Name: leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF) 01GL1746E nell'ambito del Consorzio PRIMAL. Gli autori riconoscono Britta Heckmann e Silvia Pezer per un'abile assistenza tecnica.

Gli animali erano ospitati in condizioni controllate e specifiche prive di agenti patogeni presso l'IBF (Interfakult're Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dall'IRB locale e dal Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Germania.
1. Amministrazione dell'anestesia
<ol><li>Anestesizzare il topo mediante iniezione di bolus intraperitoneale (i.p.) di 125 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilosina.</li>
	<li>Posiziona...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia.">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo.">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C.">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422 (2014).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner.">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner.">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).</li><li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis.">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li><li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo.">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li><li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time.">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear.">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li><li>von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+peripheral+lymph+node+microcirculation+in+mice.">Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice.</a> Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).</li><li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice.">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li><li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+(IRI)+of+the+rat+cremaster+muscle.">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).</li><li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice.">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457 (2019).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).</li><li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels.">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li><li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology.">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny.">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li></ol>

IVM come metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare diversi tipi di cellule in diversi organi ed è stato ampiamente descritto e discusso19. L'obiettivo principale di questo studio è quello di fornire un approccio efficiente per impostare ed eseguire IVM nel muscolo cremaster. Praticare il metodo produrrà risultati affidabili e riproducibili. Pertanto, la pianificazione e la standardizzazione sono fattori chiave per padroneggiare la tecnica. Soprattutto, la tecnica dipende molto dai para...

La microscopia intravitale (IVM) è uno strumento comunemente applicato nel campo della biologia del leucocito. Il reclutamento di leukociti segue una cascata di eventi ben definiti iniziati dalla cattura del leucocito, dal rotolamento e dall'adesione al muro endoteliale, e infine dalla trasmigrazione e dall'estramigrazione dei leucociti nel sito effettivo di infiammazione1. Ogni passo è mediato e controllato da varie chemiochine (ad esempio, IL-8/CXCL8), recettori (ad esempio, LFA-1, Mac-1) e molecole di adesione delle cellule endoteliali corrispondenti (ad esempio, ICAM-1, VCAM-1 ed E-Selectin)2,3. L'interazione di diversi siti normativi, fattori di controllo e mediatori della cascata di reclutamento di leucociti come recettore dei prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE), della molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1), del motivo C-X-C ligando (CXCL)1/2 e del loro recettore CXCR2 sono stati scoperti utilizzando IVM4,5,6,7,8,9.
Il metodo di IVM è stato descritto per molti organi e tessuti diversi come l'intestino10, pelle11, linfonodi12, il sacco di tuorlo embrionale13 e altri. Tuttavia, il metodo più studiato di IVM è il modello cremaster, descritto per la prima volta nei ratti14. Mentre ancora utilizzato nei ratti15, il metodo è oggi applicato principalmente nei topi a causa dell'alta abbondanza di diverse linee transgeniche. Il nostro gruppo ha recentemente evidenziato il potenziale ruolo del cremaster IVM nel campo delle muscolopatie infiammatorie come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) che studiano topi immdxliti carenti di distrofina16. Grazie alla sua sottile composizione in fibra intrecciata e facilmente accessibile, il muscolo cremante rappresenta il muscolo candidato ideale da studiare come intero supporto utilizzando microscopia leggera o fluorescente. Il reclutamento e l'estravlocazione dei leonici avvengono principalmente in venule post-capillari, che possono essere facilmente identificate su uno strato muscolare continuo nel muscolo cremante.
Il vantaggio dell'imaging in vivo rispetto ad altri saggi in vitro è il suo contesto biologico in un organismo vivente. Allo stesso tempo, delineare contributi specifici per le cellule al reclutamento alterato dei leucociti può richiedere ulteriori modelli in vitro come camere di flusso o saggi endoteliali. La combinazione di più metodi produrrà i dati più convincenti. Gli scienziati dovrebbero essere consapevoli dei limiti del modello cremaster in quanto qualsiasi manipolazione chirurgica porterà ad un aumento del traffico e del reclutamento dei leucociti. Di conseguenza, l'assunzione di base è difficile da stimare con questo metodo. Nonostante la sua ampia applicazione, IVM del cremaster può essere impegnativo e una nuova configurazione può richiedere tempo e risorse per stabilire. Ora forniamo un protocollo facile che aiuterà a evitare alcuni degli errori comuni in IVM. Inoltre, le limitazioni saranno discusse e i metodi gratuiti saranno evidenziati ove applicabile.
IVM del cremaster rappresenta un approccio ideale da attuare nel campo degli studi infiammatori e infettivi. Più specificamente, il modello cremaster può essere di grande interesse per gli scienziati che studiano la biologia muscolare scheletrica nel contesto delle malattie infiammatorie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="874">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketanest S</td>
			<td style="width:204px;">Pfizer Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">PZN: 08509909</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Xylazine</td>
			<td style="width:204px;">CP-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Article-nr.: 1205&#160;</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Saline Solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td>PZN 02737756</td>
			<td>surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe needle Omnican F</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td style="width:175px;">REF 9161502</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Suture 6/0 USP</td>
			<td style="width:204px;">Resorba</td>
			<td style="width:175px;">REF 4217</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Polyethylene tube #10&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427401</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Polyethylene tube #90&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427421</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td style="width:175px;">CAS Number 989-38-8&#160;</td>
			<td>leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Setup Equipment</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">BX51W1</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">40-fold objective&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">Achroplan 40 &#215; /0.80 W</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImSpector software</td>
			<td style="width:204px;">Lavision Biotec GmbH</td>
			<td style="width:175px;">ver. 4.0.469</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">National Institute of Health, USA</td>
			<td style="width:175px;">ver. 1.51j8</td>
			<td>software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy

La microscopia intravitale (IVM) è ampiamente utilizzata per monitorare i processi fisiologici e patofisiologici all'interno della cascata di reclutamento di leucociti in vivo. Il protocollo attuale rappresenta un metodo pratico e riproducibile per visualizzare l'interazione con l'endotelio leucocito che porta al reclutamento di leucociti nel tessuto derivato dal muscolo scheletrico all'interno dell'organismo intatto del topo. Il modello è applicabile a tutti i campi di ricerca che si concentrano sull'attivazione dei noulociti e sul loro ruolo nella malattia.
Forniamo un protocollo passo dopo passo per guidare attraverso il metodo e per evidenziare potenziali insidie e difficoltà tecniche. Il protocollo copre i seguenti aspetti: impostazioni sperimentali e materiale richiesto, anestesia del topo, dissezione del muscolo cremaster così come cannulation tracheale e carotide, registrazioni IVM e analisi offline. Formati di dati come leucociti aderenti, flusso di rotolamento (RF) e frazione del flusso di rotolamento (RFF) sono spiegati in dettaglio e vengono discusse le applicazioni appropriate. Risultati rappresentativi da topi mdx carenti distrofina sono forniti nella sezione risultati.
IVM è un potente strumento per valutare il reclutamento di leucociti in un ambiente in vivo; tuttavia, delineare ad esempio la funzione endoteliale e leucocito può richiedere una combinazione con configurazioni ex vivo come esperimenti di camera di flusso. Inoltre, il background genetico degli animali di interesse può influenzare notevolmente il reclutamento di base, richiedendo la messa a punto individuale del protocollo previsto. Nonostante i suoi limiti, IVM può servire come piattaforma per tradurre prontamente i risultati in vitro in un organismo vertebrato vivente.

IVM in base al protocollo fornito fornirà informazioni uniche sulla cascata di reclutamento di leucociti nel muscolo scheletrico. La sezione dei risultati si concentrerà sui risultati tipici ottenuti da IVM ed evidenzierà i potenziali problemi che possono verificarsi.
La configurazione sperimentale per la microscopia intravitale è descritta nella Figura 1. La preparazione del muscolo cremaster e la rimozione del tessuto connettivo è fondamentale per ottenere ...

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Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.

Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Questo metodo pratico e riproducibile può essere utilizzato per visualizzare le interazioni con i leucociti dell'endotelio che portano al reclutamento di leucociti all'interno di un topo intatto. Questa tecnica presenta anche un potente strumento per il monitoraggio dei processi fisiologici e fisiopatologici all'interno della cascata di reclutamento dei leucociti in vivo. Il metodo può essere applicato in diversi modelli infiammatori e settici.Ad esempio, abbiamo recentemente evidenziato la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che comportano infiltrazioni esagerate di leucociti muscolari. Il nostro suggerimento ai colleghi scienziati che stanno pensando di utilizzare questa tecnica è di ottenere quanta più esperienza pratica possibile il metodo è molto suscettibile a piccole deviazioni. A dimostrare la procedura sarà Simon Kranig, un clinico e scienziato anziano del mio laboratorio.Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piede nell'animale sperimentale anestetizzato, fissare il mouse in posizione reclinata dorsale su una pastiglia riscaldante Celsius di 37 gradi e utilizzare una sutura sterile 6-0 non assorbibile per avvolgere un semplice anello intorno ai denti frontali. Rastrettare le estremità di giunzione della sutura sul riscaldante e utilizzare le pinzette per sollevare delicatamente la pelle a metà linea. Successivamente, fare un'incisione circolare da uno a due centimetri di diametro sul collo e sul torace superiore e utilizzare una pinzetta per sezionare attentamente i tessuti muscolari, grassi e connettivi circostanti.Metti una sutura sotto la trachea. Utilizzare piccole forbici chirurgiche per fare un taglio trasversale di circa 1,3 millimetri nella trachea e introdurre un tubo di polietilene nell'estremità caudale della trachea per fissare le vie aeree superiori. Fissare il tubo situato con un'unica sutura a nodo circolare e individuare l'arteria carotide lungo il lato destro della trachea.Sezionare il tessuto circostante dalla parete dell'arteria carotide e passare due pezzi di sutura sotto l'arteria. Legare la prima sutura cranica prossimale alla biforcazione delle arterie carotidi e posizionare la seconda sutura a circa cinque-otto millimetri distale dalla prima sutura senza legare. Successivamente, attaccare un pezzo di tubi di polietilene di 30 centimetri a un ago della siringa da un millilitro riempito con soluzione salina e utilizzare una clip per vasi di sette millimetri per bloccare l'arteria carotide distorsi alla seconda sutura.Effettuare un taglio trasversale di circa 0,5 millimetri nell'arteria carotide e introdurre il tubo sterile in polietilene nell'arteria. Fissare il tubo con la seconda sutura e rimuovere la clip del recipiente. Quindi deprimere delicatamente lo stantuffo della siringa per lavare la soluzione salina nel vaso.Per preparare il muscolo cremastere, trasferire il mouse su un telaio al microscopio in plastica su misura con lo scroto rivolto verso lo stadio del microscopio e afferrare attentamente lo scroto alla sua estremità più distale con una pinzetta. Tirando delicatamente lo scroto, rimuovere una sezione circolare di circa cinque millimetri di diametro della pelle scrotale mantenendo il tessuto aperto ben idratato con soluzione salina. Utilizzare due pinzette per sezionare il tessuto connettivo sciolto e localizzare entrambi i teste.Afferrare un testicolo distally e iniziare delicatamente a estrarre il tessuto riproduttivo rimuovendo i tessuti connettivi circostanti passo dopo passo. Una volta che il testicolo è stato esteriore, fissare l'estremità distale del tessuto all'anello di gomma che circonda il palco e idratare il tessuto con soluzione salina. Quindi, rimuovere con cura il tessuto connettivo senza danneggiare il muscolo cremastere sottostante.È fondamentale rimuovere tutto il tessuto connettivo che si tradurrebbe in immagini sfocate senza danneggiare il muscolo cremastere sottostante. Quando tutto il tessuto è stato rimosso, fare un'incisione trasversale di un millimetro per aprire il muscolo cremastere prima di fare un'incisione longitudinale dall'estremità molto distale all'estremità prossimale del tessuto. Il muscolo dovrebbe aprirsi sfericamente.Stendere con cura il muscolo sul palco di vetro e inchiodare il muscolo all'anello di gomma facendo attenzione a non toccare o danneggiare la regione centrale del tessuto. Quindi fissare il testicolo rimanente di lato per dare accesso alla regione di interesse e idratare il tessuto con PSS. Per la visualizzazione intravitale della vascuola muscolare, posizionare il muscolo cremastere montato nel microscopio verticale e selezionare l'obiettivo 40X.Eseguire le registrazioni sotto superfusione continua con PSS da 35 a 37 gradi Celsius attraverso un pezzo di piccoli tubi che è stato attaccato all'obiettivo verticale del microscopio per consentire il gocciolamento continuo di PSS insieme all'obiettivo verso il basso sul muscolo e sul tessuto. Identificare le venule post-capillari. Misurare il microcircolo su venyole con un diametro da 20 a 40 micrometri.Quindi registrare immagini ad alta risoluzione del microcircolo dal muscolo cremastere per un periodo di 30 secondi regolando continuamente la messa a fuoco a causa di lievi cambiamenti nella contrazione e rilassamento del tessuto muscolare. L'eccesso di tessuto connettivo può portare a immagini microscopiche sfocate. In questa immagine microscopica rappresentativa, le venule post-capillari che dovrebbero avere un diametro compreso tra 20 e 40 micrometri possono essere identificate dalla confluenza di due vasi più piccoli.I leucociti aderenti e rotolanti possono essere visualizzati mentre i leucociti circolanti possono essere tracciati solo nella riproduzione al rallentatore di video registrati. Una moltitudine di parametri può influenzare il reclutamento di leucociti in vivo tra cui l'uscita cardiaca, il diametro del vaso, la velocità dell'uscita centrale, la velocità di taglio delle pareti e il numero di leucociti circolanti. Si noti che la velocità dell'uscita della linea centrale è influenzata dall'uscita cardiaca, dalla resistenza vascolare periferica e dal volume intravasale.Ad esempio, un grande volume di rhodamina o altra sostanza sperimentale somministrata attraverso il catetere carotide aumenta la velocità dell'ala centrale post-capillare e inibisce la cattura e il rotolamento dei leucociti. Al contrario, l'insufficienza cardiaca, l'anestesia profonda o l'ipotermia possono diminuire il flusso post-capillare. Per determinare la velocità della linea centrale, possono essere utilizzati leucociti fluorescenti che circolano liberamente o i leucociti devono essere tinti con reagenti fluorescenti come la rodiammina.Si noti che i ceppi di tipo selvatico possono mostrare una varianza fisiologica. Ad esempio, i topi C57BL/6 dimostrano una laminazione, un'adesione e una trasmigrazione dei leucociti chiaramente migliorate rispetto agli animali C57BL/10ScSn. Le fasi di pianificazione e standardizzazione sono importanti per padroneggiare la tecnica soprattutto durante la preparazione del muscolo cremastere per la microscopia.Altri metodi per visualizzare il reclutamento di leucociti possono essere condotti per fornire ulteriori informazioni e per aiutare a sezionare il contributo individuale dei leucociti e delle cellule endoteliali alla cascata di reclutamento. Questa tecnica fornisce una piattaforma per la valutazione preclinica dei meditatori farmacologici e delle nuove sostanze modulatori immunitarie.

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Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Microscopia intravitale del linfonodo inguinale

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualizzazione del leucocita rotolamento e adesione in angiotensina II-infuso topi: tecniche e insidie

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...