Name: leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

Denne studien ble støttet av det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF) 01GL1746E som en del av PRIMAL Consortium. Forfatterne anerkjenner Britta Heckmann og Silvia Pezer for dyktig teknisk assistanse.

Dyr ble plassert under kontrollerte og spesifikke patogenfrie forhold ved IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Alle prosedyrene som er beskrevet her ble godkjent av den lokale IRB og Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Tyskland.
1. Anestesi administrasjon
<ol><li>Bedøve musen ved intraperitoneal (dvs. bolusinjeksjon på 125 mg/kg ketamin og 12,5 mg/kg xylazin.</li>
	<li>Plasser og fest musen i en dorsal liggende stilling på en varmepute f...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia.">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo.">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C.">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422 (2014).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner.">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner.">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).</li><li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis.">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li><li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo.">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li><li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time.">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear.">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li><li>von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+peripheral+lymph+node+microcirculation+in+mice.">Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice.</a> Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).</li><li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice.">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li><li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+(IRI)+of+the+rat+cremaster+muscle.">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).</li><li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice.">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457 (2019).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).</li><li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels.">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li><li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology.">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny.">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li></ol>

IVM som en metode har blitt mye brukt til å studere ulike celletyper i forskjellige organer og har blitt grundig beskrevet og diskutert19. Hovedmålet med denne studien er å gi en effektiv tilnærming til å sette opp og utføre IVM i cremaster muskelen. Praktisere metoden vil gi pålitelige og reproduserbare resultater. Dermed er planlegging og standardisering viktige faktorer for å mestre teknikken. Fremfor alt er teknikken svært avhengig av hemodynamiske og mikrovaskulære parametere, som m...

Intravitalmikroskopi (IVM) er et vanlig brukt verktøy innen leukocytterbiologi. Leukocytter rekruttering følger en kaskade av veldefinerte hendelser initiert av leukocytter fangst, rullende og vedhende til endotelveggen, og til slutt transmigrasjon og ekstravasasjon av leukocytter til selve stedet for betennelse1. Hvert trinn er mediert og kontrollert av ulike chemokines (f.eks. IL-8/CXCL8), reseptorer (f.eks LFA-1, Mac-1) og tilsvarende endotelcelleadhesjonsmolekyler (f.eks. ICAM-1, VCAM-1 og E-Selectin)2,3. Interaksjonen mellom ulike regulatoriske nettsteder, kontrollerende faktorer og mediatorer av leukocytter rekruttering kaskade som reseptor av avanserte glycation sluttprodukter (RAGE), intercellulær adhesjon molekyl 1 (ICAM-1), C-X-C motiv ligand (CXCL)1/2 og deres reseptor CXCR2 ble avdekket ved hjelp av IVM4,5,6,7, 8,,9.9
Metoden for IVM har blitt beskrevet for mange forskjellige organer og vev som tarmen10, hud11, lymfeknuter12, embryonale eggeplomme sekk13 og andre. Den mest studerte metoden for IVM er imidlertid cremaster-modellen, først beskrevet hos rotter14. Mens den fortsatt brukes i rotter15,brukes metoden i dag hovedsakelig hos mus på grunn av den høye overfloden av forskjellige transgene linjer. Vår gruppe har nylig fremhevet den potensielle rollen som cremaster IVM innen inflammatoriske muscolopathies som Duchenne Muskeldystrofi (DMD) studerer dystrophin-mangelfullmdx mus16. På grunn av sin tynne sammenvevde og lett tilgjengelige fibersammensetning representerer cremaster muskelen den ideelle kandidatmuskelen som skal studeres som en hel brakett ved hjelp av lys eller fluorescerende mikroskopi. Leukocytter rekruttering og ekstravasasjon hovedsakelig finner sted i post-kapillær venules, som lett kan identifiseres på en kontinuerlig muskellag i cremaster muskel.
Fordelen med in vivo imaging sammenlignet med andre in vitro analyser er dens biologiske kontekst i en levende organisme. Samtidig kan delineating cellespesifikke bidrag til endret leukocytterrekruttering kreve ytterligere in vitro-modeller som strømningskamre eller endotelanalyser. Kombinasjonen av flere metoder vil gi mest overbevisende data. Forskere bør være klar over begrensningene i cremaster modellen som enhver kirurgisk manipulasjon vil føre til økt leukocytter handel og rekruttering. Derfor er baseline rekruttering vanskelig å anslå med denne metoden. Til tross for sin brede anvendelse, Kan IVM av cremaster være utfordrende og en ny oppsett kan ta tid og ressurser å etablere. Vi tilbyr nå en enkel protokoll som vil bidra til å unngå noen av de vanlige feilene i IVM. Begrensninger vil også bli diskutert, og gratis metoder vil bli fremhevet der det er aktuelt.
IVM av cremaster representerer en ideell tilnærming som skal implementeres innen inflammatoriske og smittsomme studier. Mer spesifikt kan cremaster-modellen være av høy interesse for forskere som studerer skjelettmuskelbiologi i sammenheng med inflammatorisk sykdom.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="874">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketanest S</td>
			<td style="width:204px;">Pfizer Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">PZN: 08509909</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Xylazine</td>
			<td style="width:204px;">CP-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Article-nr.: 1205&#160;</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Saline Solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td>PZN 02737756</td>
			<td>surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe needle Omnican F</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td style="width:175px;">REF 9161502</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Suture 6/0 USP</td>
			<td style="width:204px;">Resorba</td>
			<td style="width:175px;">REF 4217</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Polyethylene tube #10&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427401</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Polyethylene tube #90&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427421</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td style="width:175px;">CAS Number 989-38-8&#160;</td>
			<td>leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Setup Equipment</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">BX51W1</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">40-fold objective&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">Achroplan 40 &#215; /0.80 W</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImSpector software</td>
			<td style="width:204px;">Lavision Biotec GmbH</td>
			<td style="width:175px;">ver. 4.0.469</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">National Institute of Health, USA</td>
			<td style="width:175px;">ver. 1.51j8</td>
			<td>software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy

Intravitalmikroskopi (IVM) er mye brukt til å overvåke fysiologiske og patofysiologiske prosesser innenfor leukocytter rekruttering kaskade in vivo. Den nåværende protokollen representerer en praktisk og reproduserbar metode for å visualisere leukocytterendotelinteraksjonen som fører til leukocytterrekruttering i skjelettmuskulatur avledet vev i musens intakte organisme. Modellen gjelder for alle forskningsområder som fokuserer på granulocytteraktivering og deres rolle i sykdom.
Vi tilbyr en trinnvis protokoll for å veilede gjennom metoden og for å markere potensielle fallgruver og tekniske problemer. Protokollen dekker følgende aspekter: eksperimentelle innstillinger og nødvendig materiale, anestesi av musen, disseksjon av cremaster muskelsamt trakeal og carotis cannulation, IVM opptak og offline analyse. Dataformater som tilhengerleukocytter, fluks (RF) og rullefluksfraksjon (RFF) forklares i detalj, og passende bruksområder diskuteres. Representative resultater fra dystrophin mangelfullmdx mus er gitt i resultatseksjonen.
IVM er et kraftig verktøy for å vurdere leukocytter rekruttering i en in vivo setting; Delineating kan imidlertid for eksempel endotel- og leukocytterfunksjonen kreve en kombinasjon med ex vivo-oppsett som flytkammereksperimenter. Videre kan den genetiske bakgrunnen til dyr av interesse i stor grad påvirke baseline rekruttering, krever individuell finjustering av protokollen gitt. Til tross for sine begrensninger, kan IVM tjene som en plattform for å lett oversette in vitro funn til en levende virveldyr organisme.

IVM i henhold til den gitte protokollen vil gi unik innsikt i kaskade av leukocytter rekruttering i skjelettmuskulatur. Resultatdelen vil fokusere på typiske resultater oppnådd av IVM og fremheve potensielle problemer som kan oppstå.
Det eksperimentelle oppsettet for intravital mikroskopi er skissert i figur 1. Utarbeidelse av cremaster muskel og fjerning av bindevev er avgjørende for å oppnå fokuserte mikroskopiske bilder med en jevn overflate. Overflødig ...

Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Her viser vi hvordan du utfører intravital mikroskopi på post-kapillære venules av musen cremaster muskel. Vanligvis brukt på ulike modeller av betennelse og sepsis, spesielt de som er indusert av chemokiner og cytokiner, fremhever vi dens relevans i studiet av muscoloatier som involverer overdrevet muskelleukocytterinfiltrasjon.

Leukocytter Infiltrasjon av Cremaster Muskel i mus vurdert av Intravital mikroskopi

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Denne praktiske og reproduserbare metoden kan brukes til å visualisere endotel leukocytt interaksjoner som fører til leukocytt rekruttering i en intakt mus. Denne teknikken presenterer også et kraftig verktøy for overvåking av fysiologiske og patofysiologiske prosesser i leukocyttrekrutteringskaskade in vivo. Metoden kan brukes i forskjellige inflammatoriske og septikmodeller.For eksempel har vi nylig fremhevet sin relevans i studiet av muskel- og skjelettpatier som involverer overdrevet muskelleukocytterinfiltrasjon. Vårt forslag til andre forskere som vurderer å bruke denne teknikken er å få så mye praktisk erfaring som mulig som metoden er svært utsatt for mindre avvik. Å demonstrere prosedyren vil være Simon Kranig, en kliniker og seniorforsker fra laboratoriet mitt.Etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemme i det bedøvede eksperimentelle dyret, fest musen i en dorsal liggende stilling på en 37 graders Celsius varmepute og bruk en ikke-absorberbar steril 6-0 sutur for å vikle en enkel løkke rundt frontaltennene. Tape de sammenføyningsendene av suturen til varmeputen og bruk pinsett for å forsiktig løfte huden midt i. Deretter gjør en sirkulær en til to centimeter diameter snitt over nakken og øvre thorax og bruke pinsett for å nøye dissekere den omkringliggende muskel, fett, og bindevev.Plasser en sutur under luftrøret. Bruk små kirurgiske saks for å gjøre en ca 1,3 millimeter tverrgående skåret inn i luftrøret og introdusere et polyetylenrør i den kaudale enden av luftrøret for å sikre de øvre luftveiene. Fest røret som ligger med en enkelt sirkulær knutesutur og finn halspulsåren langs høyre side av luftrøret.Dissekere det omkringliggende vevet fra halspulsåren veggen og passere to biter av sutur under arterien. Bind den første kraniale suturproksimalen til bifurcation av halspulsårene og plasser den andre suturen omtrent fem til åtte millimeter distal fra den første suturen uten å binde. Deretter fester du et 30 centimeter stykke polyetylenrør til en en millimeter sprøytenål fylt med saltvann og bruker en syv millimeter karklips for å klemme halspulsåren distally til den andre suturen.Lag en ca 0,5 millimeter tverrgående kutt i halspulsåren og introdusere det sterile polyetylenrøret i arterien. Fest røret med den andre suturen og fjern karklipsen. Trykk deretter forsiktig sprøytestempelet for å skylle saltvann inn i fartøyet.For å forberede cremaster muskelen, overføre musen til en skreddersydd plast mikroskop ramme med pungen vendt mikroskopet scenen og forsiktig gripe pungen på sitt mest distale ende med pinsett. Trekk pungen forsiktig, fjern en sirkulær omtrent fem millimeter diameter del av skrothuden som holder det åpne vevet godt hydrert med saltvann. Bruk to pinsett til å dissekere det løse bindevevet og lokalisere begge testiklene.Ta tak i en test er distally og forsiktig begynne å trekke ut reproduktive vev fjerne eventuelle omkringliggende bindevev trinnvis. Når testene er eksteriørert, fester du den distale enden av vevet til gummiringen rundt scenen og hydrerer vevet med saltvann. Deretter fjerner du bindevevet forsiktig uten å skade den underliggende cremaster muskelen.Det er viktig å fjerne alt bindevevet som ville resultere i uklare bilder uten å skade den underliggende cremaster muskelen. Når alt vevet er fjernet, gjør en en millimeter tverrgående snitt for å åpne cremaster muskelen før du gjør et langsgående snitt fra svært distal til den proksimale enden av vevet. Muskelen skal åpne sfærisk.Spre muskelen forsiktig over glassstadiet og pin muskelen til gummiringen, og ta vare på å ikke røre eller skade det sentrale området av vevet. Deretter feste de resterende tester til siden for å gi tilgang til regionen av interesse og hydrere vevet med PSS. For intravital visualisering av muskelvaskulaturen, plasser den monterte cremaster muskelen i oppreist mikroskop og velg 40X-målet.Utfør opptakene under kontinuerlig superfusjon med 35 til 37 grader Celsius PSS gjennom et stykke små rør som har blitt tapet til det oppreist målet med mikroskopet for å tillate kontinuerlig drypping av PSS sammen med målet ned på muskelen og vevet. Identifiser post-kapillære venler. Mål mikrosirkulasjonen på venler med en 20 til 40 mikrometerdiameter.Deretter registrerer du høyoppløselige bilder av mikrosirkulasjonen fra cremaster muskelen over en 30-sekunders periode kontinuerlig justere fokus på grunn av små endringer i sammentrekning og avslapning av muskelvev. Overflødig bindevev kan føre til uklare mikroskopiske bilder. I dette representative mikroskopiske bildet kan postkapillær venulene som skal være mellom 20 og 40 mikrometer i diameter identifiseres ved samløpet mellom to mindre fartøy.Tilhenger og rullende leukocytter kan visualiseres mens sirkulerende leukocytter kan bare spores i slow motion replay av innspilte videoer. En rekke parametere kan påvirke leukocytt rekruttering in vivo inkludert hjerteproduksjon, fartøyets diameter, midtlinjehastighet, veggskjærrate og antall sirkulerende leukocytter. Merk at midtlinjens hastighet påvirkes av hjerteutgang, perifer vaskulær motstand og intravasalt volum.For eksempel øker et stort volum rhodamin eller annet eksperimentelt stoff gitt via carotiskateteret den postkapilerende midtlinjen og hemmer leukocyttfangst og ruller. Tvert imot kan hjertesvikt, dypbedøvelse eller hypotermi redusere etterkapillærstrømmen. For å bestemme midtlinjen hastighet, fritt sirkulerende fluorescerende leukocytter kan brukes eller leukocytter må farges med fluorescerende reagenser som Rhodamine.Legg merke til at ville typestammer kan vise fysiologisk varians. For eksempel viser C57BL/6-mus tydelig forbedret leukocyttrulling, vedheft og transmigrasjon sammenlignet med C57BL/10ScSn-dyr. Planleggings- og standardiseringsstadiene er viktige for å mestre teknikken, spesielt under utarbeidelsen av cremaster muskel for mikroskopi.Andre metoder for visualisering av leukocytterrekruttering kan utføres for å gi ytterligere informasjon og for å bidra til å dissekere det individuelle bidraget fra leukocytter og endotelceller til rekrutteringskaskade. Denne teknikken gir en plattform for preklinisk evaluering av farmakologiske meditatorer og nye immunmodulerende stoffer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av Spleen: Kvantitativ analyse av Parasite Mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Meget Løst Intravital Striped-belysning Mikroskopi av Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Long Term intra multiphoton Mikros Imaging av immunceller i friske og syke leveren Bruke CXCR6.Gfp Reporter Mus

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intramikroskopi av Leukocytt-endothelial og blodplater-leukocytt Interaksjon i Mesenterial Vener i Mus

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrofiler og monocytter i mesenterisk Veins av intraMikros på bedøvet Mus i sanntid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualisere leukocytter rullende og vedheft i Angiotensin II-tilført mus: teknikker og fallgruver

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...