Name: leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (BMBF) 01GL1746E som en del af PRIMAL Consortium. Forfatterne anerkender Britta Heckmann og Silvia Pezer for dygtig teknisk bistand.

Dyrene blev opstaldet under kontrollerede og specifikke patogenfrie forhold på IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Alle de procedurer, der er beskrevet her, blev godkendt af den lokale IRB og Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Tyskland.
1. Anæstesi administration
<ol><li>Bedøve musen ved intraperitoneal (i.p.) bolus injektion af 125 mg/kg ketamin og 12,5 mg/kg xylazine.</li>
	<li>Placer og fastgør musen i en rygliggende liggende posit...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia.">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo.">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C.">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422 (2014).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner.">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner.">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).</li><li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis.">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li><li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo.">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li><li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time.">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear.">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li><li>von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+peripheral+lymph+node+microcirculation+in+mice.">Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice.</a> Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).</li><li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice.">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li><li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+(IRI)+of+the+rat+cremaster+muscle.">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).</li><li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice.">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457 (2019).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).</li><li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels.">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li><li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology.">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny.">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li></ol>

IVM som metode er blevet udbredt til at studere forskellige celletyper i forskellige organer og er blevet udførligt beskrevet og drøftet19. Hovedformålet med denne undersøgelse er at give en effektiv tilgang til at oprette og udføre IVM i cremaster muskel. Øve metoden vil producere pålidelige og reproducerbare resultater. Således planlægning og standardisering er vigtige faktorer for at mestre teknikken. Frem for alt er teknikken meget afhængig af hæmodynamiske og mikrovaskulære parame...

Intravital mikroskopi (IVM) er et almindeligt anvendt værktøj inden for leukocyt biologi. Leukocyte rekruttering følger en kaskade af veldefinerede begivenheder indledt af leukocyt fange, rullende og vedhæftning til endotelvæggen, og endelig transmigration og extravasation af leukocytter til det faktiske sted for inflammation1. Hvert trin medieres og kontrolleres af forskellige chemokiner (f.eks.2,3 Samspillet mellem forskellige regulerende steder, kontrollerende faktorer og mediatorer af leukocyt rekruttering kaskade som receptor af avancerede glykering slutprodukter (RAGE), intercellulær vedhæftning molekyle 1 (ICAM-1), C-X-C motiv ligand (CXCL)1/2 og deres receptor CXCR2 blev afsløret ved hjælp af IVM4,5,6,7,8,9.
Metoden til IVM er blevet beskrevet for mange forskellige organer og væv såsom tarmen10, hud11, lymfeknuder12, embryonale æggeblomme sæk13 og andre. Men den mest undersøgte metode til IVM er cremaster model, først beskrevet i rotter14. Mens der stadig anvendes i rotter15, metoden er i dag hovedsageligt anvendes i mus på grund af den høje overflod af forskellige transgene linjer. Vores gruppe har for nylig fremhævet den potentielle rolle cremaster IVM inden for inflammatoriske muscolopathies som Duchenne muskelsvind (DMD) studerer dystrophin-mangelfuld mdx mus16. På grund af sin tynde sammenvævede og let tilgængelige fibersammensætning repræsenterer cremaster-musklen den ideelle kandidatmuskel, der skal studeres som en hel mount ved hjælp af lys eller fluorescerende mikroskopi. Leukocyte rekruttering og ekstravasation hovedsageligt finde sted i post-kapillær venules, som let kan identificeres på en kontinuerlig muskuløs lag i cremaster muskel.
Fordelen ved in vivo-billeddannelse sammenlignet med andre in vitro-analyser er dens biologiske kontekst i en levende organisme. Samtidig kan delineating cellespecifikke bidrag til ændret leukocytrekruttering kræve yderligere in vitro-modeller som flowkamre eller endotelaser. Kombinationen af flere metoder vil give mest overbevisende data. Forskere bør være opmærksomme på begrænsningerne i cremaster model som enhver kirurgisk manipulation vil føre til øget leukocyte handel og rekruttering. Derfor er det vanskeligt at vurdere baseline rekruttering med denne metode. På trods af sin brede anvendelse, kan IVM af cremaster være udfordrende og en ny opsætning kan tage tid og ressourcer til at etablere. Vi leverer nu en nem protokol, som vil bidrage til at undgå nogle af de almindelige fejl i IVM. Begrænsninger vil også blive drøftet, og gratis metoder vil blive fremhævet, hvor det er relevant.
IVM af cremaster repræsenterer en ideel tilgang, der skal gennemføres inden for inflammatoriske og smitsomme undersøgelser. Mere specifikt, cremaster model kan være af stor interesse for forskere studerer skeletmuskulatur biologi i forbindelse med inflammatorisk sygdom.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="874">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketanest S</td>
			<td style="width:204px;">Pfizer Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">PZN: 08509909</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Xylazine</td>
			<td style="width:204px;">CP-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Article-nr.: 1205&#160;</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Saline Solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td>PZN 02737756</td>
			<td>surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe needle Omnican F</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td style="width:175px;">REF 9161502</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Suture 6/0 USP</td>
			<td style="width:204px;">Resorba</td>
			<td style="width:175px;">REF 4217</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Polyethylene tube #10&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427401</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Polyethylene tube #90&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427421</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td style="width:175px;">CAS Number 989-38-8&#160;</td>
			<td>leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Setup Equipment</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">BX51W1</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">40-fold objective&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">Achroplan 40 &#215; /0.80 W</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImSpector software</td>
			<td style="width:204px;">Lavision Biotec GmbH</td>
			<td style="width:175px;">ver. 4.0.469</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">National Institute of Health, USA</td>
			<td style="width:175px;">ver. 1.51j8</td>
			<td>software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy

Intravital mikroskopi (IVM) er almindeligt anvendt til at overvåge fysiologiske og patofysiologiske processer inden for leukocyt rekruttering kaskade in vivo. Den nuværende protokol repræsenterer en praktisk og reproducerbar metode til at visualisere leukocyte endothelium interaktion fører til leukocyt rekruttering i skeletmuskulatur afledt væv i den intakte organisme af musen. Modellen gælder for alle forskningsområder, der fokuserer på granulocyt aktivering og deres rolle i sygdom.
Vi leverer en trinvis protokol til at guide gennem metoden og til at fremhæve potentielle faldgruber og tekniske vanskeligheder. Protokollen dækker følgende aspekter: eksperimentelle indstillinger og nødvendigt materiale, anæstesi af musen, dissektion af cremaster muskel samt trakeal og carotis cannulation, IVM optagelser og offline analyse. Dataformater som klæbende leukocytter, rullende flux (RF) og rullende flux fraktion (RFF) er forklaret i detaljer og passende applikationer diskuteres. Repræsentative resultater fra dystrophin mangelfuld mdx mus er fastsat i resultatsektionen.
IVM er et effektivt værktøj til at vurdere leukocyt rekruttering i en in vivo indstilling; men delineating for eksempel endotel og leukocyt funktion kan kræve en kombination med ex vivo opsætninger som flow kammer eksperimenter. Desuden kan den genetiske baggrund for dyr af interesse i høj grad påvirke baseline rekruttering, kræver individuel finjustering af den fastsatte protokol. På trods af sine begrænsninger, iVM kan tjene som en platform til let oversætte in vitro resultater i en levende hvirveldyr organisme.

IVM som pr den medfølgende protokol vil give unikke indsigter i kaskade af leukocyte rekruttering i skeletmuskulatur. Afsnittet resultater vil fokusere på typiske resultater opnået ved IVM og fremhæve potentielle problemer, der kan støde på.
Den eksperimentelle opsætning for intravital mikroskopi er beskrevet i figur 1. Forberedelse af cremaster musklen og fjernelse af bindevæv er afgørende for at opnå fokuserede mikroskopiske billeder med en ensartet ov...

Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Her viser vi, hvordan man udfører intravital mikroskopi på post-kapillær venules af musen cremaster muskel. Almindeligt anvendt på forskellige modeller af inflammation og sepsis, især dem, der induceres af chemokiner og cytokiner, vi fremhæve dens relevans i studiet af muscoloiatier involverer overdrevet muskuløs leukocyt infiltration.

Leukocyte infiltration af Cremaster muskel i mus vurderet af Intravital mikroskopi

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Denne praktiske og reproducerbare metode kan bruges til at visualisere endotel leukocyt interaktioner, der fører til leukocyt rekruttering inden for en intakt mus. Denne teknik præsenterer også et effektivt værktøj til overvågning af fysiologiske og patofysiologiske processer inden for leukocyt rekruttering kaskade in vivo. Metoden kan anvendes i forskellige inflammatoriske og septiske modeller.For eksempel har vi for nylig fremhævet dens relevans i studiet af moskulopatier involverer overdrevet muskel leukocyt infiltration. Vores forslag til kolleger forskere, der overvejer at bruge denne teknik er at få så meget hands-on erfaring som muligt, da metoden er meget modtagelige for mindre afvigelser. Demonstrationen af proceduren vil være Simon Kranig, en kliniker og seniorforsker fra mit laboratorium.Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids i bedøvet forsøgsdyr, fastsætte musen i en dorsal liggende position på en 37 grader Celsius varmepude og bruge en nonabsorbable sterile 6-0 sutur til vind en simpel løkke omkring frontal tænder. Tape sammenføjning ender af suturen til varmepuden og bruge pincet til forsigtigt at løfte huden på midterlinjen. Dernæst lave en cirkulær en til to centimeter diameter snit over halsen og øvre brystkasse og bruge pincet til omhyggeligt dissekere de omkringliggende muskel, fedt, og bindevæv.Placer en sutur under luftrøret. Brug små kirurgiske saks til at gøre en ca 1,3 millimeter tværgående skåret i luftrøret og indføre en polyethylen rør i caudal ende af luftrøret for at sikre de øvre luftveje. Fastgør røret placeret med en enkelt cirkulær knudesutur og find halspulsåren langs højre side af luftrøret.Disseker det omgivende væv fra halspulsåren væggen og passere to stykker sutur under arterien. Bind den første kraniesutur proksimale til bifurcation af halspulsårerne og placer den anden sutur omkring fem til otte millimeter distalt fra den første sutur uden at binde. Dernæst vedhæfte en 30 centimeter stykke polyethylen slanger til en en milliliter sprøjte nål fyldt med saltvand og bruge en syv millimeter fartøj klip til at klemme halspulsåren distally til den anden sutur.Lav en ca 0,5 millimeter tværgående snit i halspulsåren og indføre sterile polyethylen rør i arterien. Fastgør røret med den anden sutur, og fjern karclipsen. Tryk derefter forsigtigt sprøjtestempnet ned for at skylle saltvandet ind i beholderen.For at forberede cremaster musklen, overføre musen til en skræddersyet plast mikroskop ramme med pungen vender mikroskop fase og omhyggeligt forstå pungen på sit mest distale ende med pincet. Trække pungen forsigtigt, fjerne en cirkulær omkring fem millimeter diameter del af scrotal hud holde det åbne væv godt hydreret med saltvand. Brug to pincet til at dissekere det løse bindevæv og finde begge testikler.Tag fat i en testis distally og forsigtigt begynde at trække ud reproduktive væv fjerne eventuelle omkringliggende bindevæv trin for trin. Når testikerne er blevet eksteriøret, pin den distale ende af vævet til gummiringen omkring scenen og fugte vævet med saltvand. Dernæst forsigtigt fjerne bindevæv uden at skade den underliggende cremaster muskel.Det er afgørende at fjerne alle de bindevæv, som ville resultere i slørede billeder uden at skade den underliggende cremaster muskel. Når alt vævet er blevet fjernet, foretage en en millimeter tværgående snit for at åbne cremaster muskel, før du foretager en langsgående snit fra den meget distale til den proksimale ende af vævet. Musklen skal åbne sfærisk.Spred forsigtigt musklen over glasstadiet og pin musklen til gummiringen, idet du passe på ikke at røre eller skade den centrale region af vævet. Derefter pin de resterende testikler til siden for at give adgang til regionen af interesse og fugte vævet med PSS. For intravital visualisering af muskel vaskulaturen, placere den monterede cremaster muskel i opretstående mikroskop og vælge 40X mål.Udfør optagelserne under kontinuerlig superfusion med 35 til 37 grader Celsius PSS gennem et stykke lille slange, der er tapede til mikroskopets opretstående mål for at tillade kontinuerlig dryp af PSS sammen med målet ned på musklen og vævet. Identificer de post-kapillær venules. Mikrocirkulationen måles på venler med en diameter på 20 til 40 mikrometer.Derefter optage billeder i høj opløsning af mikrocirkulationen fra cremaster musklen over en 30-sekunders periode løbende justere fokus på grund af mindre ændringer i sammentrækning og afslapning af muskelvæv. Overskydende bindevæv kan føre til slørede mikroskopiske billeder. I dette repræsentative mikroskopiske billede kan de postkapillære venler, som skal være mellem 20 og 40 mikrometer i diameter, identificeres ved sammenløbet af to mindre fartøjer.Klæbende og rullende leukocytter kan visualiseres, mens cirkulerende leukocytter kun spores i slowmotion replay af optagede videoer. Et væld af parametre kan påvirke leukocyt rekruttering in vivo herunder hjerte-output, fartøj diameter, centerline hastighed, væg forskydning sats, og antallet af cirkulerende leukocytter. Bemærk, at midterlinjen hastighed er påvirket af hjerte-output, perifer vaskulær modstand, og intravasal volumen.For eksempel, en stor mængde af Rhodamine eller andre eksperimentelle stof gives via carotis kateter øger post-kapillær centerlinje hastighed og hæmmer leukocyt fange og rullende. Tværtimod, hjertesvigt, dyb anæstesi, eller hypotermi kan nedsætte post-kapillær flow. For at bestemme midterlinjen hastighed, frit cirkulerende fluorescerende leukocytter kan anvendes eller leukocytter skal farves med fluorescerende reagenser som Rhodamin.Bemærk, at vilde type stammer kan vise fysiologisk varians. For eksempel viser C57BL/6 mus klart forbedret leukocyt rullende, vedhæftning og transmigration sammenlignet med C57BL/10ScSn dyr. Planlægnings- og standardiseringsfaserne er vigtige for at mestre teknikken, især under udarbejdelsen af cremastermuskel til mikroskopi.Andre metoder til at visualisere leukocyt rekruttering kan udføres for at give yderligere oplysninger og for at hjælpe dissekere det individuelle bidrag af leukocytter og endotelceller til rekruttering kaskade. Denne teknik giver en platform for præklinisk evaluering af farmakologiske mediterende og nye immunmodulerende stoffer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging af Mouse Thymus med 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi af milten: Kvantitativ analyse af Parasite mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Stærkt Løst Intravital Striped-belysning mikroskopi af kimcentre

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Long Term Intravital multiphoton Microscopy Imaging af immunceller i rask som syg Lever Brug CXCR6.Gfp Reporter Mus

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital mikroskopi af leukocyt-endotel og blodplade-leukocyt Interaktioner i mesenteriale Veins i mus

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrofiler og monocytter i Mesenterial Veins af Intravital Mikroskopi på bedøvede mus i Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualisere leukocyt rullende og vedhæftning i Angiotensin II-infunderes mus: teknikker og faldgruber

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...