Name: leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

이 연구는 PRIMAL 컨소시엄의 일환으로 독일 연방 교육 연구부 (BMBF) 01GL1746E에 의해 지원되었다. 저자는 숙련 된 기술 지원에 대한 브리타 헤크만과 실비아 페저를 인정합니다.

동물은 IBF(인터파쿨테르 바이오메디치니쉬 포르충세인리히퉁), 하이델베르크에서 통제되고 특정 병원균이 없는 조건 하에 수용되었다. 여기에 설명된 모든 절차는 현지 IRB와 독일 바덴뷔르템베르크의 레히에룽스프라에시듐 카를스루에에 의해 승인되었습니다.
1. 마취 관리
<ol><li>125 mg/kg 케타민과 12.5 mg/kg 자일라진의 복강 내 (즉) 볼러스 주사로 마우스를 마취시다.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia.">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo.">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C.">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422 (2014).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner.">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner.">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).</li><li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis.">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li><li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo.">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li><li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time.">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear.">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li><li>von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+peripheral+lymph+node+microcirculation+in+mice.">Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice.</a> Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).</li><li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice.">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li><li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+(IRI)+of+the+rat+cremaster+muscle.">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).</li><li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice.">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457 (2019).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).</li><li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels.">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li><li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology.">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny.">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li></ol>

방법으로서 IVM은 다른 기관에서 다른 세포 유형을 연구하는 데 널리 사용되어 왔으며 광범위하게 기술되고논의된 19. 이 연구의 주요 목적은 cremaster 근육에서 IVM을 설정하고 수행하는 효율적인 접근 방식을 제공하는 것입니다. 이 방법을 연습하면 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 따라서 계획 및 표준화는 기술을 마스터하는 핵심 요소입니다. 무엇보다도 ?...

Intravital 현미경 검사법 (IVM)는 백혈구 생물학의 필드에 있는 일반적으로 적용되는 공구입니다. 백혈구 모집은 백혈구 포획, 압연 및 내피 벽에 의한 접착에 의해 시작된 잘 정의된 사건의 연속을 따르며, 마지막으로 염증의 실제 부위로 백혈구의 이주 및 사치를이월한다 1. 각 단계는 다양한 케모카인(예를 들어, IL-8/CXCL8), 수용체(예를 들어, LFA-1, Mac-1) 및 상응하는 내피 세포 접착 분자(예를 들어, ICAM-1, VCAM-1 및 E-Selectin)에 의해 매개및 조절된다2,,3. 상이한 조절 부위의 상호작용은, 백혈구 모집의 조절인자 및 중재자가 고급 당화 말단 제품(RAGE), 세포간 접착 분자 1(ICAM-1), C-X-C 모티프 리간드(CXCL)1/2 및 수용체 CXCR2를 사용하여 IVM,4,5,6,6,,7,,8,9를사용하여 발견하였다.
IVM의 방법은 장10,피부11,림프절12,배아 노른자 자루13 등과 같은 많은 상이한 장기 및 조직에 대해 기술되었다. 그러나, IVM의 가장 널리 연구된 방법은 래트14에서처음 기술된 크레마스터 모델이다. 쥐15에서아직도 아직도 이용되는 동안, 방법은 다른 형질전환 선의 높은 풍부 때문에 마우스에서 주로 최근에 적용됩니다. 우리 그룹은 최근 듀첸 근 이영양증 (DMD)과 같은 염증성 muscolopathies의 분야에서 cremaster IVM의 잠재적 인 역할을 강조하고 있다 dystrophin 결핍 mdx 마우스 를 공부16. 얇은 결합 및 쉽게 접근 할 수있는 섬유 조성으로 인해, cremaster 근육은 빛 또는 형광 현미경 검사법을 사용하여 전체 마운트로 연구 할 수있는 이상적인 후보 근육을 나타냅니다. 백혈구 모집 및 사치는 주로 cremaster 근육에 있는 연속적인 근육 층에 쉽게 확인될 수 있는 포스트 모세관 매경에서 일어날 것입니다.
생체외 에서 의 외 세포 내 세포 화상 진찰의 이점은 살아있는 유기체에 있는 그것의 생물학 문맥이다. 동시에, 변경된 백혈구 모집에 세포 특정 기여를 delineating 는 유동 실 또는 내피 검술과 같은 추가 시험관내 모형을 요구할 수 있습니다. 여러 메서드의 조합은 가장 설득력있는 데이터를 생성합니다. 어떤 외과 조작든지 증가한 백혈구 인신 매매 및 모집으로 이끌어 낼 것이기 때문에 과학자는 cremaster 모형의 한계를 알고 있어야 합니다. 따라서, 기준 모집은이 방법으로 추정하기 어렵다. 광범위한 응용 에도 불구하고, cremaster의 IVM은 도전이 될 수 있으며, 새로운 설정은 설정하는 데 시간과 자원이 걸릴 수 있습니다. 우리는 지금 IVM에서 일반적인 실수의 일부를 방지하는 데 도움이 될 것입니다 쉬운 프로토콜을 제공합니다. 또한 제한 사항에 대해 논의하고 해당되는 경우 무료 방법이 강조 표시됩니다.
cremaster의 IVM은 염증성 및 전염성 연구 분야에서 구현되는 이상적인 접근법을 나타낸다. 보다 구체적으로, cremaster 모형은 선동적인 질병의 맥락에서 골격 근육 생물학을 공부하는 과학자에 높은 관심사일지도 모릅니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="874">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketanest S</td>
			<td style="width:204px;">Pfizer Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">PZN: 08509909</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Xylazine</td>
			<td style="width:204px;">CP-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Article-nr.: 1205&#160;</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Saline Solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td>PZN 02737756</td>
			<td>surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe needle Omnican F</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td style="width:175px;">REF 9161502</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Suture 6/0 USP</td>
			<td style="width:204px;">Resorba</td>
			<td style="width:175px;">REF 4217</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Polyethylene tube #10&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427401</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Polyethylene tube #90&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427421</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td style="width:175px;">CAS Number 989-38-8&#160;</td>
			<td>leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Setup Equipment</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">BX51W1</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">40-fold objective&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">Achroplan 40 &#215; /0.80 W</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImSpector software</td>
			<td style="width:204px;">Lavision Biotec GmbH</td>
			<td style="width:175px;">ver. 4.0.469</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">National Institute of Health, USA</td>
			<td style="width:175px;">ver. 1.51j8</td>
			<td>software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy

Intravital 현미경 검사법 (IVM)는 생체 내에서 백혈구 모집 계단식 내의 생리적 및 병리생리학적 과정을 모니터링하는 데 널리 사용됩니다. 현재 프로토콜은 마우스의 손상되지 않은 유기체 내에서 골격 근 유래 조직에서 백혈구 모집으로 이어지는 백혈구 내피 상호작용을 시각화하는 실용적이고 재현 가능한 방법을 나타낸다. 이 모델은 과립구 활성화와 질병에서의 역할에 초점을 맞춘 모든 연구 분야에 적용됩니다.
우리는 방법을 안내하고 잠재적 인 함정과 기술적 인 어려움을 강조하기 위해 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 실험 설정 및 필수 물질, 마우스 마취, 크레마스터 근육 의 해부뿐만 아니라 기관 및 경동맥 통조림, IVM 기록 및 오프라인 분석을 다룹니다. 부착 백혈구, 롤링 플럭스(RF) 및 롤링 플럭스 분획(RFF)과 같은 데이터 형식에 대해 자세히 설명하고 적절한 응용 분야에 대해 설명합니다. 디스트로핀 결핍 mdx 마우스로부터의 대표적인 결과는 결과 섹션에 제공된다.
IVM은 생체 내 환경에서 백혈구 모집을 평가하는 강력한 도구입니다. 그러나, 예를 들어 내피 및 백혈구 기능을 delineating 유동 챔버 실험과 같은 전 생체 설정과 조합을 요구할 수 있습니다. 더욱이, 관심 있는 동물의 유전적 배경은 기준선 모집에 크게 영향을 미칠 수 있으며, 제공된 프로토콜의 개별적인 미세 조정을 요구한다. 그것의 한계에도 불구하고, IVM은 살아있는 척추 동물 유기체로 시험관 내 사실 인정을 쉽게 번역하는 단상으로 봉사할 수 있습니다.

제공된 프로토콜에 따라 IVM은 골격 근에서 백혈구 모집의 폭포에 대한 독특한 통찰력을 얻을 것이다. 결과 섹션에서는 IVM에서 얻은 일반적인 결과에 중점을 두고 발생할 수 있는 잠재적인 문제를 강조 표시합니다.
위활력 현미경 검사법에 대한 실험 설정은 그림 1에설명되어 있습니다. cremaster 근육의 준비 및 결합 조직의 제거는 균일 한 표면으로 집중?...

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Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

이 실용적이고 재현 가능한 방법은 그대로 마우스 내에서 백혈구 모집으로 이어지는 내피성 백혈구 상호 작용을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 또한 생체 내에서 백혈구 모집 폭포 내에서 생리및 병리학 적 과정의 모니터링을위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 방법은 상이한 염증 및 정화조 모델에 적용될 수 있다.예를 들면, 우리는 최근에 과장된 근육 백혈구 침투를 관련시키는 근육병증의 연구 결과에 있는 그것의 관련성을 강조했습니다. 이 기술을 사용하는 것을 고려하고있는 동료 과학자들에게 우리의 제안은 방법이 사소한 편차에 매우 취약할 때 가능한 한 많은 실습 경험을 얻는 것입니다. 절차를 보여주는 사이먼 크라니그, 내 실험실에서 임상의 및 수석 과학자 될 것입니다.마취된 실험 동물의 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 37°C의 섭씨 가열 패드에서 등쪽 재림 자세로 마우스를 고정하고 흡수할 수 없는 멸균 6-0 봉합사를 사용하여 정면 치아 주위에 간단한 루프를 감습니다. 봉합사의 결합 끝을 가열 패드에 테이프로 사용하고 핀셋을 사용하여 중간라인에서 피부를 부드럽게 들어 올립니다. 다음으로, 목과 상부 흉부 위에 1~2센티미터 직경 절개를 하고 핀셋을 사용하여 주변 근육, 지방 및 결합 조직을 조심스럽게 해부합니다.기관 아래에 봉합사를 놓습니다. 작은 수술 가위를 사용하여 약 1.3mm의 횡반을 기관으로 자르고 상부 기도를 확보하기 위해 기관의 caudal 끝에 폴리에틸렌 튜브를 도입하십시오. 하나의 원형 매듭 봉합사로 위치한 튜브를 수정하고 기관의 오른쪽을 따라 경동맥을 찾습니다.경동맥 벽에서 주변 조직을 해부하고 동맥 아래에 봉합사의 두 조각을 전달합니다. 첫 번째 두개골 봉합사 근위를 경동맥의 양면에 묶고 두 번째 봉합사를 묶지 않고 첫 번째 봉합사에서 약 5~8밀리미터 의 결산한다. 다음으로, 30센티미터 분량의 폴리에틸렌 튜빙을 식염수로 채워진 1밀리리터 주사기 바늘에 부착하고 7mm 용기 클립을 사용하여 경동맥을 두 번째 봉합사에 분해합니다.경동맥에서 약 0.5mm 의 횡반절단을 만들고 멸균 폴리에틸렌 튜브를 동맥에 도입한다. 두 번째 봉합사로 튜브를 고정하고 선박 클립을 제거합니다. 그런 다음 주사기 플런저를 부드럽게 우울하여 식염수를 용기에 넣습니다.크레마스터 근육을 준비하려면 현미경 단계를 향한 음낭이있는 맞춤형 플라스틱 현미경 프레임으로 마우스를 옮기고 핀셋으로 가장 황당한 끝에 음낭을 조심스럽게 잡습니다. 음낭을 부드럽게 당기고, 음낭 피부의 직경 약 5밀리미터 의 원형을 제거하여 열린 조직을 식염수로 잘 수화합니다. 두 개의 핀셋을 사용하여 느슨한 결합 조직을 해부하고 두 고환을 모두 찾습니다.하나의 고환을 분해하고 부드럽게 단계별로 주변 결합 조직을 제거 생식 조직을 당겨 시작합니다. 고환이 외부화되면 조직의 단부 끝을 스테이지를 둘러싼 고무 링에 고정하고 식염수로 조직을 수화시합니다. 다음으로, 조심스럽게 기본 크레마스터 근육을 해치지 않고 결합 조직을 제거합니다.근본적인 크레마스터 근육을 해치지 않고 흐릿한 심상을 초래할 모든 결합 조직을 제거하는 것이 중요합니다. 조직의 모든 제거 된 경우, 조직의 근위 끝에 매우 단개절을 만들기 전에 크레마스터 근육을 열기 위해 1 밀리미터 횡절개를합니다. 근육은 구형적으로 열립니다.조심스럽게 유리 단계에 근육을 확산하고 조직의 중앙 부위를 만지거나 해치지 않도록주의고무 링에 근육을 고정. 그런 다음 나머지 고환을 측면에 고정하여 관심 영역에 대한 액세스를 제공하고 PSS로 조직을 수화합니다. 근육 혈관의 인트라베이티 시각화를 위해 장착된 크레마스터 근육을 수직 현미경에 배치하고 40X 목표를 선택합니다.현미경의 직립 목표에 테이프로 붙인 작은 튜브를 통해 35~37도의 연속 슈퍼퓨전 하에서 연속 적인 슈퍼퓨전하에서 기록을 수행하여 근육과 조직에 대한 목표와 함께 PSS의 연속 투하를 허용합니다. 모세혈관 후 정맥을 식별합니다. 직경 20~40마이크로미터의 정맥의 미세 순환을 측정합니다.그런 다음 30초 동안 크레마스터 근육으로부터의 미세 순환의 고해상도 이미지를 기록하여 근육 조직의 수축 및 이완의 약간의 변화로 인해 지속적으로 초점을 조절한다. 과잉 결합 조직은 흐릿한 현미경 심상으로 이끌어 낼 수 있습니다. 이 대표적인 현미경 이미지에서, 직경이 20 내지 40 마이크로미터 사이여야 하는 모세관 후 정맥은 두 개의 작은 혈관의 합류에 의해 규명될 수 있다.백혈구를 순환하는 동안 부착 및 롤링 백혈구는 녹화 된 비디오의 슬로우 모션 리플레이에서만 추적 할 수 있습니다. 다양한 파라미터는 심장 출력, 혈관 직경, 중심 속도, 벽 전단 속도 및 순환 백혈구 수를 포함하여 생체 내 백혈구 모집에 영향을 미칠 수 있다. 중심선 속도는 심장 출력, 말초 혈관 저항 및 인트라바살 부피의 영향을 받습니다.예를 들어, 경동맥 카테터를 통해 주어진 로다민 또는 다른 실험 물질의 큰 양은 모세혈관 후 중심속도 증가시키고 백혈구 포획 및 압연을 억제한다. 반대로, 심장 부전, 심층 마취, 또는 저체온증은 모세관 후 흐름을 감소시킬 수 있다. 중심선 속도를 결정하기 위해, 자유롭게 순환하는 형광 백혈구가 사용될 수 있거나 백혈구는 로다민과 같은 형광 시약으로 염색되어야 합니다.야생 형 균주는 생리적 차이를 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, C57BL/6 마우스는 C57BL/10ScSn 동물에 비해 명확하게 향상된 백혈구 압연, 접착 력 및 환원을 나타낸다. 계획 및 표준화 단계는 현미경 검사법에 대한 크레마스터 근육의 준비 중에 특히 기술을 마스터하는 데 중요합니다.백혈구 모집을 시각화하는 다른 방법은 추가 정보를 산출하고 채용 캐스케이드에 백혈구 및 내피 세포의 개별 기여를 해부하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 약리명상제와 새로운 면역 조절 물질의 전임상 평가를 위한 플랫폼을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

연구

면역학 및 감염병학

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...