Name: leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00
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この研究は、PRIMALコンソーシアムの一環として、ドイツ連邦教育研究省(BMBF)01GL1746Eによって支援されました。著者らは、ブリッタ・ヘックマンとシルビア・ペザーが巧みな技術支援を認めている。

動物はIBF(インターファクルテア・バイオメディジンリッチェ・フォルシュンツェインリヒトゥン)、ハイデルベルクで制御され、特定の病原体のない状態で収容された。ここに記載されているすべての手順は、地元のIRBとドイツのバーデン・ヴュルテンベルク州のドイツのドイツのレジエルングスプラエシジウム・カールスルーエによって承認されました。
1. 麻酔投与
...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia.">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo.">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C.">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422 (2014).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner.">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner.">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).</li><li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis.">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li><li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo.">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li><li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time.">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear.">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li><li>von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+peripheral+lymph+node+microcirculation+in+mice.">Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice.</a> Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).</li><li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice.">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li><li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+(IRI)+of+the+rat+cremaster+muscle.">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).</li><li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice.">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457 (2019).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).</li><li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels.">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li><li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology.">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny.">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li></ol>

IVMは、さまざまな器官の異なる細胞型を研究するために広く使用されており、広く説明され、議論されてきた19.この研究の主な目的は、クレマスター筋肉でIVMをセットアップし、実行するための効率的なアプローチを提供することです。この方法を実践すれば、信頼性が高く再現性の高い結果が得られます。したがって、計画と標準化は、技術を習得するための重要な要素?...

インビタル顕微鏡(IVM)は、白血球生物学の分野で一般的に適用されるツールです。白血球のリクルートは、白血球の捕獲、圧延および接着によって開始された明確に定義された事象のカスケードに続き、最後に白血球の炎症部位へのトランスマイグレーションおよび飛散1.各ステップは、様々なケモカイン(例えば、IL-8/CXCL8)、受容体(例えば、LFA-1、Mac-1)および対応する内皮細胞接着分子(例えば、ICAM-1、VCAM-1およびE-Selectin)2、3によって媒介および制御される。2,3異なる調節部位の相互作用により、進行糖化末端製品の受容体様に白血球採用カスケードの制御因子およびメディエーター(RAGE)、細胞間接着分子1(ICAM-1)、C-X-Cモチーフリガンド(CXCL)1/2およびそれらの受容体CXCR2をIVM4、5、6、7、8、9を用いて発見した。4,5,6,7,8,9
IVMの方法は、腸10、皮膚11、リンパ節12、胚黄身袋1113等のような多くの異なる器官および組織について説明されている。しかし、IVMの最も広く研究されている方法は、クレマスターモデルであり、まずラット14に記載される。ラット15にまだ使用されているが、この方法は、異なるトランスジェニックラインの豊富さのために、今日では主にマウスに適用されている。我々のグループは最近、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)がジストロフィン欠乏mdxマウス16を研究するような炎症性ムスコロパシーの分野におけるクレマスターIVMの潜在的な役割を強調した。薄い織り交ぜられた容易に利用できる繊維組成物のために、クレマスター筋肉は光または蛍光顕微鏡を使用して全体の台座として研究される理想的な候補筋肉を表す。白血球の募集および外挿は主に毛細血管後の小胞で行われ、クレマスター筋の連続的な筋肉層で容易に同定することができる。
インビボイメージングの他のインビトロアッセイと比較した利点は、生体におけるその生物学的文脈である。同時に、変化した白血球の採用に対する細胞特異的寄与を非行化するには、フローチャンバーや内皮アッセイのような追加のインビトロモデルが必要になる可能性がある。複数のメソッドを組み合わせて使用すると、最も説得力のあるデータが得られます。外科手術は白血球の人身売買や採用の増加につながるため、科学者はクレマスターモデルの限界を認識する必要があります。したがって、ベースライン採用はこの方法で見積もることは困難です。その広範なアプリケーションにもかかわらず、cremasterのIVMは困難であり、新しいセットアップは確立に時間とリソースを要する可能性があります。IVM の一般的なミスを回避するのに役立つ簡単なプロトコルを提供します。また、制限事項について説明し、適用可能な場合は無料の方法が強調表示されます。
クレマスターのIVMは、炎症性および感染性研究の分野で実施される理想的なアプローチを表す。より具体的には、cremasterモデルは、炎症性疾患の文脈で骨格筋生物学を研究している科学者に高い関心を持つ可能性があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="874">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketanest S</td>
			<td style="width:204px;">Pfizer Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">PZN: 08509909</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Xylazine</td>
			<td style="width:204px;">CP-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Article-nr.: 1205&#160;</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Saline Solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td>PZN 02737756</td>
			<td>surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe needle Omnican F</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td style="width:175px;">REF 9161502</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Suture 6/0 USP</td>
			<td style="width:204px;">Resorba</td>
			<td style="width:175px;">REF 4217</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Polyethylene tube #10&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427401</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Polyethylene tube #90&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427421</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td style="width:175px;">CAS Number 989-38-8&#160;</td>
			<td>leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Setup Equipment</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">BX51W1</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">40-fold objective&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">Achroplan 40 &#215; /0.80 W</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImSpector software</td>
			<td style="width:204px;">Lavision Biotec GmbH</td>
			<td style="width:175px;">ver. 4.0.469</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">National Institute of Health, USA</td>
			<td style="width:175px;">ver. 1.51j8</td>
			<td>software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy

インビボでの白血球採用カスケード内の生理学的および病態生理学的プロセスを監視するために、生体内顕微鏡(IVM)が広く使用されています。現在のプロトコルは、マウスの無傷の生物内の骨格筋由来組織における白血球のリクルートに至る白血球内皮相互作用を可視化する実用的で再現可能な方法を表す。このモデルは、顆粒球活性化と疾患におけるその役割に焦点を当てた研究のすべての分野に適用可能です。
私たちは、メソッドをガイドし、潜在的な落とし穴や技術的な困難を強調するために、ステップバイステッププロトコルを提供します。このプロトコルは、実験設定および必要な材料、マウスの麻酔、クレマスター筋の解剖、気管および頸動脈のカヌレーション、IVM記録およびオフライン分析をカバーする。接着白血球、転がりフラックス(RF)および転がりフラックス分率(RFF)のようなデータフォーマットは詳細に説明され、適切な適用が議論される。ジストロフィン欠損mdxマウスの代表的な結果は、結果セクションに提供される。
IVMは、インビボの設定で白血球の採用を評価するための強力なツールです。しかしながら、例えば内皮および白血球機能を解いて、流れチャンバ実験のようなex vivoのセットアップとの組み合わせを必要とするかもしれない。さらに、対象となる動物の遺伝的背景は、ベースラインの採用に大きな影響を与え、提供されるプロトコルの個々の微調整を必要とする。その制限にもかかわらず、IVMは、インビトロ所見を生きている脊椎動物生物に容易に翻訳するためのプラットフォームとして機能する可能性があります。

提供されたプロトコルに従ってIVMは骨格筋の白血球の徴用のカスケードに独特な洞察をもたらす。結果セクションでは、IVM によって得られる一般的な結果に焦点を当て、発生する可能性のある問題を強調します。
生体内顕微鏡の実験セットアップの概要を図1に示します。クレマスター筋肉の調製と結合組織の除去は、均一な表面を有する焦点を合...

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Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

ここでは、マウスクレマスター筋の毛細管後小胞に対して生体内顕微鏡を行う方法を示す。炎症および敗血症の異なるモデル、特にケモカインおよびサイトカインによって誘発されるものに一般的に適用され、我々は誇張された筋白血球浸潤を伴うムスコロパシーの研究におけるその関連性を強調する。

インビタル顕微鏡で評価されたマウスにおけるクレマスター筋の白血球浸潤

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

この実用的で再現可能な方法は、無傷のマウス内で白血球のリクルートにつながる白血球内相互作用を可視化するために使用することができる。この技術はまた、生体内の白血球募集カスケード内の生理学的および病態生理学的プロセスのモニタリングのための強力なツールを提示する。この方法は、異なる炎症性および敗血症モデルに適用することができる。例えば、我々は最近、誇張された筋白血球浸潤を含む筋病的な研究におけるその関連性を強調した。この技術を使用することを検討している仲間の科学者への私たちの提案は、方法がわずかな偏差に非常に影響を受けやすいようにできるだけ多くの実践的な経験を得るです。この手順を実証することは、私の研究室の臨床医でシニアサイエンティストのサイモン・クラニッヒです。麻酔実験動物のつまみつまみへの応答の欠如を確認した後、37°Cの加熱パッドの後回しリカンベント位置にマウスを固定し、非吸収性無菌6-0縫合糸を使用して前歯の周りに単純なループを巻きます。縫合糸の結合端を加熱パッドにテープで貼り付け、ピンセットを使用して中線で皮膚を静かに持ち上げます。次に、首と上部胸郭の上に直径1〜2センチメートルの円形の切開を行い、ピンセットを使用して周囲の筋肉、脂肪、および結合組織を慎重に解剖します。気管の下に縫合糸を置きます。小さな手術用はさみを使用して、約1.3ミリメートルの横方向を気管に切り込み、気管の尾端にポリエチレンチューブを導入して上気道を固定します。単一の円形の結び目の縫合線で位置するチューブを固定し、気管の右側に沿って頸動脈を見つけます。頸動脈壁から周囲の組織を解剖し、動脈の下に縫合の2つの部分を渡します。頸動脈の分岐に最初の頭蓋縫合を結び、結びつけずに第1縫合糸から約5〜8ミリメートル遠位の第2縫合糸を配置する。次に、生理食塩水で満たされた1ミリリットルの注射針に30センチメートルのポリエチレンチューブを取り付け、7ミリメートルの容器クリップを使用して頸動脈を第2縫合糸に遠位クランプします。頸動脈で約0.5ミリメートルの横切り切断を行い、無菌ポリエチレンチューブを動脈に導入します。チューブを2番目の縫合線で固定し、容器クリップを取り外します。その後、注射器プランジャーを静かに押し込み、生理食い物を容器に流します。クレマスターの筋肉を準備するには、陰嚢を顕微鏡ステージに向けてカスタムメイドのプラスチック顕微鏡フレームにマウスを移し、ピンセットで最も遠位の端にある陰嚢を慎重に把握します。陰嚢を優しく引っ張り、開いた組織を生理食塩水で十分に保ち、陰嚢皮膚の直径約5ミリメートルの円形部分を取り除く。緩い結合組織を解剖し、両方の精巣を見つけるために2つのピンセットを使用してください。1つの試験を遠位につかみ、周囲の結合組織を段階的に取り除く生殖組織をそっと引き出し始める。精巣が外装されたら、組織の遠位端をステージを囲むゴムリングに固定し、生理食塩水で組織を水分補給します。次に、基礎となるクレマスター筋に害を与えることなく、結合組織を慎重に除去する。基礎となるクレマスターの筋肉に害を与えることなく、ぼやけた画像をもたらす結合組織のすべてを削除することが重要です。すべての組織が取り除かれたら、1ミリメートルの横切り切開を行い、クレマスター筋肉を開き、非常に遠位から組織の近位端までの縦切りを行います。筋肉は球状に開くはずです。慎重にガラスのステージ上に筋肉を広げ、組織の中央領域に触れたり害を与えたりしないように注意してゴムリングに筋肉を固定します。次に、残りの精巣を側面に固定して、関心のある領域にアクセスし、PSSで組織を水和します。筋肉血管系の生体内可視化のために、取り付けられたクレマスター筋を直立顕微鏡に入れ、40倍の目的を選択する。顕微鏡の直立的な目的にテーピングされた小さなチューブを通して35〜37°CのPSSで連続的な重ね合わの下で録音を行い、筋肉と組織に目的と一緒にPSSの連続滴下を可能にします。毛細血管後の小胞を特定します。直径20~40マイクロメートルの小胞の微小循環を測定します。次に、30秒の期間にわたってクレマスター筋肉からの微小循環の高解像度画像を記録し、筋肉組織の収縮および弛緩のわずかな変化による焦点を連続的に調整する。過剰な結合組織は、ぼやけた顕微鏡画像につながることができます。この代表的な顕微鏡画像では、直径20〜40マイクロメートルの間にあるはずのポストキャピラリー小胞は、2つの小さな血管の合流によって識別することができる。白血球を循環しながら接着性および転がり白血球を視覚化することができるが、記録されたビデオのスローモーション再生でのみ追跡され得る。多数のパラメータが、心拍出量、血管径、中心線速度、壁せん断速度、循環白血球の数を含む、生体内での白血球の採用に影響を与える可能性があります。なお、中心線速度は心拍出量、末梢血管抵抗、および血管内容積の影響を受ける。例えば、頸動脈カテーテルを介して与えられたローダミンまたは他の実験物質の大量は、毛細管の中心線速度を増加させ、白血球の捕獲および転動を阻害する。それどころか、心不全、深部麻酔、または低体温は、毛細血管後の流れを減少させる可能性がある。中心線速度を決定するために、蛍光白血球を自由に循環させるか、または白血球をローダミンのような蛍光試薬で染色しなければならない。なお、野生型株は生理学的分散を示し得る。例えば、C57BL/6マウスは、C57BL/10ScSn動物と比較して、白血球の転がり、接着、およびトランスマイグレーションを明確に増強した。計画段階と標準化段階は、特に顕微鏡のためのクレマスター筋肉の調製中に技術を習得するために重要です。白血球の採用を視覚化するための他の方法は、追加情報を得るために、および採用カスケードに白血球および内皮細胞の個々の貢献を解剖するのを助けるために行うことができる。この技術は、薬理学的瞑想者および新しい免疫調節物質の前臨床評価のためのプラットフォームを提供する。

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Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

白血球ローリングとアンジオテンシン II に注入されたマウスにおける付着の可視化: 技術と落とし穴

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...