Name: leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

מחקר זה היה נתמך על ידי הממשלה הפדרלית הגרמני של החינוך והמחקר (BMBF) 01GL1746E כחלק הקונסורציום הראשוני. המחברים מכירים ברטה הירמן וסילביה Pezer לקבלת סיוע טכני מיומן.

בעלי חיים היו תחת מבוקרת וספציפי התנאים ללא הפתוגן בבית IBF (ביופקולטציזיסיאיסמליסספיאדיבאיזשיונגאבריסגריסיוריסיימאנטאינטונג), חאידלברג. כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על-ידי ה-IRB המקומי והרגראשיפראססרוסיה קרלסרוהה, באדן-Wuerttemberg, גרמניה.
1. מינהל הרדמה
<ol><li>מורדם העכבר על י?...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia.">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo.">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C.">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422 (2014).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner.">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner.">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).</li><li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis.">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li><li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo.">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li><li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time.">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear.">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li><li>von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+peripheral+lymph+node+microcirculation+in+mice.">Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice.</a> Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).</li><li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice.">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li><li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+(IRI)+of+the+rat+cremaster+muscle.">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).</li><li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice.">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457 (2019).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).</li><li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels.">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li><li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology.">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny.">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li></ol>

IVM כשיטה נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד סוגים שונים של תאים באיברים שונים ותיאר בהרחבה ודנו19. המטרה העיקרית של מחקר זה היא לספק גישה יעילה להגדיר ולבצע IVM בשריר cremaster. תרגול השיטה יפיק תוצאות אמינות ומיוצרות. לפיכך, תכנון וסטנדרטיזציה הם גורמי מפתח לשלוט בטכניקה. מעל לכל, הטכניקה תלו...

מיקרוסקופ אינטרטל (IVM) הוא כלי מיושם נפוץ בתחום הביולוגיה הלוקוציט. גיוס לוקיציט מלווה במפל של אירועים מוגדרים היטב, שיזמו לכידת הלוקוציט, גלגול והדבקה לקיר האנדותל, ולבסוף העברת הגירה והעברה של לוקיציטים לאתר בפועל של דלקת1. כל צעד מתווך ונשלט על ידי נוגדנים שונים (למשל, IL-8/CXCL8), קולטנים (g., lfa-1, Mac-1) ומולקולות הדבקה של תא אנדותל המקביל (g., icam-1, vcam-1 ו-e-selectin)2,3. האינטראקציה של אתרים רגולאטורים שונים, מקדמי שליטה ומגשרים של גיוס לוקיציט מדורגים כמו קולטן של מוצרים מתקדמים לסוף גליקטיון (זעם), מולקולה הדבקה משולבת 1 (icam -1), c-X-c מוטיב ליגנד (cxcl) 1/2 והקולטן שלהם CXCR2 נחשפו באמצעות ivm4,5,6,7,8,9
השיטה של IVM תוארה עבור איברים ורקמות שונים רבים כגון המעי10, עור11, בלוטות הלימפה12, שק החלמון העובריים13 ואחרים. עם זאת, שיטת המחקר הנרחב ביותר של IVM הוא מודל cremaster, המתואר לראשונה חולדות14. בעוד שימוש עדיין בחולדות15, השיטה מיושמת כיום בעיקר בעכברים בשל שפע גבוה של קווים טרנסגניים שונים. הקבוצה שלנו הדגישה לאחרונה את התפקיד הפוטנציאלי של מאסטר cremaster בתחום של מוסקולוטים דלקתיים כמו Duchenne ניוון שרירים (DMD) ללמוד הדיסטרופין לקויה עכברים16. בשל שזור דק ונגיש בקלות הרכב סיבים, שריר cremaster מייצג את השריר האידיאלי המועמד ללמוד כמו הר שלם באמצעות מיקרוסקופ אור או פלורסנט. גיוס לוקיציט ומיון מתמשך מתקיימים בעיקר בעזרת שכבות פוסט-קפיריות, שיכולות להיות מזוהות על שכבת שרירים רציפה בשריר הקרמאסטר.
היתרון של הדמיה vivo לעומת אחרים מחוץ לבית הספר הוא ההקשר הביולוגי שלה באורגניזם חי. במקביל, מציינת תרומות ספציפיות לתאים לגיוס לוקמיה משתנה עשויה לדרוש תוספת של מודלים להפריה חוץ-גופית כגון תאי זרימה או אנדותל אסמאל. השילוב בין שיטות מרובות יניב את הנתונים המששכנעים ביותר. מדענים צריכים להיות מודעים למגבלות של מודל cremaster כמו כל מניפולציה כירורגית יוביל להגדלת הסחר בסמים וגיוס. מכאן, הגיוס הבסיסי קשה להעריך עם שיטה זו. למרות היישום הרחב שלה, IVM של cremaster יכול להיות מאתגר וכיוונון הרומן עשוי לקחת זמן ומשאבים כדי להקים. כעת אנו מספקים פרוטוקול קל אשר יסייע להימנע כמה טעויות נפוצות ב-IVM. כמו כן, יידונו מגבלות ושיטות מסוימות יהיו מודגשות במידת הצורך.
האגודה מייצגת גישה אידיאלית ליישום בתחום של מחקרים דלקתיים וזיהומיות. באופן ספציפי יותר, מודל cremaster עשוי להיות עניין גבוה למדענים לימוד ביולוגיה שריר השלד בהקשר של מחלות דלקתיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="874">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketanest S</td>
			<td style="width:204px;">Pfizer Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">PZN: 08509909</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Xylazine</td>
			<td style="width:204px;">CP-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Article-nr.: 1205&#160;</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Saline Solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td>PZN 02737756</td>
			<td>surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe needle Omnican F</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td style="width:175px;">REF 9161502</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Suture 6/0 USP</td>
			<td style="width:204px;">Resorba</td>
			<td style="width:175px;">REF 4217</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Polyethylene tube #10&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427401</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Polyethylene tube #90&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427421</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td style="width:175px;">CAS Number 989-38-8&#160;</td>
			<td>leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Setup Equipment</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">BX51W1</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">40-fold objective&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">Achroplan 40 &#215; /0.80 W</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImSpector software</td>
			<td style="width:204px;">Lavision Biotec GmbH</td>
			<td style="width:175px;">ver. 4.0.469</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">National Institute of Health, USA</td>
			<td style="width:175px;">ver. 1.51j8</td>
			<td>software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy

מיקרוסקופ אינטרטל (IVM) משמש רבות לניטור תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזילוגיים בתוך הדירוג הvivo של הגיוס הלוקואני. הפרוטוקול הנוכחי מייצג שיטה מעשית ומנויית כדי להמחיש את האינטראקציה האנדוקובית לוקיציט המובילה לגיוס לוקיציט ברקמת שריר השלד בתוך האורגניזם השלם של העכבר. המודל ישים לכל תחומי המחקר המתמקדים בהפעלת גרנולוציט ותפקידם במחלות.
אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול להנחות דרך השיטה ולהדגיש מלכודות פוטנציאליות וקשיים טכניים. הפרוטוקול מכסה את ההיבטים הבאים: הגדרות ניסיוני וחומר נדרש, הרדמה של העכבר, חיתוך של שריר cremaster, כמו גם הקנה הנשימה והעורק הראשי, הקלטות IVM וניתוח לא מקוון. תבניות נתונים כמו לוקיציטים מדומה, שטף מתגלגל (RF) ושבר שטף מתגלגל (RFF) מוסברים בפירוט ויישומים מתאימים נדונים. תוצאות הנציג מעכברים mdx לקוי הדיסטרופין מסופקים בסעיף התוצאות.
IVM הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך גיוס לוקיציט ב vivo הגדרה; עם זאת, התיחום למשל לפונקציה אנדותל ולוקיציט עשוי לדרוש שילוב עם הגדרות vivo ex כמו ניסויים בתאי הזרימה. יתרה מזאת, הרקע הגנטי של בעלי העניין עשוי להשפיע במידה ניכרת על גיוס בסיסי, המחייב כוונון משובח של הפרוטוקול המסופק. למרות המגבלות שלה, IVM עשוי לשמש פלטפורמה לתרגם בקלות ממצאים בעלי מבחנה מחוץ לאורגניזם חי בעלי חוליות.

IVM לפי הפרוטוקול המסופק תניב תובנות ייחודיות לתוך המפל של גיוס לוקיציט שריר השלד. סעיף התוצאות יתמקד בתוצאות אופייניות המתקבלות על-ידי IVM וידגיש בעיות פוטנציאליות שעלולות להיתקל בהן.
התוכנית הניסיונית למיקרוסקופיה הינה מחולקת באיור 1. הכנת שריר cremaster והסרת ?...

Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

כאן, אנו מראים כיצד לבצע מיקרוסקופ לאחר הנימי של השריר הראשי של העכבר. בדרך כלל מיושם מודלים שונים של דלקת אלח דם, במיוחד אלה המושרה על ידי נוגדנים ו ציטוקינים, אנו להדגיש את הרלוונטיות שלה במחקר של מוסקולופאאס מעורבים חדירה מוגזמת שרירי לוקיציט.

הסתננות לאוציט של שריר Cremaster בעכברים המוערך על ידי מיקרוסקופ אינטרטל

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

שיטה מעשית זו לשחזור ניתן להשתמש כדי לדמיין את האינטראקציות אנדותל לויקוציט שמובילים לגיוס לויקוציט בתוך עכבר שלם. טכניקה זו מציגה גם כלי רב עוצמה לניטור תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים בתוך מפל גיוס לויקוציט ב- vivo. השיטה יכולה להיות מיושמת במודלים דלקתיים וספתיים שונים.לדוגמה, לאחרונה הדגשנו את הרלוונטיות שלה בחקר השרירים הכרוכים חדירת לויוציט שרירים מוגזמת. ההצעה שלנו למדענים אחרים השוקלים להשתמש בטכניקה זו היא לקבל כמה שיותר ניסיון מעשי ככל השיטה רגישה מאוד לסטיות קלות. הדגימה של ההליך תהיה סיימון קרניג, קלינאי ומדען בכיר מהמעבדה שלי.לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן בבעל החיים הניסיוני הרדמה, לתקן את העכבר במצב שקע הגב על כרית חימום 37 מעלות צלזיוס ולהשתמש תפר סטרילי 6-0 בלתי ניתן לעצירה כדי לסובב לולאה פשוטה סביב השיניים הקדמיות. מדביקים את קצות התפר המצטרפים אל משטח החימום ולהשתמש פינצטה כדי להרים בעדינות את העור בקו האמצע. לאחר מכן, בצע חתך מעגלי בקוטר של 1 עד 2 ס"מ מעל הצוואר ובית החזה העליון ולהשתמש פינצטה כדי לנתח בזהירות את השריר שמסביב, שומן, ורקמות חיבור.מניחים תפר מתחת קנה הנשימה. השתמש מספריים כירורגיים קטנים כדי להפוך כ 1.3 מילימטר רוחבי לחתוך לתוך קנה הנשימה ולהציג צינור פוליאתילן לתוך הקצה caudal של קנה הנשימה כדי לאבטח את דרכי הנשימה העליונות. לתקן את הצינור הממוקם עם תפר קשר עגול אחד ולאתר את העורק הראשי לאורך הצד הימני של קנה הנשימה.לנתח את הרקמה שמסביב מקיר העורק הראשי ולהעביר שתי חתיכות תפר מתחת לעורק. לקשור את התפר הגולגולתי הראשון proximal כדי bifurcation של העורקים הראשיים ולמקם את התפר השני על חמישה עד שמונה מילימטרים דיסטלי מן התפר הראשון ללא קשירה. לאחר מכן, חבר חתיכה של צינורות פוליאתילן באורך 30 ס"מ למחט מזרק מיליליטר אחת מלאה מלוחים ולהשתמש קליפ כלי שבעה מילימטר כדי להדק את העורק הראשי distally לתפר השני.הפוך חתך רוחבי כ 0.5 מילימטר העורק הראשי ולהציג את צינור פוליאתילן סטרילי לתוך העורק. לאבטח את הצינור עם התפר השני ולהסיר את קליפ כלי. ואז בעדינות לדכא את הבוכנה מזרק לשטוף מלוחים לתוך הכלי.כדי להכין את שריר cremaster, להעביר את העכבר למסגרת מיקרוסקופ פלסטיק בהתאמה אישית עם שק האשכים מול שלב המיקרוסקופ בזהירות לתפוס את שק האשכים בקצה הדיסטלי ביותר שלה עם פינצטה. משיכת שק האשכים בעדינות, להסיר קטע מעגלי על חמישה מילימטר קוטר של עור האשכים שמירה על הרקמה הפתוחה hydrated היטב עם מלוחים. השתמש בשני פינצטה כדי לנתח את רקמת החיבור הרופפת ולאתר את שני האשכים.לתפוס אשך אחד בנפרד בעדינות להתחיל לשלוף את רקמת הרבייה הסרת כל רקמות החיבור שמסביב צעד אחר צעד. לאחר האשך כבר החיצוני, להצמיד את הקצה הדיסטלי של הרקמה לטבעת הגומי המקיפה את הבמה לחות את הרקמה עם מלוחים. לאחר מכן, להסיר בזהירות את רקמת החיבור מבלי לפגוע בשריר cremaster הבסיסית.זה קריטי כדי להסיר את כל רקמת החיבור אשר יגרום תמונות מטושטשות מבלי לפגוע בשריר cremaster הבסיסית. כאשר כל הרקמה הוסרה, לעשות חתך רוחבי מילימטר אחד כדי לפתוח את שריר cremaster לפני ביצוע חתך אורך מן דיסטלי מאוד לקצה הפרוקסימלי של הרקמה. השריר צריך להיפתח בצורה כדורית.בזהירות להפיץ את השריר על שלב הזכוכית ולהצמיד את השריר לטבעת גומי דואג לא לגעת או לפגוע באזור המרכזי של הרקמה. ואז להצמיד את האשכים הנותרים לצד כדי לתת גישה לאזור העניין לחות את הרקמה עם PSS. לקבלת הדמיה תוך-בלתי נמנעת של כלי הדם בשריר, מניחים את שריר הקרמאסטר הרכוב במיקרוסקופ הזקוף ובחרו את המטרה 40X.בצע את ההקלטות תחת עירוי-על מתמשך עם PSS 35 עד 37 מעלות צלזיוס באמצעות פיסת צינורות קטנים שהודבקה למטרה זקוף של המיקרוסקופ כדי לאפשר טפטוף מתמשך של PSS לצד המטרה אל השריר והרקמות. זהה את הוונולים שלאחר נימי. למדוד את המיקרו-סירקולציה על ורנולים בקוטר של 20 עד 40 מיקרומטר.לאחר מכן להקליט תמונות ברזולוציה גבוהה של microcirculation משריר cremaster על פני תקופה של 30 שניות ברציפות התאמת המוקד עקב שינויים קלים התכווצות הרפיה של רקמת השריר. עודף רקמת חיבור יכול להוביל לתמונות מיקרוסקופיות מטושטשות. בתמונה מיקרוסקופית מייצגת זו, ניתן לזהות את הוונוסלים הפוסט-נימיים שאמורים להיות בקוטר של בין 20 ל-40 מיקרומטרים על ידי התכנסות של שני כלי שיט קטנים יותר.ניתן לדמיין לויציטים חסידים ומתגלגלים תוך כדי הפצת לויציטים רק בהילוך איטי של קטעי וידאו מוקלטים. מספר רב של פרמטרים עשויים להשפיע על גיוס לויקוציטים ב- vivo כולל תפוקת הלב, קוטר כלי השיט, מהירות קו המרכז, קצב נטישת הקיר ומספר לויקוציטים במחזור. שים לב כי המהירות המרכזית מושפעת מתפוקת לב, עמידות היקפית בכלי הדם ונפח תוך-וסאלי.לדוגמה, נפח גדול של רודמין או חומר ניסיוני אחר שניתן באמצעות קטטר התרדמה מגביר את מהירות הקו המרכזי שלאחר נימי ומעכב לויוציט ללכוד ולגלגל. להיפך, אי ספיקת לב, הרדמה עמוקה או השערה עשויה להקטין את הזרימה שלאחר נימי. כדי לקבוע את המהירות המרכזית, ניתן להשתמש בלוקוציטים פלואורסצנטיים במחזור חופשי או לצבוע את הלוקוציטים עם רייגנטים פלואורסצנטיים כמו רודמין.שים לב כי זנים מסוג פראי עשויים להראות שונות פיזיולוגית. לדוגמה, עכברי C57BL/6 מדגימים גלגול לויוציט, הידבקות והתגלות משופרים בבירור בהשוואה לבעלי חיים C57BL/10ScSn. שלבי התכנון והתקנון חשובים לשליטה בטכניקה במיוחד במהלך הכנת שריר הקרמאסטר למיקרוסקופיה.שיטות אחרות להדמיית גיוס לויקוציטים יכולות להתבצע כדי להניב מידע נוסף ולעזור לנתח את התרומה האישית של לויקוציטים ותאי אנדותל למפל הגיוס. טכניקה זו מספקת פלטפורמה להערכה פרה-קלינית של מדיטטורים פרמקולוגיים וחומרים אפנוניים חיסוניים חדשניים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

להמחיש ליקוציט מתגלגל והצמדות אנגיוטנסין II חדורים עכברים: טכניקות ואת החסרונות

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...