Name: leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

Denna studie stöddes av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) 01GL1746E som en del av PRIMAL Consortium. Författarna erkänner Britta Heckmann och Silvia Pezer för skickligt tekniskt bistånd.

Djur inhystes under kontrollerat, och specifik pathogen-fritt villkorar på IBFEN (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Alla förfaranden som beskrivs här godkändes av den lokala IRB och Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Tyskland.
1. Anestesi administration
<ol><li>Bedöva musen genom intraperitoneal (i.p.) bolus injektion av 125 mg/kg ketamin och 12,5 mg/kg xylazine.</li>
	<li>Placera och fäst musen i en dorsal recumbent position på en v?...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia.">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo.">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C.">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422 (2014).</li><li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner.">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).</li><li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner.">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).</li><li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis.">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li><li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo.">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li><li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time.">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear.">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li><li>von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+peripheral+lymph+node+microcirculation+in+mice.">Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice.</a> Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).</li><li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice.">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li><li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+(IRI)+of+the+rat+cremaster+muscle.">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).</li><li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice.">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457 (2019).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).</li><li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels.">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li><li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology.">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny.">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li></ol>

IVM som metod har använts i stor utsträckning för att studera olika celltyper i olika organ och har beskrivits och diskuterats ingående19. Huvudsyftet med denna studie är att ge ett effektivt tillvägagångssätt för att inrätta och utföra IVM i cremaster muskeln. Öva metoden kommer att ge tillförlitliga och reproducerbara resultat. Planering och standardisering är därför viktiga faktorer för att behärska tekniken. Framför allt är tekniken mycket beroende av hemodynamic och mikrov...

Intravital mikroskopi (IVM) är ett vanligt tillämpat verktyg inom leukocytebiologi. Leukocyte rekrytering följer en kaskad av väldefinierade händelser som initierats av leukocyte fånga, rullande och vidhäftning till endotelväggen, och slutligen transmigration och extravasation av leukocyter till den faktiska platsen för inflammation1. Varje steg medieras och kontrolleras av olika chemokines (t.ex. IL-8/CXCL8), receptorer (t.ex.2,3 Samspelet mellan olika regulatoriska webbplatser, kontrollerande faktorer och medlare av leukocyt rekrytering kaskad som receptor av avancerade glycation slutprodukter (RAGE), intercellulära vidhäftning molekyl 1 (ICAM-1), C-X-C motiv ligand (CXCL)1/2 och deras receptor CXCR2 upptäcktes med IVM4,5,6,77,8,9.
Metoden för IVM har beskrivits för många olika organ och vävnader såsom tarmen10, hud11, lymfkörtlar12, embryonala äggula säck13 och andra. Den mest studerade metoden för IVM är dock cremaster-modellen, som först beskrevs hos råttor14. Även om den fortfarande används hos råttor15,används metoden numera huvudsakligen hos möss på grund av det höga förekomst av olika transgena linjer. Vår grupp har nyligen belyst den potentiella roll cremaster IVM inom inflammatoriska muscolopathies som Duchennes muskeldystrofi (DMD) studera dystrophin-brist mdx möss16. På grund av sin tunna sammanvävd och lättillgänglig fibersammansättning representerar cremastermuskeln den idealiska kandidatmuskeln som ska studeras som ett helt fäste med hjälp av ljus- eller fluorescerande mikroskopi. Leukocyte rekrytering och extravasation sker huvudsakligen i post-kapillär venules, som lätt kan identifieras på en kontinuerlig muskulös lager i cremaster muskeln.
Fördelen med in vivo-avbildning jämfört med andra in vitro-analyser är dess biologiska sammanhang i en levande organism. Samtidigt kan delineating cellspecifika bidrag till förändrad leukocytrekrytering kräva ytterligare in vitro-modeller som flödeskammare eller endotelanalyser. Kombinationen av flera metoder kommer att ge mest övertygande data. Forskare bör vara medvetna om begränsningarna i cremaster modellen som någon kirurgisk manipulation kommer att leda till ökad leukocyte människohandel och rekrytering. Därför är baslinjerekrytering svårt att uppskatta med denna metod. Trots sin breda tillämpning kan IVM av cremaster vara utmanande och en ny inställning kan ta tid och resurser att upprätta. Vi tillhandahåller nu ett enkelt protokoll som kommer att bidra till att undvika några av de vanligaste misstagen i IVM. Dessutom kommer begränsningar att diskuteras och kostnadsfria metoder kommer att belysas där så är tillämpligt.
IVM av cremaster representerar ett idealiskt tillvägagångssätt som skall genomföras inom området inflammatoriska och infektiösa studier. Mer specifikt kan cremaster-modellen vara av stort intresse för forskare som studerar skelettmuskelbiologi i samband med inflammatorisk sjukdom.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="874">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketanest S</td>
			<td style="width:204px;">Pfizer Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">PZN: 08509909</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Xylazine</td>
			<td style="width:204px;">CP-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Article-nr.: 1205&#160;</td>
			<td>anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Saline Solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td>PZN 02737756</td>
			<td>surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe needle Omnican F</td>
			<td>B. Braun Melsungen&#160;</td>
			<td style="width:175px;">REF 9161502</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Suture 6/0 USP</td>
			<td style="width:204px;">Resorba</td>
			<td style="width:175px;">REF 4217</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Polyethylene tube #10&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427401</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Polyethylene tube #90&#160;</td>
			<td>BD GmbH</td>
			<td style="width:175px;">Supplier No. 427421</td>
			<td>surgical preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td style="width:175px;">CAS Number 989-38-8&#160;</td>
			<td>leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Setup Equipment</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">BX51W1</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">40-fold objective&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">Achroplan 40 &#215; /0.80 W</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImSpector software</td>
			<td style="width:204px;">Lavision Biotec GmbH</td>
			<td style="width:175px;">ver. 4.0.469</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">National Institute of Health, USA</td>
			<td style="width:175px;">ver. 1.51j8</td>
			<td>software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukocyte infiltration of cremaster muscle in mice assessed by intravital microscopy

Intravital mikroskopi (IVM) används ofta för att övervaka fysiologiska och patofysiologiska processer inom leukocyte rekrytering kaskad in vivo. Det nuvarande protokollet representerar en praktisk och reproducerbar metod för att visualisera leukocyte endotel interaktion leder till leukocyte rekrytering i skelettmuskulaturen härrör vävnad inom intakt organismen av musen. Modellen är tillämplig på alla forskningsområden som fokuserar på granulocyteaktivering och deras roll i sjukdom.
Vi tillhandahåller ett steg för steg protokoll för att guida genom metoden och för att belysa potentiella fallgropar och tekniska svårigheter. Protokollet omfattar följande aspekter: experimentella inställningar och nödvändigt material, anestesi av musen, dissekering av cremaster muskel samt trakeal och halspulsådern cannulation, IVM inspelningar och offline analys. Dataformat som vidhäftande leukocyter, rullande flöde (RF) och rullande fluxfraktion (RFF) förklaras i detalj och lämpliga tillämpningar diskuteras. Representativa resultat från dystrofiin bristfälliga mdx möss finns i resultatavsnittet.
IVM är ett kraftfullt verktyg för att bedöma leukocyte rekrytering i en in vivo inställning; Men delineating till exempel endotel och leukocyte funktion kan kräva en kombination med ex vivo inställningar som flöde kammare experiment. Dessutom kan den genetiska bakgrunden hos djur av intresse i hög grad påverka grundläggande rekrytering, vilket kräver individuell finjustering av det protokoll som tillhandahålls. Trots sina begränsningar kan IVM fungera som en plattform för att lätt översätta in vitro-fynd till en levande ryggradsdjur organism.

IVM enligt det angivna protokollet kommer att ge unika insikter i kaskaden av leukocyte rekrytering i skelettmuskulaturen. Resultatavsnittet kommer att fokusera på typiska resultat som erhållits av IVM och belysa potentiella problem som kan uppstå.
Den experimentella installationen för intravitalmikroskopi beskrivs i figur 1. Beredning av cremaster muskeln och avlägsnande av bindväv är avgörande för att få fokuserade mikroskopiska bilder med en enhetlig ...

Watch this Scientific Journal Video about Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy at JoVE.com

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Här visar vi hur man utför intravital mikroskopi på post-kapillär venules av musen cremaster muskel. Vanligen tillämpas på olika modeller av inflammation och sepsis, särskilt de som induceras av kemokines och cytokiner, vi belysa dess relevans i studien av muscolopathies med överdrivna muskulös leukocyte infiltration.

Leukocyte infiltration av Cremaster Muscle hos möss bedöms av intravital mikroskopi

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Denna praktiska och reproducerbara metod kan användas för att visualisera de endotelin leukocyte interaktioner som leder till leukocyte rekrytering inom en intakt mus. Denna teknik presenterar också ett kraftfullt verktyg för övervakning av fysiologiska och patofysiologiska processer inom leukocyte rekrytering kaskad in vivo. Metoden kan appliceras i olika inflammatoriska och septiska modeller.Till exempel har vi nyligen belyst dess relevans i studien av muskuloskepapatier som involverar överdriven muskulös leukocyte infiltration. Vårt förslag till andra forskare som överväger att använda denna teknik är att få så mycket praktisk erfarenhet som möjligt eftersom metoden är mycket mottagliga för mindre avvikelser. Demonstrerar proceduren blir Simon Kranig, kliniker och senior forskare från mitt labb.Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa i den sövda försöksdjur, fixa musen i en ryggrecumbent position på en 37 grader Celsius värmedyna och använda en nonabsorbable steril 6-0 sutur att vind en enkel slinga runt frontaltänderna. Tejpa ihop suturens sammanfognings ändar på värmedynan och använd pincett för att försiktigt lyfta huden vid mittlinjen. Därefter gör en cirkulär en till två centimeter diameter snitt över halsen och övre bröstkorgen och använda pincett för att noggrant dissekera den omgivande muskeln, fett, och bindväv.Placera en sutur under luftstrupen. Använd små kirurgiska saxar för att göra en cirka 1,3 millimeter tvärgående skuren i luftstrupen och införa en polyeten röret i caudal slutet av luftstrupen för att säkra de övre luftvägarna. Fixera röret som ligger med en enda cirkulär knut sutur och lokalisera halspulsådern längs den högra sidan av luftstrupen.Dissekera den omgivande vävnaden från halspulsådern väggen och passera två bitar av sutur under artären. Tie första kranial sutur proximala till bifurkation av halspulsådern och placera den andra suturen cirka fem till åtta millimeter distala från den första suturen utan att binda. Därefter fäster du en 30 centimeter bit polyetenrör till en milliliter spruta nål fylld med saltlösning och använd en sju millimeter kärlet klämma för att klämma karotid artär distally till den andra suturen.Gör en ungefär 0,5 millimeter tvärskuren i halspulsådern och införa den sterila polyeten röret i artären. Säkra röret med den andra suturen och ta bort kärletsklämma. Tryck sedan försiktigt ned sprutkolven för att spola in saltlösning i kärlet.För att förbereda cremaster muskeln, överföra musen till en skräddarsydd plast mikroskop ram med pungen mot mikroskopet scenen och försiktigt ta tag i pungen på sin mest distala änden med pincett. Dra pungen försiktigt, ta bort en cirkulär cirka fem millimeter diameter avsnitt av scrotal huden hålla den öppna vävnaden väl hydrerad med saltlösning. Använd två pincett för att dissekera den lösa bindväven och lokalisera båda testikorna.Ta tag i ett testis distally och försiktigt börja dra ut den reproduktiva vävnaden ta bort eventuella omgivande bindväv steg för steg. När testis har exteriorized, stift den distala änden av vävnaden till gummi ringen som omger scenen och hydrat vävnaden med saltlösning. Därefter försiktigt bort bindväven utan att skada den underliggande cremaster muskeln.Det är viktigt att ta bort all bindväv som skulle resultera i suddiga bilder utan att skada den underliggande cremaster muskeln. När all vävnad har tagits bort, gör en en millimeter tvärgående snitt för att öppna cremaster muskeln innan du gör en längsgående snitt från mycket distala till den proximala änden av vävnaden. Muskeln ska öppna sfäriskt.Försiktigt sprida muskeln över glaset scenen och stift muskeln till gummiringen noga med att inte röra eller skada den centrala regionen av vävnaden. Fäst sedan de återstående testis till sidan för att ge tillgång till regionen av intresse och hydrat vävnaden med PSS. För intravital visualisering av muskeln vasculature, placera monterade cremaster muskeln i upprätt mikroskop och välj 40X objektiv.Utför inspelningarna under kontinuerlig superfusion med 35 till 37 grader Celsius PSS genom en bit av små slangar som har tejpats till det upprättstående målet för mikroskopet att möjliggöra kontinuerlig droppande av PSS tillsammans med målet ner på muskel och vävnad. Identifiera post-kapillären venules. Mät mikrocirkulationen på venules med en 20 till 40 mikrometer diameter.Sedan spela in högupplösta bilder av mikrocirkulationen från cremaster muskeln under en 30-sekunders period kontinuerligt justera fokus på grund av små förändringar i sammandragning och avkoppling av muskelvävnaden. Överflödig bindväv kan leda till suddiga mikroskopiska bilder. I denna representativa mikroskopiska bild kan de efter kapillärer venules som bör vara mellan 20 till 40 mikrometer i diameter identifieras genom sammanflödet av två mindre kärl.Vidhäftande och rullande leukocyter kan visualiseras medan cirkulerande leukocyter får endast spåras i slow motion repris av inspelade videor. En mängd parametrar kan påverka leukocyte rekrytering in vivo inklusive hjärt-utgång, fartyget diameter, centerline hastighet, vägg skjuvning takt och antal cirkulerande leukocyter. Observera att mittlinjen hastigheten påverkas av hjärtminutvolym, perifera vaskulära motstånd och intravasal volym.Till exempel ökar en stor volym Rhodamin eller annat experimentellt ämne som ges via halspulsådern katetern post-kapillär mittlinjehastighet och hämmar leukocytfångst och rullning. Tvärtom, hjärtsvikt, djup anestesi, eller hypotermi kan minska post-kapillärflödet. För att bestämma mittlinjen hastigheten, fritt cirkulerande fluorescerande leukocyter kan användas eller leukocyterna måste färgas med fluorescerande reagenser som Rhodamine.Observera att vildtypsstammar kan visa fysiologisk varians. Till exempel, C57BL/6 möss visar tydligt förbättrad leukocyt rullande, vidhäftning, och transmigration jämfört med C57BL/10ScSn djur. Planerings- och standardiseringsstadier är viktiga för att behärska tekniken speciellt under beredningen av cremastermuskeln för mikroskopi.Andra metoder för visualisering leukocyte rekrytering kan genomföras för att ge ytterligare information och för att hjälpa dissekera enskilda bidrag leukocyter och endotelceller till rekrytering kaskad. Denna teknik ger en plattform för den prekliniska utvärderingen av farmakologiska meditatörer och nya immun modulatory ämnen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Icke-invasiv avbildning av Leukocyt Homing och migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Intravital mikroskopi av inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Spårning neutrofila intraluminal Krypande, Transendothelial migration och kemotaxi i vävnad genom Intravital Video Mikroskopi

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av mjälte: Kvantitativ analys av Parasit Rörlighet och blodflöde

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Mycket Lösta Intravital Randig-belysning Mikroskopi germinalcenter

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Långsiktig Intravital multifoton Mikroskopi Imaging av immunceller i friska och sjuka Lever Använda CXCR6.Gfp Reporter Möss

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital mikroskopi av leukocyt-endotel och Platelet-leukocyter Interaktioner i Mesenterial Veins hos möss

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrofiler och Monocyter i Mesenteric Veins av Intravital Mikroskopi på sövda möss i realtid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualisera leukocyt rullande och vidhäftning i Angiotensin II-infusion möss: tekniker och fallgropar

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...