Name: leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00
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Diese Studie wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) 01GL1746E im Rahmen des PRIMAL-Konsortiums unterstützt. Die Autoren würdigen Britta Heckmann und Silvia Pezer für geschickte technische Unterstützung.

Die Tiere wurden in der IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung) in Heidelberg unter kontrollierten und spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht. Alle hier beschriebenen Verfahren wurden vom örtlichen IRB und dem Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Württemberg, Deutschland genehmigt.
1. Anästhesie-Verwaltung
<ol><li>Anästhesisieren Sie die Maus durch intraperitoneale (i.p.) Bolusinjektion von 125 mg/kg Ketamin und 12,5 mg/kg Xylazin.</li>
	<li>Platzieren...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia.">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo.">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C.">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422 (2014).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner.">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner.">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).</li><li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis.">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li><li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo.">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li><li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time.">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear.">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li><li>von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+peripheral+lymph+node+microcirculation+in+mice.">Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice.</a> Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).</li><li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice.">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li><li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+(IRI)+of+the+rat+cremaster+muscle.">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).</li><li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice.">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457 (2019).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).</li><li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels.">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li><li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology.">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny.">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li></ol>

IVM als Methode wurde weit verbreitet verwendet, um verschiedene Zelltypen in verschiedenen Organen zu studieren und wurde ausführlich beschrieben und diskutiert19. Das Hauptziel dieser Studie ist es, einen effizienten Ansatz zu bieten, um IVM im Cremaster-Muskel einzurichten und durchzuführen. Das Üben der Methode führt zu zuverlässigen und reproduzierbaren Ergebnissen. Daher sind Planung und Standardisierung Schlüsselfaktoren, um die Technik zu beherrschen. Vor allem ist die Technik sehr a...

Intravital-Mikroskopie (IVM) ist ein häufig angewandtes Werkzeug auf dem Gebiet der Leukozytenbiologie. Leukozyten Rekrutierung folgt einer Kaskade von genau definierten Ereignissen durch Leukozyten-Capture, Rollen und Adhäsion an der Endothelwand initiiert, und schließlich Transmigration und Extravasation von Leukozyten an die tatsächliche Stelle der Entzündung1. Jeder Schritt wird durch verschiedene Chemokine (z.B. IL-8/CXCL8), Rezeptoren (z.B. LFA-1, Mac-1) und entsprechenden Endothelzelladhäsionsmolekülen (z.B. ICAM-1, VCAM-1 und E-Selectin)2,3. Die Wechselwirkung verschiedener regulatorischer Standorte, Steuerungsfaktoren und Mediatoren der Leukozytenrekrutierungskaskade wie Rezeptor fortschrittlicher Glykationsendprodukte (RAGE), interzelluläres Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1), C-X-C-Motivliganden (CXCL)1/2 und deren Rezeptor CXCR2 wurden mit IVM4,5,6,7,8,9.
Die Methode der IVM wurde für viele verschiedene Organe und Gewebe wie der Darm10, Haut11, Lymphknoten12, der embryonale Dottersack13 und andere beschrieben. Die am weitesten untersuchte Methode von IVM ist jedoch das Cremaster-Modell, das zuerst in Ratten14beschrieben wurde. Während noch bei Ratten15verwendet, wird die Methode heutzutage vor allem bei Mäusen aufgrund der hohen Fülle von verschiedenen transgenen Linien angewendet. Unsere Gruppe hat vor kurzem die mögliche Rolle von Cremaster IVM auf dem Gebiet der entzündlichen Muscolopathien wie Duchenne Muskeldystrophie (DMD) Untersuchung dystrophin-deficient mdx Mäuse16hervorgehoben. Aufgrund seiner dünnen verwobenen und leicht zugänglichen Faserzusammensetzung stellt der Cremaster-Muskel den idealen Kandidatenmuskel dar, der als Gesamtberg mittels Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden kann. Leukozytenrekrutierung und Extravasation finden hauptsächlich in postkapillaren Venulen statt, die leicht auf einer kontinuierlichen Muskelschicht im Cremaster-Muskel identifiziert werden können.
Der Vorteil der In-vivo-Bildgebung im Vergleich zu anderen In-vitro-Assays ist ihr biologischer Kontext in einem lebenden Organismus. Gleichzeitig kann die Abgrenzung zellspezifischer Beiträge zur veränderten Leukozytenrekrutierung zusätzliche In-vitro-Modelle wie Strömungskammern oder endotheliale Assays erfordern. Die Kombination mehrerer Methoden liefert überzeugende Daten. Wissenschaftler sollten sich der Einschränkungen des Cremaster-Modells bewusst sein, da jede chirurgische Manipulation zu einem verstärkten Leukozytenhandel und Rekrutierung führen wird. Daher ist die Einstellung von Baselinen mit dieser Methode schwer abzuschätzen. Trotz seiner breiten Anwendung kann IVM des Cremasters eine Herausforderung sein und ein neuartiges Setup kann Zeit und Ressourcen in Anspruch nehmen. Wir stellen jetzt ein einfaches Protokoll zur Verfügung, das dazu beitragen wird, einige der häufigsten Fehler in IVM zu vermeiden. Außerdem werden Einschränkungen diskutiert und gegebenenfalls kostenlose Methoden hervorgehoben.
IVM des Cremasters stellt einen idealen Ansatz dar, der im Bereich der entzündlichen und infektiösen Studien umgesetzt werden kann. Genauer gesagt, kann das Cremaster-Modell von hohem Interesse für Wissenschaftler sein, die Skelettmuskelbiologie im Kontext von entzündlichen Erkrankungen studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="874">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketanest S</td>
			<td style="width:204px;">Pfizer Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">PZN: 08509909</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Xylazine</td>
			<td style="width:204px;">CP-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Article-nr.: 1205&#160;</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Saline Solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td>PZN 02737756</td>
			<td>surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe needle Omnican F</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td style="width:175px;">REF 9161502</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Suture 6/0 USP</td>
			<td style="width:204px;">Resorba</td>
			<td style="width:175px;">REF 4217</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Polyethylene tube #10&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427401</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Polyethylene tube #90&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427421</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td style="width:175px;">CAS Number 989-38-8&#160;</td>
			<td>leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Setup Equipment</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">BX51W1</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">40-fold objective&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">Achroplan 40 &#215; /0.80 W</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImSpector software</td>
			<td style="width:204px;">Lavision Biotec GmbH</td>
			<td style="width:175px;">ver. 4.0.469</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">National Institute of Health, USA</td>
			<td style="width:175px;">ver. 1.51j8</td>
			<td>software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy

Intravital-Mikroskopie (IVM) ist weit verbreitet, um physiologische und pathophysiologische Prozesse innerhalb der Leukozyten-Rekrutierungskaskade in vivo zu überwachen. Das aktuelle Protokoll stellt eine praktische und reproduzierbare Methode dar, um die Leukozyten-Endothel-Wechselwirkung zu visualisieren, die zu einer Leukozytenrekrutierung im skelettierten Muskelgewebe innerhalb des intakten Organismus der Maus führt. Das Modell gilt für alle Forschungsbereiche, die sich auf die Granulozytenaktivierung und ihre Rolle bei Krankheiten konzentrieren.
Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um die Methode zu durchführen und mögliche Fallstricke und technische Schwierigkeiten aufzuzeigen. Das Protokoll behandelt folgende Aspekte: experimentelle Einstellungen und benötigtes Material, Anästhesie der Maus, Zerlegung des Cremastermuskels sowie Tracheal- und Karotiskannulation, IVM-Aufnahmen und Offline-Analyse. Datenformate wie haftende Leukozyten, Rolling Flux (RF) und Rolling Flux Fraction (RFF) werden ausführlich erläutert und entsprechende Anwendungen diskutiert. Repräsentative Ergebnisse von Dystrophin-Mangel mdx Mäuse nd werden im Ergebnisbereich zur Verfügung gestellt.
IVM ist ein leistungsfähiges Instrument zur Bewertung der Leukozytenrekrutierung in einem In-vivo-Umfeld; Die Abgrenzung z.B. der Endothel- und Leukozytenfunktion kann jedoch eine Kombination mit ex vivo-Setups wie Strömungskammerexperimenten erfordern. Darüber hinaus kann der genetische Hintergrund von Tieren von Interesse die Einstellung von Baselinen stark beeinflussen, was eine individuelle Feinabstimmung des vorgelegten Protokolls erfordert. Trotz seiner Einschränkungen kann IVM als Plattform dienen, um In-vitro-Befunde leicht in einen lebenden Wirbeltierorganismus zu übersetzen.

IVM nach dem bereitgestellten Protokoll liefert einzigartige Einblicke in die Kaskade der Leukozytenrekrutierung im Skelettmuskel. Der Ergebnisabschnitt konzentriert sich auf typische Ergebnisse von IVM und hebt potenzielle Probleme auf, die auftreten können.
Der Versuchsaufbau für die intravitale Mikroskopie ist in Abbildung 1dargestellt. Die Vorbereitung des Cremaster-Muskels und die Entfernung des Bindegewebes ist entscheidend, um fokussierte mikroskopische B...

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Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.

Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Diese praktische und reproduzierbare Methode kann verwendet werden, um die Endothelleukozyten-Wechselwirkungen zu visualisieren, die zu einer Leukozytenrekrutierung innerhalb einer intakten Maus führen. Diese Technik stellt auch ein leistungsfähiges Werkzeug zur Überwachung physiologischer und pathophysiologischer Prozesse innerhalb der Leukozytenrekrutierungskaskade in vivo dar. Die Methode kann in verschiedenen entzündlichen und septischen Modellen angewendet werden.Zum Beispiel haben wir vor kurzem seine Relevanz in der Studie von Muskulaturen mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervorgehoben. Unser Vorschlag an andere Wissenschaftler, die erwägen, diese Technik zu verwenden, ist, so viel praktische Erfahrung wie möglich zu erhalten, da die Methode sehr anfällig für geringfügige Abweichungen ist. Demonstriert wird das Verfahren von Simon Kranig, einem Arzt und leitenden Wissenschaftler aus meinem Labor.Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifen im anästhesierten Versuchstier, fixieren Sie die Maus in einer dorsalen Liegeposition auf einem 37 Grad Celsius Heizpad und verwenden Sie eine nicht resorbierbare sterile 6-0 Naht, um eine einfache Schleife um die Frontalzähne zu wickeln. Kleben Sie die Verbindungsenden der Naht an das Heizkissen und verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut an der Mittellinie sanft zu heben. Als nächstes machen Sie einen kreisförmigen Ein- bis zwei Zentimeter Durchmesser Schnitt über den Hals und oberen Thorax und verwenden Pinzette, um sorgfältig die umgebenden Muskel- und Fett- und Bindegewebe zu sezieren.Legen Sie eine Naht unter die Luftröhre. Verwenden Sie eine kleine chirurgische Schere, um einen ca. 1,3 Millimeter quer in die Luftröhre geschnitten zu machen und führen Sie ein Polyethylenrohr in das kaudale Ende der Luftröhre ein, um die oberen Atemwege zu sichern. Fixieren Sie das Rohr mit einer einzigen kreisförmigen Knoten Naht und lokalisieren Sie die Halsschlagader entlang der rechten Seite der Luftröhre.Sezieren Sie das umgebende Gewebe von der Halsschlagaderwand und passieren Sie zwei Stücke der Naht unter der Arterie. Binden Sie die erste Schädelnaht proximal an die Bifurkation der Karotisarterien und positionieren Sie die zweite Naht etwa fünf bis acht Millimeter distal von der ersten Naht ohne Bindung. Als nächstes befestigen Sie ein 30-Zentimeter-Stück Polyethylenschläuche an einer mit Einer Milliliter-Spritze gefüllten Spritzennadel und klemmen Sie die Halsschlagader mit einem sieben Millimeter langen Gefäßclip distal an die zweite Naht.Machen Sie einen ca. 0,5 Millimeter quer geschnittenen in der Halsschlagader und führen Sie das sterile Polyethylenrohr in die Arterie ein. Sichern Sie das Rohr mit der zweiten Naht und entfernen Sie den Behälterclip. Drücken Sie dann vorsichtig den Spritzenkolben, um Dies in das Gefäß zu spülen.Um den Cremaster-Muskel vorzubereiten, übertragen Sie die Maus auf einen maßgeschneiderten Kunststoff-Mikroskoprahmen mit dem Hodensack zur Mikroskopstufe und greifen Sie den Hodensack an seinem distalsten Ende mit einer Pinzette vorsichtig. Ziehen Sie den Hodensack sanft, entfernen Sie einen kreisförmigen Abschnitt von etwa fünf MillimeterDurchmesser der skrotalen Haut halten das offene Gewebe gut hydratisiert mit Saline. Verwenden Sie zwei Pinzette, um das lose Bindegewebe zu sezieren und beide Hoden zu lokalisieren.Greifen Sie einen Testis distally und sanft beginnen, das Fortpflanzungsgewebe entfernen alle umgebenden Bindegewebe Schritt für Schritt. Sobald der Hoden exzessiver geworden ist, fixieren Sie das distale Ende des Gewebes an den Gummiring, der das Stadium umgibt, und hydratisieren Sie das Gewebe mit Einer Saline. Als nächstes entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe, ohne den darunter liegenden Cremaster-Muskel zu schädigen.Es ist wichtig, das gesamte Bindegewebe zu entfernen, was zu verschwommenen Bildern führen würde, ohne den zugrunde liegenden Cremaster-Muskel zu schädigen. Wenn das gesamte Gewebe entfernt wurde, machen Sie einen einen Millimeter Querschnitt, um den Cremaster-Muskel zu öffnen, bevor Sie einen Längsschnitt vom sehr distalen bis zum proximalen Ende des Gewebes machen. Der Muskel sollte sich sphärisch öffnen.Verteilen Sie den Muskel vorsichtig über die Glasbühne und heften Sie den Muskel an den Gummiring, wobei darauf geachtet wird, den zentralen Bereich des Gewebes nicht zu berühren oder zu schädigen. Dann heften Sie die restlichen Hoden an die Seite, um Den Zugang zu der Region von Interesse zu geben und hydratisieren Sie das Gewebe mit PSS. Zur intravitalen Visualisierung der Muskelvaskulatur legen Sie den montierten Cremaster-Muskel in das aufrechte Mikroskop und wählen Sie das 40X-Objektiv aus.Führen Sie die Aufnahmen unter kontinuierlicher Superfusion mit 35 bis 37 Grad Celsius PSS durch ein Stück kleiner Schläuche durch, die auf das aufrechte Ziel des Mikroskops geklebt wurden, um ein kontinuierliches Abtropfen von PSS neben dem Objektiv auf den Muskel und das Gewebe zu ermöglichen. Identifizieren Sie die postkapillaren Venules. Messen Sie die Mikrozirkulation an Venulen mit einem Durchmesser von 20 bis 40 Mikrometern.Dann nehmen Sie hochauflösende Bilder der Mikrozirkulation aus dem Cremaster-Muskel über einen 30-Sekunden-Zeitraum kontinuierlich Anpassung des Fokus aufgrund von leichten Veränderungen in der Kontraktion und Entspannung des Muskelgewebes auf. Überschüssiges Bindegewebe kann zu verschwommenen mikroskopischen Bildern führen. In diesem repräsentativen mikroskopischen Bild können die postkapillaren Venulen, die zwischen 20 und 40 Mikrometer Durchmesser haben sollten, durch den Zusammenfluss von zwei kleineren Gefäßen identifiziert werden.Anhühlunglerundige und rollende Leukozyten können visualisiert werden, während zirkulierende Leukozyten nur in Zeitlupenwiedergabe von aufgenommenen Videos verfolgt werden dürfen. Eine Vielzahl von Parametern kann die Leukozytenrekrutierung in vivo beeinflussen, einschließlich der Herzleistung, des Gefäßdurchmessers, der Mittelliniengeschwindigkeit, der Wandscherrate und der Anzahl der zirkulierenden Leukozyten. Beachten Sie, dass die Mittelliniengeschwindigkeit durch Herzleistung, periphere Gefäßresistenz und Intravasalvolumen beeinflusst wird.Zum Beispiel erhöht ein großes Volumen von Rhodamine oder einer anderen experimentellen Substanz, die über den Karotiskatheter gegeben wird, die postkapillare Mittellinie geschwindigkeit und hemmt Die Leukozytenaufnahme und das Walzen. Im Gegenteil, Herzinsuffizienz, tiefe Anästhesie oder Unterkühlung können den postkapillaren Fluss verringern. Zur Bestimmung der Mittelliniengeschwindigkeit können frei zirkulierende fluoreszierende Leukozyten verwendet werden oder die Leukozyten müssen mit fluoreszierenden Reagenzien wie Rhodamine gefärbt werden.Beachten Sie, dass Wildtypstämme physiologische Varianz aufweisen können. Beispielsweise zeigen C57BL/6-Mäuse im Vergleich zu C57BL/10ScSn-Tieren deutlich verbessertes Leukozytenwalzen, Adhäsion und Transmigration. Die Planungs- und Standardisierungsphasen sind wichtig für die Beherrschung der Technik, insbesondere bei der Vorbereitung von Cremaster-Muskeln für die Mikroskopie.Andere Methoden zur Visualisierung der Leukozytenrekrutierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Informationen zu liefern und den individuellen Beitrag von Leukozyten und Endothelzellen zur Rekrutierungskaskade zu sezieren. Diese Technik bietet eine Plattform für die präklinische Bewertung von pharmakologischen Meditierenden und neuartigen immunmodulatorischen Substanzen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

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Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualisierung von Leukozyten Rollen und Haftung bei Angiotensin II-infundiert Mäusen: Techniken und Fallstricke

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...