Name: leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00
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Este estudo foi apoiado pelo Ministério Federal alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) 01GL1746E como parte do Consórcio PRIMAL. Os autores reconhecem Britta Heckmann e Silvia Pezer por uma assistência técnica habilidosa.

Os animais foram alojados sob condições controladas e específicas sem patógenos no IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo IRB local e pelo Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Alemanha.
1. Administração de anestesia
<ol><li>Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal (i.p.) de 125 mg/kg de cetamina e 12,5 mg/kg de xilazina.</li>
	<li>Coloque e fixar o mouse em uma posição d...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia.">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo.">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C.">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422 (2014).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner.">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner.">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).</li><li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis.">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li><li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo.">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li><li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time.">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear.">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li><li>von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+peripheral+lymph+node+microcirculation+in+mice.">Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice.</a> Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).</li><li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice.">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li><li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+(IRI)+of+the+rat+cremaster+muscle.">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).</li><li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice.">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457 (2019).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).</li><li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels.">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li><li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology.">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny.">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li></ol>

O IVM como método tem sido amplamente utilizado para estudar diferentes tipos de células em diferentes órgãos e tem sido extensivamente descrito e discutido19. O objetivo principal deste estudo é fornecer uma abordagem eficiente para configurar e executar ivm no músculo cremaster. A prática do método produzirá resultados confiáveis e reprodutíveis. Assim, o planejamento e a padronização são fatores-chave para dominar a técnica. Acima de tudo, a técnica é muito dependente de parâm...

A microscopia intravital (IVM) é uma ferramenta comumente aplicada no campo da biologia leucócito. O recrutamento de leucócitos segue uma cascata de eventos bem definidos iniciados pela captura de leucócitos, rolamento e adesão à parede endotelial, e finalmente transmigração e extravasação de leucócitos para o local real de inflamação1. Cada passo é mediado e controlado por várias quimiocinas (por exemplo, IL-8/CXCL8), receptores (por exemplo, LFA-1, Mac-1) e moléculas de adesão celular endotelial correspondentes (por exemplo, ICAM-1, VCAM-1 e E-Selectin)2,3. A interação de diferentes locais reguladores, fatores de controle e mediadores da cascata de recrutamento de leucócitos como receptor de produtos finais de glicação avançada (RAGE), molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), liga de motivos C-X-C (CXCL)1/2 e seu receptor CXCR2 foram descobertos utilizando IVM4,5,6,7,8,9.
O método do IVM tem sido descrito para muitos órgãos e tecidos diferentes, como o intestino10,pele11,linfonodos12,o saco de gema embrionária13 e outros. No entanto, o método mais estudado do IVM é o modelo cremaster, descrito pela primeira vez em ratos14. Embora ainda seja usado em ratos15,o método é hoje aplicado principalmente em camundongos devido à alta abundância de diferentes linhas transgênicas. Nosso grupo destacou recentemente o papel potencial do cremaster IVM no campo das muscolopatias inflamatórias como a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) estudando camundongos mdx deficientes de distrofina16. Devido à sua fina composição de fibras entrelaçadas e de fácil acesso, o músculo cremaster representa o músculo candidato ideal a ser estudado como um conjunto de montagem usando microscopia leve ou fluorescente. O recrutamento e extravasação de leucócitos ocorre principalmente em venules pós-capilar, que podem ser facilmente identificados em uma camada muscular contínua no músculo cremaster.
A vantagem da imagem in vivo em comparação com outros ensaios in vitro é seu contexto biológico em um organismo vivo. Ao mesmo tempo, delinear contribuições específicas de células para o recrutamento alterado de leucócitos pode exigir modelos adicionais in vitro, como câmaras de fluxo ou ensaios endoteliais. A combinação de múltiplos métodos produzirá dados mais convincentes. Os cientistas devem estar cientes das limitações do modelo cremaster, pois qualquer manipulação cirúrgica levará ao aumento do tráfico e recrutamento de leucócitos. Portanto, o recrutamento de base é difícil de estimar com este método. Apesar de sua ampla aplicação, o IVM do cremaster pode ser desafiador e uma nova configuração pode levar tempo e recursos para estabelecer. Agora fornecemos um protocolo fácil que ajudará a evitar alguns dos erros comuns no IVM. Além disso, serão discutidas limitações e os métodos complementares serão destacados quando aplicável.
O IVM do cremaster representa uma abordagem ideal a ser implementada no campo dos estudos inflamatórios e infecciosos. Mais especificamente, o modelo cremaster pode ser de alto interesse para os cientistas que estudam biologia muscular esquelética no contexto da doença inflamatória.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="874">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketanest S</td>
			<td style="width:204px;">Pfizer Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">PZN: 08509909</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Xylazine</td>
			<td style="width:204px;">CP-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Article-nr.: 1205&#160;</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Saline Solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td>PZN 02737756</td>
			<td>surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe needle Omnican F</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td style="width:175px;">REF 9161502</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Suture 6/0 USP</td>
			<td style="width:204px;">Resorba</td>
			<td style="width:175px;">REF 4217</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Polyethylene tube #10&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427401</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Polyethylene tube #90&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427421</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td style="width:175px;">CAS Number 989-38-8&#160;</td>
			<td>leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Setup Equipment</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">BX51W1</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">40-fold objective&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">Achroplan 40 &#215; /0.80 W</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImSpector software</td>
			<td style="width:204px;">Lavision Biotec GmbH</td>
			<td style="width:175px;">ver. 4.0.469</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">National Institute of Health, USA</td>
			<td style="width:175px;">ver. 1.51j8</td>
			<td>software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy

A microscopia intravital (IVM) é amplamente utilizada para monitorar processos fisiológicos e fisiopatológicos dentro da cascata de recrutamento de leucócitos in vivo. O protocolo atual representa um método prático e reprodutível para visualizar a interação com o endotélio leucócito, levando ao recrutamento de leucócitos no tecido derivado do músculo esquelético dentro do organismo intacto do camundongo. O modelo é aplicável a todos os campos de pesquisa que se concentram na ativação de granulócitos e seu papel na doença.
Fornecemos um protocolo passo a passo para orientar através do método e destacar possíveis armadilhas e dificuldades técnicas. O protocolo abrange os seguintes aspectos: configurações experimentais e material necessário, anestesia do camundongo, dissecção do músculo cremaster, bem como cânula traqueal e carótida, gravações ivm e análise off-line. Formatos de dados como leucócitos aderentes, fluxo de rolamento (RF) e fração de fluxo de rolamento (RFF) são explicados detalhadamente e aplicativos apropriados são discutidos. Os resultados representativos dos camundongos mdx deficientes de distrofina são fornecidos na seção de resultados.
O IVM é uma ferramenta poderosa para avaliar o recrutamento de leucócitos em um ambiente in vivo; no entanto, delinear, por exemplo, a função endotelial e leucócito pode exigir uma combinação com configurações ex-vivo, como experimentos de câmara de fluxo. Além disso, o histórico genético de animais de interesse pode influenciar muito o recrutamento de base, exigindo ajuste fino individual do protocolo fornecido. Apesar de suas limitações, o IVM pode servir como uma plataforma para traduzir prontamente achados in vitro em um organismo vertebrado vivo.

IvM de acordo com o protocolo fornecido produzirá insights únicos sobre a cascata de recrutamento de leucócitos no músculo esquelético. A seção de resultados se concentrará nos resultados típicos obtidos pelo IVM e destacará possíveis problemas que podem encontrar.
A configuração experimental para microscopia intravital está descrita na Figura 1. A preparação do músculo cremaster e a remoção do tecido conjuntivo são cruciais para obter imagens ...

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Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Este método prático e reprodutível pode ser usado para visualizar as interações de leucócitos endotélio que levam ao recrutamento de leucócitos dentro de um rato intacto. Esta técnica também apresenta uma poderosa ferramenta para o monitoramento de processos fisiológicos e fisiofiológicos dentro da cascata de recrutamento de leucócitos in vivo. O método pode ser aplicado em diferentes modelos inflamatórios e sépticos.Por exemplo, recentemente destacamos sua relevância no estudo de musculopatias envolvendo infiltração de leucócitos musculares exagerados. Nossa sugestão para colegas cientistas que estão considerando usar essa técnica é obter o máximo de experiência prática possível, pois o método é muito suscetível a pequenos desvios. Demonstrando o procedimento será Simon Kranig, um clínico e cientista sênior do meu laboratório.Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé no animal experimental anestesiado, fixe o rato em uma posição dorsal recumbent em uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus e use uma sutura estéril nãoabsorbável para enrolar um simples laço ao redor dos dentes frontais. Tape as extremidades de junção da sutura na almofada de aquecimento e use pinças para levantar suavemente a pele na linha média. Em seguida, faça uma incisão circular de um a dois centímetros de diâmetro sobre o pescoço e o tórax superior e use pinças para dissecar cuidadosamente os tecidos musculares, gordos e conjuntivos circundantes.Coloque uma sutura sob a traqueia. Use uma pequena tesoura cirúrgica para fazer um corte transverso de aproximadamente 1,3 milímetros na traqueia e introduzir um tubo de polietileno na extremidade caudal da traqueia para proteger as vias aéreas superiores. Fixar o tubo localizado com uma única sutura de nó circular e localizar a artéria carótida ao longo do lado direito da traqueia.Dissecar o tecido circundante da parede da artéria carótida e passar dois pedaços de sutura sob a artéria. Amarre a primeira sutura craniana proximal à bifurcação das artérias carótidas e posicione a segunda sutura cerca de cinco a oito milímetros distal da primeira sutura sem amarrar. Em seguida, conecte um pedaço de 30 centímetros de tubo de polietileno a uma agulha de seringa de um mililitro cheia de soro fisiológico e use um clipe de vaso de sete milímetros para fixar a artéria carótida distally à segunda sutura.Faça um corte transverso de aproximadamente 0,5 milímetros na artéria carótida e introduza o tubo de polietileno estéril na artéria. Fixar o tubo com a segunda sutura e remover o clipe do vaso. Em seguida, deprimir suavemente o êmbolo da seringa para jogar soro fisiológico no vaso.Para preparar o músculo cremaster, transfira o mouse para uma estrutura de microscópio plástico feita sob medida com o escroto voltado para o estágio do microscópio e segure cuidadosamente o escroto em sua extremidade mais distal com pinças. Puxando o escroto suavemente, remova uma seção circular de cerca de cinco milímetros de diâmetro da pele escrotal mantendo o tecido aberto bem hidratado com soro fisiológico. Use duas pinças para dissecar o tecido conjuntivo solto e localizar ambos os testículos.Compre um teste é distally e suavemente começar a retirar o tecido reprodutivo removendo qualquer tecido conjuntivo circundante passo a passo. Uma vez que o testísta tenha sido exteriorizado, fixar a extremidade distal do tecido ao anel de borracha ao redor do palco e hidratar o tecido com soro fisiológico. Em seguida, remova cuidadosamente o tecido conjuntivo sem prejudicar o músculo cremaster subjacente.É fundamental remover todo o tecido conjuntivo que resultaria em imagens embaçadas sem prejudicar o músculo cremaster subjacente. Quando todo o tecido tiver sido removido, faça uma incisão transversal de um milímetro para abrir o músculo cremaster antes de fazer uma incisão longitudinal do muito distal à extremidade proximal do tecido. O músculo deve abrir esfericamente.Espalhe cuidadosamente o músculo sobre a fase de vidro e fixe o músculo no anel de borracha tomando cuidado para não tocar ou prejudicar a região central do tecido. Em seguida, fixar o restante do testígico para o lado para dar acesso à região de interesse e hidratar o tecido com PSS. Para visualização intravital da vasculatura muscular, coloque o músculo cremaster montado no microscópio vertical e selecione o objetivo de 40X.Realize as gravações sob superfusão contínua com PSS de 35 a 37 graus Celsius através de um pedaço de pequeno tubo que foi colado ao objetivo vertical do microscópio para permitir o gotejamento contínuo de PSS ao lado do objetivo até o músculo e tecido. Identifique as venules pós-capilares. Meça a microcirculação em venules com diâmetro de 20 a 40 micrômetros.Em seguida, registre imagens de alta resolução da microcirculação do músculo cremaster durante um período de 30 segundos, ajustando continuamente o foco devido a pequenas alterações na contração e relaxamento do tecido muscular. O excesso de tecido conjuntivo pode levar a imagens microscópicas embaçadas. Nesta imagem microscópica representativa, os venules pós-capilares que devem ter entre 20 e 40 micrômetros de diâmetro podem ser identificados pela confluência de dois vasos menores.Leucócitos aderentes e rolando podem ser visualizados enquanto os leucócitos circulantes só podem ser rastreados em replay em câmera lenta de vídeos gravados. Uma infinidade de parâmetros pode afetar o recrutamento de leucócitos in vivo, incluindo a saída cardíaca, diâmetro do vaso, velocidade central, taxa de corte de parede e número de leucócitos circulantes. Observe que a velocidade central é influenciada pela saída cardíaca, resistência vascular periférica e volume intravasal.Por exemplo, um grande volume de Rhodamine ou outra substância experimental dada através do cateter carótida aumenta a velocidade central pós-capilar e inibe a captura e rolamento de leucócitos. Pelo contrário, insuficiência cardíaca, anestesia profunda ou hipotermia podem diminuir o fluxo pós-capilar. Para determinar a velocidade da linha central, podem ser usados leucócitos fluorescentes que circulam livremente ou os leucócitos devem ser tingidos com reagentes fluorescentes como Rhodamine.Observe que cepas de tipo selvagem podem mostrar variância fisiológica. Por exemplo, os camundongos C57BL/6 demonstram claramente melhor rolamento de leucócitos, adesão e transmigração em comparação com animais C57BL/10ScSn. As etapas de planejamento e padronização são importantes para dominar a técnica especialmente durante a preparação do músculo cremaster para microscopia.Outros métodos para visualizar o recrutamento de leucócitos podem ser conduzidos para produzir informações adicionais e ajudar a dissecar a contribuição individual de leucócitos e células endoteliais para a cascata de recrutamento. Esta técnica fornece uma plataforma para a avaliação pré-clínica de meditadores farmacológicos e novas substâncias modulatórias imunológicas.

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Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualizando leucócitos rolamento e adesão em angiotensina II-infundido ratos: técnicas e armadilhas

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...