Name: leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) 01GL1746E als onderdeel van het PRIMAL Consortium. De auteurs erkennen Britta Heckmann en Silvia Pezer voor bekwame technische bijstand.

De dieren werden gehuisvest onder gecontroleerde en specifieke ziekteverwekker-vrije voorwaarden bij IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Alle hier beschreven procedures werden goedgekeurd door de lokale IRB en het Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Duitsland.
1. Anesthesietoediening
<ol><li>Verdoof de muis door intraperitoneale (i.p.) bolusinjectie van 125 mg/kg ketamine en 12,5 mg/kg xylazine.</li>
	<li>Plaats en bevestig de muis in een ...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia.">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo.">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C.">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422 (2014).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner.">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner.">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).</li><li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis.">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li><li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo.">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li><li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time.">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear.">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li><li>von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+peripheral+lymph+node+microcirculation+in+mice.">Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice.</a> Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).</li><li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice.">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li><li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+(IRI)+of+the+rat+cremaster+muscle.">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).</li><li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice.">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457 (2019).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).</li><li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels.">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li><li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology.">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny.">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li></ol>

IVM als methode is veel gebruikt om verschillende celtypes in verschillende organen te bestuderen en is uitgebreid beschreven en besproken19. Het belangrijkste doel van deze studie is om een efficiënte aanpak te bieden voor het opzetten en uitvoeren van IVM in de cremaster spier. Het beoefenen van de methode zal betrouwbare en reproduceerbare resultaten opleveren. Planning en standaardisatie zijn dus belangrijke factoren om de techniek onder de knie te krijgen. Bovenal is de techniek zeer afhanke...

Intravital microscopie (IVM) is een veel toegepast instrument op het gebied van leukocytenbiologie. Leukocyten rekrutering volgt een cascade van goed gedefinieerde gebeurtenissen geïnitieerd door leukocyten vangen, rollen en hechting aan de endotheelwand, en ten slotte transmigratie en extravasatie van leukocyten naar de werkelijke plaats van ontsteking1. Elke stap wordt bemiddeld en gecontroleerd door verschillende chemokines (bijvoorbeeld IL-8/CXCL8), receptoren (bijvoorbeeld LFA-1, Mac-1) en bijbehorende endotheelcelhechtingsmoleculen (bijvoorbeeld ICAM-1, VCAM-1 en E-Selectin)2,3. De interactie van verschillende regelgevende sites, controlerende factoren en bemiddelaars van de leukocyten rekruteringcascade zoals receptor van geavanceerde glycatieeindproducten (RAGE), intercellulaire hechtingsmolecuul 1 (ICAM-1), C-X-C motief ligand (CXCL)1/2 en hun receptor CXCR2 werden ontdekt met behulp van IVM4,5,6,7,8,9.
De methode van IVM is beschreven voor veel verschillende organen en weefsels zoals de darm10, huid11, lymfeklieren12, de embryonale dooier zak13 en anderen. Echter, de meest bestudeerde methode van IVM is de cremaster model, voor het eerst beschreven bij ratten14. Terwijl nog steeds gebruikt bij ratten15, de methode wordt tegenwoordig vooral toegepast in muizen als gevolg van de hoge overvloed aan verschillende transgene lijnen. Onze groep heeft onlangs gewezen op de potentiële rol van cremaster IVM op het gebied van inflammatoire muscolopathies zoals Duchenne Spierdystrofie (DMD) bestuderen dystrophin-deficiënte mdx muizen16. Door zijn dunne verweven en gemakkelijk toegankelijke vezelsamenstelling vertegenwoordigt de cremaster spier de ideale kandidaatspier die als geheel moet worden bestudeerd met behulp van lichte of fluorescerende microscopie. Leukocyte nevenwerving en extravasatie vinden voornamelijk plaats in postcapillaire venules, die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd op een continue spierlaag in de cremaster spier.
Het voordeel van in vivo beeldvorming in vergelijking met andere in vitro testen is de biologische context in een levend organisme. Tegelijkertijd kan het afdekken van celspecifieke bijdragen aan gewijzigde leukocytenwerving aanvullende in vitro modellen vereisen, zoals stroomkamers of endotheliale tests. De combinatie van meerdere methoden levert de meeste overtuigende gegevens op. Wetenschappers moeten zich bewust zijn van de beperkingen van de cremaster model als een chirurgische manipulatie zal leiden tot meer leukocyten handel en werving. Daarom is baseline recruitment moeilijk in te schatten met deze methode. Ondanks de brede toepassing, IVM van de cremaster kan een uitdaging zijn en een nieuwe setup kan tijd en middelen te vestigen. We bieden nu een eenvoudig protocol dat zal helpen om een aantal van de gemeenschappelijke fouten in IVM te voorkomen. Ook zullen beperkingen worden besproken en gratis methoden zullen worden gemarkeerd waar van toepassing.
IVM van de cremaster vertegenwoordigt een ideale aanpak die moet worden toegepast op het gebied van ontstekings- en infectieuze studies. Meer specifiek kan het cremaster-model van groot belang zijn voor wetenschappers die skeletspierbiologie bestuderen in de context van ontstekingsziekten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="874">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketanest S</td>
			<td style="width:204px;">Pfizer Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">PZN: 08509909</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Xylazine</td>
			<td style="width:204px;">CP-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Article-nr.: 1205&#160;</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Saline Solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td>PZN 02737756</td>
			<td>surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe needle Omnican F</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td style="width:175px;">REF 9161502</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Suture 6/0 USP</td>
			<td style="width:204px;">Resorba</td>
			<td style="width:175px;">REF 4217</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Polyethylene tube #10&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427401</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Polyethylene tube #90&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427421</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td style="width:175px;">CAS Number 989-38-8&#160;</td>
			<td>leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Setup Equipment</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">BX51W1</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">40-fold objective&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">Achroplan 40 &#215; /0.80 W</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImSpector software</td>
			<td style="width:204px;">Lavision Biotec GmbH</td>
			<td style="width:175px;">ver. 4.0.469</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">National Institute of Health, USA</td>
			<td style="width:175px;">ver. 1.51j8</td>
			<td>software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy

Intravital microscopie (IVM) wordt veel gebruikt om fysiologische en pathofysiologische processen te monitoren binnen de leukocyten rekruteringcascade in vivo. Het huidige protocol vertegenwoordigt een praktische en reproduceerbare methode om de leukocyten endotheelinteractie te visualiseren die leidt tot het rekruteren van skeletspieren in skeletspierafgeleid weefsel in het intacte organisme van de muis. Het model is van toepassing op alle onderzoeksgebieden die zich richten op granulocyteactivering en hun rol bij ziekte.
We bieden een stapsgewijs protocol om de methode te begeleiden en mogelijke valkuilen en technische problemen te benadrukken. Het protocol behandelt de volgende aspecten: experimentele instellingen en vereist materiaal, anesthesie van de muis, dissectie van de cremaster spier evenals tracheale en halsslagader cannulation, IVM opnames en offline analyse. Gegevensformaten zoals aanhangende leukocyten, rolling flux (RF) en rolling flux fraction (RFF) worden in detail uitgelegd en passende toepassingen worden besproken. Representatieve resultaten van dystrofinedeficiënte mdx muizen worden verstrekt in de resultaten sectie.
IVM is een krachtig instrument om de rekrutering van leukocyten in vivo te beoordelen; het afzetten van bijvoorbeeld endotheel- en leukocytenfunctie kan echter een combinatie met ex vivo opstellingen zoals stroomkamerexperimenten vereisen. Bovendien kan de genetische achtergrond van dieren van belang een grote invloed hebben op de aanwerving van basislijnen, waardoor individuele aanpassing van het verstrekte protocol vereist is. Ondanks zijn beperkingen kan IVM dienen als een platform om in vitro bevindingen gemakkelijk te vertalen naar een levend gewerveld organisme.

IVM volgens het meegeleverde protocol zal unieke inzichten opleveren in de cascade van leukocyten rekrutering in skeletspieren. De resultaten sectie zal zich richten op typische resultaten verkregen door IVM en wijzen op potentiële problemen die kunnen tegenkomen.
De experimentele opstelling voor intravitale microscopie wordt beschreven in figuur 1. Voorbereiding van de cremaster spier en verwijdering van bindweefsel is cruciaal om gerichte microscopische beelden...

Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Hier laten we zien hoe je intravitale microscopie uitvoert op postcapillaire venules van de muiscremaster spier. Vaak toegepast op verschillende modellen van ontsteking en sepsis, met name die veroorzaakt door chemokines en cytokines, benadrukken we de relevantie ervan in de studie van muscolopathies waarbij overdreven gespierde leukocyten infiltratie.

Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Deze praktische en reproduceerbare methode kan worden gebruikt om de endotheel leukocyten interacties die leiden tot leukocyte recruitment binnen een intacte muis te visualiseren. Deze techniek presenteert ook een krachtig instrument voor het monitoren van fysiologische en pathofysiologische processen binnen de leukocyte recruitment cascade in vivo. De methode kan worden toegepast in verschillende ontstekings- en septische modellen.Zo hebben we onlangs gewezen op de relevantie ervan in de studie van musculopathieën waarbij overdreven spier leukocyten infiltratie. Onze suggestie aan collega-wetenschappers die overwegen het gebruik van deze techniek is om zo veel hands-on ervaring mogelijk als de methode is zeer gevoelig voor kleine afwijkingen. Het aantonen van de procedure zal Simon Kranig zijn, een clinicus en senior wetenschapper van mijn lab.Na bevestiging van een gebrek aan reactie op teen knijpen in de verdoofde experimentele dier, bevestig de muis in een dorsale ligfiets positie op een 37 graden Celsius verwarming pad en gebruik maken van een niet-onnadrukbare steriele 6-0 hechting om een eenvoudige lus wind rond de frontale tanden. Plak de verbindingsuiteinden van de hechting aan het verwarmingskussen en gebruik een pincet om de huid zachtjes op te tillen in de middellijn. Maak vervolgens een cirkelvormige incisie met een diameter van één tot twee centimeter over de nek en bovenste thorax en gebruik een pincet om de omringende spier-, vet- en bindweefsel zorgvuldig te ontleden.Plaats een hechting onder de luchtpijp. Gebruik een kleine chirurgische schaar om een ongeveer 1,3 millimeter dwarse snede in de luchtpijp te maken en een polyethyleenbuis in het staartzijde van de luchtpijp te introduceren om de bovenste luchtwegen te beveiligen. Bevestig de buis met een enkele cirkelvormige knoop hechting en zoek de halsslagader langs de rechterkant van de luchtpijp.Ontleed het omliggende weefsel van de halsslagaderwand en passeer twee stukken hechting onder de slagader. Bind de eerste schedelhechting proximale aan de splitsing van de halsslagaders en plaats de tweede hechting ongeveer vijf tot acht millimeter distaal van de eerste hechting zonder koppelverkoop. Bevestig vervolgens een stuk polyethyleenbuizen van 30 centimeter aan een spuitnaald van één milliliter gevuld met zoutoplossing en gebruik een zeven millimeter vatclip om de halsslagader onaangeeld vast te klemmen aan de tweede hechting.Maak een ongeveer 0,5 millimeter dwarse snede in de halsslagader en introduceer de steriele polyethyleenbuis in de slagader. Zet de buis vast met de tweede hechting en verwijder de vaartuigclip. Druk vervolgens voorzichtig de spuitzuiger in om zout in het vat te spoelen.Om de cremaster spier voor te bereiden, breng de muis naar een op maat gemaakte plastic microscoop frame met het scrotum naar de microscoop fase en zorgvuldig grijpen het scrotum op zijn meest distale einde met pincet. Trek het scrotum voorzichtig, verwijder een cirkelvormige ongeveer vijf millimeter diameter sectie van scrotale huid houden van het open weefsel goed gehydrateerd met zout. Gebruik twee pincet om het losse bindweefsel te ontleden en beide teelballen te lokaliseren.Pak een testis distally en voorzichtig beginnen te trekken uit het voortplantingsweefsel het verwijderen van eventuele omliggende bindweefsel stap voor stap. Zodra de testis is exteriorized, pin het distale uiteinde van het weefsel aan de rubberen ring rond het podium en hydrateren het weefsel met zout. Verwijder vervolgens voorzichtig het bindweefsel zonder de onderliggende cremasterspier te schaden.Het is van cruciaal belang om al het bindweefsel te verwijderen, wat zou resulteren in wazige beelden zonder de onderliggende cremaster spier te schaden. Wanneer al het weefsel is verwijderd, maak een een millimeter dwarsincisie om de cremaster spier te openen voordat u een longitudinale incisie van de zeer distale naar het proximale einde van het weefsel. De spier moet sferisch open.Spreid de spier voorzichtig over het glazen stadium en speld de spier vast aan de rubberen ring en zorg ervoor dat het centrale gebied van het weefsel niet wordt aangeraakt of beschadigd. Dan pin de resterende testis aan de zijkant om toegang te geven tot het gebied van belang en hydrateren het weefsel met PSS. Voor intravitale visualisatie van de spiervaatculatuur, plaats de gemonteerde cremaster spier in de rechtopstaande microscoop en selecteer de 40X doelstelling.Voer de opnames onder continue superfusie met 35 tot 37 graden Celsius PSS door middel van een stuk van kleine buizen die is geplakt op de rechte doelstelling van de microscoop om continue druipen van PSS naast het doel naar beneden op de spier en weefsel. Identificeer de post-capillaire venules. Meet de microcirculatie op venules met een diameter van 20 tot 40 micrometer.Neem vervolgens beelden met hoge resolutie op van de microcirculatie van de cremasterspier gedurende een periode van 30 seconden, waarbij de focus continu wordt aangepast als gevolg van lichte veranderingen in de samentrekking en ontspanning van het spierweefsel. Overtollig bindweefsel kan leiden tot wazige microscopische beelden. In dit representatieve microscopische beeld kunnen de postcapillaire venules met een diameter van 20 tot 40 micrometer worden geïdentificeerd aan de hand van de samenvloeiing van twee kleinere vaten.Aanhangende en rollende leukocyten kunnen worden gevisualiseerd tijdens het circuleren van leukocyten mogen alleen worden gevolgd in slow motion replay van opgenomen video's. Een veelheid van parameters kan invloed hebben op leukocyten werving in vivo met inbegrip van de cardiale output, vatdiameter, middellijn snelheid, muur shear rate, en het aantal circulerende leukocyten. Merk op dat de middellijn snelheid wordt beïnvloed door cardiale output, perifere vasculaire weerstand, en intravasale volume.Bijvoorbeeld, een groot volume van Rhodamine of andere experimentele stof gegeven via de halsroïde katheter verhoogt de post-capillaire middellijn snelheid en remt leukocyten afvang en rollen. Integendeel, hartfalen, diepe anesthesie, of onderkoeling kan de post-capillaire stroom verminderen. Om de middellijnsnelheid te bepalen, kunnen vrij circulerende fluorescerende leukocyten worden gebruikt of moeten de leukocyten worden geverfd met fluorescerende reagentia zoals Rhodamine.Houd er rekening mee dat wilde type stammen fysiologische variantie kunnen vertonen. C57BL/6-muizen vertonen bijvoorbeeld duidelijk verbeterde leukocytenrollen, hechting en transmigratie in vergelijking met C57BL/10ScSn-dieren. De plannings- en standaardisatiefasen zijn belangrijk voor het beheersen van de techniek, vooral tijdens de voorbereiding van cremasterspier voor microscopie.Andere methoden voor het visualiseren van leukocytenwerving kunnen worden uitgevoerd om aanvullende informatie op te leveren en om de individuele bijdrage van leukocyten en endotheelcellen aan de rekruteringscasstief te ontleden. Deze techniek biedt een platform voor de preklinische evaluatie van farmacologische meditators en nieuwe immuunmodulatieve stoffen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Niet-invasieve beeldvorming van Leukocyte Homing en migratie In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Intravitale Microscopie van de lies lymfkliertest

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravitale Microscopie van de milt: Kwantitatieve Analyse van Parasite Mobiliteit en Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualiseren van leukocyten rollen en hechting in angiotensine II-geïnfundeerd muizen: technieken en valkuilen

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...