر والمتداولة أثناء تعميم الكريات البيض فقط في إعادة الحركة البطيئة من مقاطع الفيديو المسجلة. قد تؤثر العديد من المعلمات على تجنيد الكريات البيض في الجسم الحي بما في ذلك إخراج القلب وقطر السفينة وسرعة الخط المركزي ومعدل القص الجداري وعدد الكريات البيض المتداولة. لاحظ أن سرعة الخط المركزي تتأثر بإخراج القلب ومقاومة الأوعية الدموية الطرفية وحجم الأوعية الدموية الداخلية.على سبيل المثال، يزيد حجم كبير من رودامين أو مادة تجريبية أخرى تُعطى عبر القسطرة السباتية من سرعة خط الوسط بعد الشعيرات الدموية ويمنع التقاط الكريات البيض والمتداول. على العكس من ذلك، قد يؤدي فشل القلب أو التخدير العميق أو انخفاض حرارة الجسم إلى تقليل تدفق ما بعد الشعيرات الدموية. لتحديد سرعة الخط المركزي، يمكن استخدام الكريات البيض الفلورية المتداولة بحرية أو يجب اغلاج الكريات البيض بمكواشف الفلورسنت مثل رودامين.لاحظ أن سلالات الأنواع البرية قد تظهر تباينًا فسيولوجيًا. على سبيل المثال، تظهر فئران C57BL/6 الكريات البيض المحسنة بوضوح، والتصاق، والهجرة العابرة مقارنة بالحيوانات C57BL/10ScSn. مراحل التخطيط والتوحيد مهمة لإتقان هذه التقنية وخاصة أثناء إعداد العضلات cremaster للمجهر.ويمكن إجراء طرق أخرى لتصور تجنيد الكريات البيض لتوفير معلومات إضافية وللمساعدة في تشريح المساهمة الفردية للعلامات الكرية وخلايا البطانية في سلسلة التوظيف. توفر هذه التقنية منصة للتقييم قبل الإكلينيكي للمتأملين الدوائيين والمواد المقومة المناعية الجديدة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

غير الغازية تصوير الزاجل كريات بيضاء والهجرة في الجسم الحي</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Intravital الميكروسكوب من العقدة الليمفاوية الأربي

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

تتبع الزحف داخل اللمعة العدلات ، والهجرة والانجذاب الكيميائي Transendothelial في الأنسجة بواسطة الميكروسكوب فيديو Intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

المدى الطويل حيوي داخلي Multiphoton المجهر التصوير من الخلايا المناعية في السليمة والمريضة الكبد عن طريق الفئران CXCR6.Gfp مراسل

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

التفاعلات حيوي داخلي المجهري من خلايا الدم البيضاء-البطانية وصفائح الدم الكريات البيض في المساريقية الأوردة في الفئران

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

تصور المتداول الكريات البيض والالتصاق في الفئران التي غرست الثاني انجيوتنسين: تقنيات والمزالق

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...