Name: evaluation of cerebral blood flow autoregulation in the rat using laser doppler flowmetry
Uploaded: 2020-01-19T15:00:00
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Die Autoren bedanken sich aufrichtig bei Kaleigh Kozak, Megan Stumpf und Jack Bullis für ihre hervorragende Unterstützung bei der Fertigstellung dieser Studie und der Vorbereitung des Manuskripts. Grant-Unterstützung: NIH #R01-HL128242, #R21-OD018309 und #R21-OD024781.

Das Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigte alle in diesem Papier beschriebenen Protokolle, und alle Verfahren entsprechen dem National Institutes of Health (NIH) Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) Vorschriften.
1. Versuchstiere und Aufnahmevorbereitung
<ol><li>Verwenden Sie 8-12 Wochen alte männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 250–300 g. Für diese Experimente füttern Ratten eine Standarddiät bestehend aus 0,4...

Auswertung von Gewebe-Blutflussreaktionen mit Laser Doppler-Flowmetrie (LDF). Wie oben erwähnt, ist das LDF-Signal proportional zur Anzahl und Geschwindigkeit der sich bewegenden Teilchen, in diesem Fall RBC, in der Mikrozirkulation. LDF-Messungen in verschiedenen Organen korrelieren gut mit dem Vollorgan-Blutfluss, der mit etablierten Methoden wie elektromagnetischen Durchflussmessern und radioaktiven Mikrosphären30 bewertet wird, und stimmen im Allgemeinen mit Studien überein...

Autoregulatorische Mechanismen in der zerebralen Zirkulation spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der normalen Funktion im Gehirn. Die Autoregulation des zerebralen Blutflusses wird durch mehrere Faktoren beeinflusst, einschließlich Herzfrequenz, Blutgeschwindigkeit, Perfusionsdruck, Durchmesser der Hirnwiderstandsarterien und der Mikrozirkulationsresistenz, die alle eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der gesamten zerebralen Blutflusskonstante im Gehirn über den physiologischen Bereich des systemischen Blutdrucks spielen. Wenn der arterielle Druck zunimmt, verengen diese Mechanismen Arteriolen und Widerstandsarterien, um gefährliche Erhöhungen des intrakraniellen Drucks zu verhindern. Wenn der arterielle Blutdruck abnimmt, werden die Arteriolen durch lokale Kontrollmechanismen zur Aufrechterhaltung der Gewebeperfusion und o2-Abgabe dedukumen. Verschiedene pathologische Erkrankungen wie Hyperkapnie, traumatische oder globale hypoxische Hirnverletzungen und diabetische Mikroangiopathie1,2,3,4,5,6 können die Fähigkeit des Gehirns stören, seinen Blutfluss autoregulieren. Zum Beispiel verschiebt chronische Hypertonie den effektiven Autoregulierungsbereich in Richtung höherer Drücke7,8,9, und eine hohe Salzdiät (HS) stört nicht nur die normale Endothel-abhängige Dilatation in der zerebralen Mikrozirkulation10, sondern beeinträchtigt auch die Fähigkeit der autoregulatorischen Mechanismen in der zerebralen Zirkulation, die Gewebedurchblutung zu erweitern und aufrechtzuerhalten, wenn der arterielle Druck reduziert wird11. Die zerebrale Autoregulation ist auch bei Salzempfindlichen Ratten in Dahl beeinträchtigt, wenn sie mit einer HS-Diät gefüttert werden12.
Bei der Verringerung des arteriellen Drucks gibt die Dilatation der Hirnwiderstandsarterien und Arteriolen zunächst den zerebralen Blutfluss zurück, um die Werte trotz des reduzierten Durchblutungsdrucks zu kontrollieren. Da der arterielle Druck weiter reduziert wird, bleibt der zerebrale Blutfluss im unteren Druck konstant (Plateauphase der autoregulierenden Reaktion), bis die Gefäße nicht mehr erweitern können, um den Blutfluss im unteren Druck aufrechtzuerhalten. Der niedrigste Druck, bei dem ein Organ den normalen Blutfluss aufrechterhalten kann, wird als untere Grenze der Autoregulation (LLA) bezeichnet. Bei Drücken unterhalb der LLA nimmt der zerebrale Blutfluss signifikant ab von ruhewerten und nimmt linear mit jeder Verringerung des arteriellen Perfusionsdrucks13,14ab. Eine Aufwärtsverschiebung in der LLA, wie bei Bluthochdruck7,8,9beobachtet, kann das Risiko und die Schwere der ischämischen Verletzung unter Bedingungen erhöhen, in denen der arterielle Perfusionsdruck reduziert wird (z. B. Myokardinfarkt, ischämischer Schlaganfall oder Kreislaufschock).
LDF hat sich als äußerst wertvoller Ansatz zur Bewertung des Blutflusses in der Mikrozirkulation unter einer Vielzahl von Umständen erwiesen, einschließlich der Autoregulation des Blutflusses im Zerebralparesekreislauf11,14,15. Zusätzlich zur Bewertung autoregulierender Reaktionen kann LDF verwendet werden, um den kortikalen Blutfluss bei der Untersuchung metabolischer, myogener, endothelialer, humoraler oder neuronaler Mechanismen zu überwachen, die den zerebralen Blutfluss und die Auswirkungen verschiedener experimenteller Eingriffe und pathologischer Bedingungen auf den zerebralen Blutfluss10,16,17,18,19,20,21regulieren.
LDF misst die Verschiebung des reflektierten Laserlichts als Reaktion auf die Anzahl und Geschwindigkeit sich bewegender Teilchen - in diesem Fall rote Blutkörperchen (RBC). Für Studien zur zerebralen vaskulären Autoregulation wird der arterielle Blutdruck entweder durch die Infusion eines alpha-adrenergen Agonisten verändert, um den arteriellen Druck zu erhöhen (weil die zerebrale Zirkulation selbst unempfindlich gegenüber alpha-adrenergen Vasokonstriktoragonisten ist)12,15 oder durch kontrollierte Blutvolumenentnahme zur Verringerung des arteriellen Drucks11,14. In der vorliegenden Studie wird LDF verwendet, um die Auswirkungen von abgestuften Senkungen des Blutdrucks auf die zerebrale Autoregulation bei einer gesunden Ratte zu demonstrieren. Obwohl offene und geschlossene Schädelmethoden in der Literatur22,23,24,25beschrieben wurden, zeigt das vorliegende Papier eine geschlossene Schädelpräparation, die es ermöglicht, den zerebralen Blutfluss zu bewerten, ohne in den Schädel einzudringen oder eine Kammer oder ein Hirnfenster zu installieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-0 braided black silk suture</td>
			<td>Midwest Vet</td>
			<td>193.73000.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arterial Pressure Transducer</td>
			<td>Merit Medical</td>
			<td>041516504A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Data Acquisition Systems (WINDAQ &#38; BIOPAC system)</td>
			<td>DATAQ Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pressure Display Unit</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating warm water pump</td>
			<td>Gaymar Industries</td>
			<td>T-pump</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End-tidal CO2 monitor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>Capstar-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Midwest Vet</td>
			<td>191.46720.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Flow Meter</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PeriFlux 5000 LDPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Refill Motility Standard</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE240) (for trachea cannula)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63018-828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE50) (for femoral catheters)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Ventilator</td>
			<td>Cwe/Stoelting</td>
			<td>SAR-830/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Midwest Vet</td>
			<td>193.74504.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley Outbred Rats</td>
			<td>Variable</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rats were ordered from various companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Rat Chow</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Cwe/Stoelting</td>
			<td>Clasic Lab Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cerebral blood flow autoregulation in the rat using laser doppler flowmetry

Bei der Untersuchung der mechanismen des Körpers zur Regulierung des zerebralen Blutflusses kann eine relative Messung des mikrozirkulierenden Blutflusses mit Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF) erreicht werden. Dieses Papier zeigt eine geschlossene Schädelpräparation, die es ermöglicht, den zerebralen Blutfluss zu beurteilen, ohne in den Schädel einzudringen oder eine Kammer oder ein Zerebralpeinzusungsfenster zu installieren. Zur Bewertung der autoregulatorischen Mechanismen kann ein Modell der kontrollierten Blutdrucksenkung durch abgestufte Blutungen verwendet werden, während gleichzeitig LDF eingesetzt wird. Dies ermöglicht die Echtzeit-Tracking der relativen Veränderungen des Blutflusses als Reaktion auf die Verringerung des arteriellen Blutdrucks durch die Entnahme des zirkulierenden Blutvolumens erzeugt. Dieses Paradigma ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung der autoregulation des zerebralen Blutflusses bei der Senkung des arteriellen Blutdrucks und ist mit geringfügigen Änderungen im Protokoll auch als experimentelles Modell des hämorrhagischen Schocks wertvoll. Zusätzlich zur Bewertung autoregulierender Reaktionen kann LDF verwendet werden, um den kortikalen Blutfluss zu überwachen, wenn metabolische, myogene, endotheliale, humorale oder neuronale Mechanismen untersucht werden, die den zerebralen Blutfluss und die Auswirkungen verschiedener experimenteller Interventionen und pathologische Bedingungen bei der zerebralen Durchblutung.

Abbildung 2 fasst die Ergebnisse von Experimenten zusammen, die an 10 männlichen Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt wurden, die standardlaborierte Chow gefüttert wurden. In diesen Experimenten wurde der mittlere LCBF nach den ersten drei Blutvolumenentnahmen innerhalb von 20 % des Prämorhage-Wertes gehalten, bis der mittlere arterielle Druck die LLA erreichte. Nachfolgende Blutvolumenentnahmen bei Drücken unterhalb der LLA führten zu einer progressiven Reduktion von LCBF, was zeigte, d...

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Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Dieser Artikel zeigt die Verwendung von Laser-Doppler-Flowmetrie, um die Fähigkeit der zerebralen Zirkulation zu bewerten, ihren Blutfluss während der Senkung des arteriellen Blutdrucks autoregulieren.

Auswertung der zerebralen Blutfluss-Autoregulation in der Ratte mit Laser-Doppler-Flowmetrie

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Dieses Protokoll eignet sich ideal zur Bewertung der Fähigkeit der zerebralen Mikrozirkulation, den eigenen Blutfluss während der Blutdruckänderungen unter normalen und pathologischen Bedingungen zu regulieren. LDF bietet eine relativ nicht-invasive Methode zur kontinuierlichen Überwachung des zerebralen Blutflusses unter einer Vielzahl von Bedingungen, die mit anderen Methoden nicht möglich ist. Die Laser-Doppler-Flowmetrie kann zur nicht-invasiven Blutflussauswertung eingesetzt werden.Zum Beispiel, um die Auswirkungen einer hohen Salzdiät auf die eingeschränkte Durchblutungsregulation bei gesunden jungen Frauen zu bewerten. LDF ermöglicht die einfache Überwachung des Blutflusses in vielen verschiedenen Gefäßbetten von Mensch und Tier und kann in einer Vielzahl von Studien verwendet werden. Das Verfahren mit Adrienne Allen demonstriert Megan Stumpf, meine Forschungstechnologin und Laborleiterin.Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, legen Sie die Ratte auf eine zirkulierende Wasserdecke, die bei 37 Grad Celsius gehalten wird, und bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Pedalreflex eingeste Versuchsratte. Tragen Sie Salbe auf die Augen der Tiere auf und rasieren Sie die Oberseite des Schädels, ventralen Halsbereich und Femoral Dreiecke. Entfernen Sie alle verlorenen Haare von der exponierten Haut.Und desinfizieren Sie die Haut mit Reiben Alkohol. Bewegen Sie die Ratte auf ein Heizkissen mit einer zirkulierenden Warmwasserpumpe. Und verwenden Sie medizinisches Klebeband, um die Ratte vorübergehend in der Supine-Position zu sichern.Füllen Sie zwei PE 50 Kanülen mit einer Einheit pro ml Heparin in isotonischer Natriumchloridlösung. Und das offene Ende der Katheter mit einer chirurgischen Schere abschrägen, um das Einführen in die Arterien zu erleichtern. Nachdem Sie die Oberschenkelarterien unter einem Sezierendes Mikroskop sorgfältig vom umgebenden Gewebe getrennt haben, legen Sie das distale Ende des isolierten Femoralarteriensegments auf und legen Sie zwei zusätzliche Nähte um die mittleren und proximalen Enden der Arterie, ohne die Knoten zu straffen.Legen Sie einen V-förmigen Draht aus einer Büroklammer unter der Arterie ein, um das Gefäß zu verschließen, bis die Kanüle gesichert ist. Dann verwenden Sie Vannas Schere, um einen kleinen Schnitt in der Oberschenkelarterie in der Nähe der distalen Ligation zu machen. Setzen Sie das abgeschrägte Ende der Kanüle in den Schnitt ein und bringen Sie die Kanüle in die Oberschenkelarterie.Entfernen Sie die Büroklammer. Ziehen Sie den Knoten in der mittleren Ligatur über der Kanüle, um die Kanüle an Ort und Stelle zu sichern. Lösen Sie die Spannung auf der Hebeligatur, dann ziehen Sie die proximale Ligatur und schließen Sie den Schnitt.Unmittelbar nachdem die Kanülen an Ort und Stelle sind, stellen Sie das Tier in eine sternale Position. Und sichern Sie den Kopf in einem stereotaxic Gerät, das darauf achtet, die Katheter nicht zu lösen. Machen Sie einen elliptischen Schnitt in der Haut, der den Schädel bedeckt.Und verwenden Sie einen Wattestäbchen, um jegliches Bindegewebe zu entfernen, um sicherzustellen, dass der Schädel sauber und trocken ist. Legen Sie ein kleines, gerolltes, längliches Stück Tissuepapier um den Schnitt auf der Kopfhaut, um Blutungen zu stoppen, und verwenden Sie unter dem Sezieren des Mikroskops einen entsprechend großen Bohrer mit einem 2,15 mm Bohrer, um einen 0,5 bis 1 cm großen Knochenbereich im parietalen Bereich über dem linken oder rechten somatosensorischen Kortex zu verdünnen, je nach Größe der Ratte. Dünnen Sie den Knochen langsam und vorsichtig, um ein Eindringen in den Schädel zu vermeiden.Während dieses Schritts sollte die saline Lösung großzügig angewendet werden, um eine Überhitzung des Bereichs zu verhindern. Wenn der Bereich ein rosa Aussehen hat und/oder Blutgefäße visualisiert werden können, bedecken Sie den ausgedünnten Knochen mit Mineralöl. Und verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Laserdopplersonde über der exponierten zerebralen Mikrozirkulation zu positionieren, so dass die Spitze der Sonde nur die Spitze des Mineralölpools berührt.Bei der ersten Sondenplatzierung ist es am besten, mit einem Signal von ca. 150 Einheiten zu beginnen, um sicherzustellen, dass die Sonde über der Mikrozirkulation positioniert ist. Wenn die Laser-Doppler-Flowmetriesonde an Ort und Stelle ist, lassen Sie das Tier für eine 30- bis 45-minütige Equilibritionszeit ruhen, bevor Sie 1,5 ml Blut über einen Zeitraum von 30 Sekunden aus der entsprechenden Femoralarterienkanüle abziehen. Um das Katheterpatent zu behalten, gießen Sie 100 Einheiten pro ml Heparin in isotonischer Saline nach jeder Blutentnahme in die Kanüle ein.Lassen Sie die Ratte für zwei Minuten erholen und messen Sie dann LDF und Blutdruck alle 30 Sekunden für zwei Minuten. Wiederholen Sie nach den Blutdruck- und LDF-Messungen alle zwei Minuten den Blutvolumenentzug, bis das Tier einen mittleren arteriellen Druck von ca. 20mmHg erreicht. In diesen repräsentativen Experimenten wurde der mittlere zerebrale Laserblutfluss von 10 Sprague-Dawley-Ratten, die mit Standardlabor-Chow gefüttert wurden, innerhalb von 20 % des Vorblutungswertes nach den ersten drei Blutvolumenentnahmen beibehalten, bis der mittlere arterielle Druck die untere Grenze der Autoregulation erreichte.Nachfolgende Blutvolumenentnahmen bei Drücken unterhalb der unteren Grenze der Autoregulation führten zu einer fortschreitenden Verringerung des zerebralen Laserdurchflusses, der zeigte, dass die zerebrale Zirkulation nicht mehr in der Lage war, ein ausreichendes Gehalt an Vasodilatation zu erzeugen, um den zerebralen Blutfluss konstant bei den niedrigeren Profusionsdrücken zu halten. Bei Drücken an oder über der unteren Grenze der Autoregulation gab es keine signifikante Korrelation zwischen dem zerebralen Laserblutfluss und dem arteriellen Druck, was darauf hindeutet, dass der zerebrale Laserdurchfluss unabhängig vom arteriellen Druck im Plateaubereich der autoregulierenden Kurve war. Unterhalb der unteren Grenze der Autoregulation hatte die laserzerebrale Blutfluss arterielle Druckbeziehung eine negative Neigung.Und der laserzerebrale Blutfluss war signifikant mit dem arteriellen Druck korreliert. Die wichtigsten Dinge, die Sie sich merken sollten, sind, den Schädel sehr sorgfältig auszudünnen und sicherzustellen, dass die LDF-Sonde fest über dem gleichen Gewebebereich verankert bleibt. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Reaktivität der Mikrozirkulation verschiedener Wirkstoffe nach retrograder Infusion über die Halsschlagader zu testen oder funktionelle Hyperämie und neurovaskuläre Kopplung in der zerebralen Zirkulation zu bewerten.Diese Technik hat die Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Medikamente und Anästhetika auf die zerebrale Durchblutung und die Veränderungen der zerebralen Autoregulation in Krankheitsmodellen wie Bluthochdruck ermöglicht.

Research

JoVE Journal

Medicine

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Intraluminale Nahen Zerebralarterie (MCAO) Modell des ischämischen Schlaganfalls mit Laser-Doppler-Flussmessung Guidance in Mäuse

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

Forschung

Medizin

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MRI-geführten Störung der Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe der transkraniellen fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Endothelin-1 induzierte Middle Cerebral Artery Occlusion Modell für ischämischen Schlaganfall mit Laser Doppler Flowmetrie Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Optimierte System for Cerebral Perfusion Überwachung im Rat Stroke Modell Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

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