Name: leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00
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Este estudio fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) 01GL1746E como parte del Consorcio PRIMAL. Los autores reconocen a Britta Heckmann y Silvia Pezer por su hábil asistencia técnica.

Los animales fueron alojados bajo condiciones controladas y específicas libres de patógenos en el IBF (Interfakult-re Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Todos los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por el IRB local y el Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Alemania.
1. Administración de anestesia
<ol><li>Anestetizar el ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de bolo de 125 mg/kg de ketamina y 12,5 mg/kg de xilazina.</li>
	<li>Coloque ...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia.">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo.">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C.">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422 (2014).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner.">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner.">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).</li><li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis.">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li><li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo.">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li><li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time.">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear.">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li><li>von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+peripheral+lymph+node+microcirculation+in+mice.">Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice.</a> Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).</li><li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice.">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li><li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+(IRI)+of+the+rat+cremaster+muscle.">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).</li><li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice.">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457 (2019).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).</li><li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels.">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li><li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology.">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny.">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li></ol>

IVM como método se ha utilizado ampliamente para estudiar diferentes tipos de células en diferentes órganos y ha sido ampliamente descrito y discutido19. El objetivo principal de este estudio es proporcionar un enfoque eficiente para configurar y realizar IVM en el músculo cremaestro. La práctica del método producirá resultados fiables y reproducibles. Por lo tanto, la planificación y la estandarización son factores clave para dominar la técnica. Sobre todo, la técnica es muy dependient...

La microscopía intravital (IVM) es una herramienta comúnmente aplicada en el campo de la biología de leucocitos. El reclutamiento de leucocitos sigue una cascada de eventos bien definidos iniciados por la captura de leucocitos, laminación y adhesión a la pared endotelial, y finalmente la transmigración y extravasación de leucocitos al sitio real de la inflamación1. Cada paso está mediado y controlado por varias quimioquinas (por ejemplo, IL-8/CXCL8), receptores (por ejemplo, LFA-1, Mac-1) y las moléculas de adhesión de células endoteliales correspondientes (por ejemplo, ICAM-1, VCAM-1 y E-Selectin)2,3. La interacción de diferentes sitios reguladores, factores de control y mediadores de la cascada de reclutamiento de leucocitos como receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE), molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), ligando de motivo C-X-C (CXCL)1/2 y su receptor CXCR2 fueron descubiertos utilizando IVM4,5,6,7,8,9.
El método de La iVM se ha descrito para muchos órganos y tejidos diferentes como el intestino10,la piel11,los ganglios linfáticos12,el saco de yema embrionaria13 y otros. Sin embargo, el método más ampliamente estudiado de IVM es el modelo cremaster, descrito por primera vez en ratas14. Mientras que todavía se utiliza en ratas15, el método se aplica hoy en día principalmente en ratones debido a la alta abundancia de diferentes líneas transgénicas. Nuestro grupo ha destacado recientemente el papel potencial de la iVM de cremaster en el campo de las muscolopatías inflamatorias como la distrofia muscular de Duchenne (DMD) estudiando ratones mdx deficientes en distrofina16. Debido a su composición delgada entretejida y de fácil acceso de fibra, el músculo cremaestro representa el músculo candidato ideal para ser estudiado como un montaje completo utilizando la microscopía ligera o fluorescente. El reclutamiento y la extravasación de leucocitos se llevan a cabo principalmente en los ventosos post-capilares, que se pueden identificar fácilmente en una capa muscular continua en el músculo cremaestro.
La ventaja de la imagen in vivo en comparación con otros ensayos in vitro es su contexto biológico en un organismo vivo. Al mismo tiempo, la delinear contribuciones específicas de las células al reclutamiento alterado de leucocitos puede requerir modelos in vitro adicionales como cámaras de flujo o ensayos endoteliales. La combinación de múltiples métodos producirá datos más convincentes. Los científicos deben ser conscientes de las limitaciones del modelo cremaster, ya que cualquier manipulación quirúrgica conducirá a un aumento del tráfico y reclutamiento de leucocitos. Por lo tanto, el reclutamiento de referencia es difícil de estimar con este método. A pesar de su amplia aplicación, IVM del cremaster puede ser difícil y una configuración novedosa puede tomar tiempo y recursos para establecer. Ahora proporcionamos un protocolo fácil que ayudará a evitar algunos de los errores comunes en IVM. Además, se discutirán las limitaciones y se resaltarán los métodos complementarios cuando corresponda.
IVM del cremaster representa un enfoque ideal para ser implementado en el campo de los estudios inflamatorios e infecciosos. Más específicamente, el modelo cremaster puede ser de alto interés para los científicos que estudian la biología del músculo esquelético en el contexto de la enfermedad inflamatoria.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="874">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketanest S</td>
			<td style="width:204px;">Pfizer Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">PZN: 08509909</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Xylazine</td>
			<td style="width:204px;">CP-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Article-nr.: 1205&#160;</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Saline Solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td>PZN 02737756</td>
			<td>surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe needle Omnican F</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td style="width:175px;">REF 9161502</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Suture 6/0 USP</td>
			<td style="width:204px;">Resorba</td>
			<td style="width:175px;">REF 4217</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Polyethylene tube #10&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427401</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Polyethylene tube #90&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427421</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td style="width:175px;">CAS Number 989-38-8&#160;</td>
			<td>leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Setup Equipment</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">BX51W1</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">40-fold objective&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">Achroplan 40 &#215; /0.80 W</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImSpector software</td>
			<td style="width:204px;">Lavision Biotec GmbH</td>
			<td style="width:175px;">ver. 4.0.469</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">National Institute of Health, USA</td>
			<td style="width:175px;">ver. 1.51j8</td>
			<td>software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy

La microscopía intravital (IVM) se utiliza ampliamente para monitorear los procesos fisiológicos y fisiopatológicos dentro de la cascada de reclutamiento de leucocitos in vivo. El protocolo actual representa un método práctico y reproducible para visualizar la interacción del leucocito endotelio que conduce al reclutamiento de leucocitos en el tejido derivado del músculo esquelético dentro del organismo intacto del ratón. El modelo es aplicable a todos los campos de investigación que se centran en la activación de granulocitos y su papel en la enfermedad.
Proporcionamos un protocolo paso a paso para guiar a través del método y resaltar posibles escollos y dificultades técnicas. El protocolo cubre los siguientes aspectos: ajustes experimentales y material requerido, anestesia del ratón, disección del músculo cremaestro, así como cánula traqueal y carótida, grabaciones de IVM y análisis fuera de línea. Los formatos de datos como leucocitos adherentes, flujo rodante (RF) y fracción de flujo rodante (RFF) se explican en detalle y se discuten las aplicaciones adecuadas. Los resultados representativos de los ratones mdx con deficiencia de distrofina se proporcionan en la sección de resultados.
IVM es una poderosa herramienta para evaluar el reclutamiento de leucocitos en un entorno in vivo; sin embargo, la delinear, por ejemplo, la función endotelial y leucocito puede requerir una combinación con configuraciones ex vivo como experimentos de cámara de flujo. Además, los antecedentes genéticos de los animales de interés pueden influir en gran medida en el reclutamiento de líneas de base, lo que requiere una afinación individual del protocolo proporcionado. A pesar de sus limitaciones, IVM puede servir como una plataforma para traducir fácilmente los hallazgos in vitro en un organismo vertebrado vivo.

IVM según el protocolo proporcionado proporcionará información única sobre la cascada de reclutamiento de leucocitos en el músculo esquelético. La sección de resultados se centrará en los resultados típicos obtenidos por IVM y resaltará los posibles problemas que puedan surgir.
La configuración experimental para la microscopía intravital se describe en la Figura 1. La preparación del músculo cremaestro y la eliminación del tejido conectivo es crucia...

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Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.

Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Este método práctico y reproducible se puede utilizar para visualizar las interacciones de leucocitos de endotelio que conducen al reclutamiento de leucocitos dentro de un ratón intacto. Esta técnica también presenta una poderosa herramienta para el seguimiento de los procesos fisiológicos y fisiopatológicos dentro de la cascada de reclutamiento de leucocitos in vivo. El método se puede aplicar en diferentes modelos inflamatorios y sépticos.Por ejemplo, recientemente hemos destacado su relevancia en el estudio de las musculopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares. Nuestra sugerencia a otros científicos que están considerando usar esta técnica es obtener tanta experiencia práctica como sea posible, ya que el método es muy susceptible a desviaciones menores. Demostrando el procedimiento estará Simon Kranig, un clínico y científico senior de mi laboratorio.Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco de los dedos en el animal experimental anestesiado, fijar el ratón en una posición dorsal reclinada en una almohadilla de calentamiento de 37 grados Celsius y utilizar una sutura estéril no absorbible 6-0 para enrollar un simple bucle alrededor de los dientes frontales. Pegue los extremos de unión de la sutura a la almohadilla de calentamiento y use pinzas para levantar suavemente la piel en la línea media. A continuación, haga una incisión circular de uno a dos centímetros de diámetro sobre el cuello y el tórax superior y use pinzas para diseccionar cuidadosamente el músculo circundante, la grasa y los tejidos conectivos.Coloque una sutura debajo de la tráquea. Utilice tijeras quirúrgicas pequeñas para hacer un corte transversal de aproximadamente 1,3 milímetros en la tráquea e introduzca un tubo de polietileno en el extremo caudal de la tráquea para asegurar las vías respiratorias superiores. Fijar el tubo situado con una sola sutura de nudo circular y localizar la arteria carótida a lo largo del lado derecho de la tráquea.Disecciona el tejido circundante de la pared de la arteria carótida y pasa dos trozos de sutura debajo de la arteria. Ate la primera sutura craneal proximal a la bifurcación de las arterias carótidas y coloque la segunda sutura de unos cinco a ocho milímetros distal desde la primera sutura sin atar. A continuación, coloque una pieza de 30 centímetros de tubo de polietileno en una aguja de jeringa de un mililitro llena de solución salina y utilice un clip de recipiente de siete milímetros para sujetar la arteria carótida distalmente a la segunda sutura.Haga un corte transversal de aproximadamente 0,5 milímetros en la arteria carótida e introduzca el tubo de polietileno estéril en la arteria. Fije el tubo con la segunda sutura y retire el clip del recipiente. A continuación, presione suavemente el émbolo de la jeringa para que la solución salina entre en el recipiente.Para preparar el músculo crema, transfiera el ratón a un marco de microscopio de plástico hecho a medida con el escroto mirando a la etapa del microscopio y agarre cuidadosamente el escroto en su extremo más distal con pinzas. Tirando suavemente del escroto, retire una sección circular de unos cinco milímetros de diámetro de la piel escrotal manteniendo el tejido abierto bien hidratado con solución salina. Utilice dos pinzas para diseccionar el tejido conectivo suelto y localizar ambos testículos.Agarre un testículo distalmente y comience a extraer suavemente el tejido reproductivo eliminando los tejidos conectivos circundantes paso a paso. Una vez que el testículo ha sido exteriorizado, fijar el extremo distal del tejido al anillo de goma que rodea la etapa e hidratar el tejido con solución salina. A continuación, retire cuidadosamente el tejido conectivo sin dañar el músculo cremador subyacente.Es fundamental eliminar todo el tejido conectivo que resultaría en imágenes borrosas sin dañar el músculo cremador subyacente. Cuando se haya extraído todo el tejido, haga una incisión transversal de un milímetro para abrir el músculo cremario antes de hacer una incisión longitudinal desde el extremo muy distal al extremo proximal del tejido. El músculo debe abrirse esféricamente.Esparce cuidadosamente el músculo sobre la etapa de vidrio y fija el músculo al anillo de goma teniendo cuidado de no tocar o dañar la región central del tejido. A continuación, fijar el resto de testículos a un lado para dar acceso a la región de interés e hidratar el tejido con PSS. Para la visualización intravital de la vasculatura muscular, coloque el músculo cremamado montado en el microscopio vertical y seleccione el objetivo 40X.Realizar las grabaciones bajo superfusión continua con 35 a 37 grados Celsius PSS a través de un pedazo de tubo pequeño que ha sido pegado al objetivo vertical del microscopio para permitir el goteo continuo de PSS junto con el objetivo hacia abajo en el músculo y el tejido. Identifique las venas post-capilares. Mida la microcirculación en venules con un diámetro de 20 a 40 micrómetros.A continuación, registre imágenes de alta resolución de la microcirculación del músculo cremador durante un período de 30 segundos ajustando continuamente el enfoque debido a ligeros cambios en la contracción y relajación del tejido muscular. El exceso de tejido conectivo puede conducir a imágenes microscópicas borrosas. En esta imagen microscópica representativa, las venas post-capilares que deben tener entre 20 y 40 micrómetros de diámetro pueden ser identificadas por la confluencia de dos vasos más pequeños.Los leucocitos adherentes y rodantes se pueden visualizar mientras que los leucocitos circulantes solo pueden ser rastreados en la reproducción a cámara lenta de los videos grabados. Una multitud de parámetros puede afectar el reclutamiento de leucocitos in vivo, incluyendo la salida cardíaca, el diámetro del vaso, la velocidad de la línea central, la velocidad de cizallamiento de la pared y el número de leucocitos circulantes. Tenga en cuenta que la velocidad de la línea central está influenciada por la salida cardíaca, la resistencia vascular periférica y el volumen intravasal.Por ejemplo, un gran volumen de Rhodamine u otra sustancia experimental dada a través del catéter carótido aumenta la velocidad de la línea central post-capilar e inhibe la captura y la rodadura de leucocitos. Por el contrario, la insuficiencia cardíaca, la anestesia profunda o la hipotermia pueden disminuir el flujo post-capilar. Para determinar la velocidad de la línea central, se pueden utilizar leucocitos fluorescentes que circulan libremente o los leucocitos deben teñirse con reactivos fluorescentes como Rhodamine.Tenga en cuenta que las cepas de tipo salvaje pueden mostrar varianza fisiológica. Por ejemplo, los ratones C57BL/6 demuestran laminación, adhesión y transmigración de leucocitos claramente mejoradas en comparación con los animales C57BL/10ScSn. Las etapas de planificación y estandarización son importantes para dominar la técnica, especialmente durante la preparación del músculo cremador para microscopía.Se pueden llevar a cabo otros métodos para visualizar el reclutamiento de leucocitos para producir información adicional y ayudar a diseccionar la contribución individual de leucocitos y células endoteliales a la cascada de reclutamiento. Esta técnica proporciona una plataforma para la evaluación preclínica de meditadores farmacológicos y nuevas sustancias moduladoras inmunitarias.

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Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualizar leucocitos del balanceo y adherencia en angiotensina II-infundido ratones: técnicas y trampas

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...