Name: evaluation of cerebral blood flow autoregulation in the rat using laser doppler flowmetry
Uploaded: 2020-01-19T15:00:00
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Gli autori esprimono il loro sincero ringraziamento a Kaleigh Kozak, Megan Stumpf e Jack Bullis per la loro eccezionale assistenza nel completare questo studio e preparare il manoscritto. Supporto: NIH #R01-HL128242, #R21-OD018309 e #R21-OD024781.

Il Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ha approvato tutti i protocolli descritti in questo documento e tutte le procedure sono in conformità con il National Institutes of Health (NIH) Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) Regolamenti.
1. Animali sperimentali e preparazione per la registrazione
<ol><li>Usa i ratti Sprague-Dawley di 8-12 settimane del peso di 250-300 g. Per questi esperimenti, nutrire i ratti una dieta standard composta da 0,4...

Valutazione delle risposte del flusso sanguigno dei tessuti con Laser Doppler Flowmetry (LDF). Come notato in precedenza, il segnale LDF è proporzionale al numero e alla velocità delle particelle in movimento, in questo caso RBC, nella microcircolazione. Le letture LDF in diversi organi sono ben correlate al flusso sanguigno dell'intero organo valutato con metodi stabiliti come i misuratori di flusso elettromagnetico e le microsfere radioattive30 e sono generalmente coerenti con...

I meccanismi autoregolanti nella circolazione cerebrale svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi e della normale funzione cerebrale. L'autoregolazione del flusso sanguigno cerebrale è influenzata da molteplici fattori tra cui la frequenza cardiaca, la velocità del sangue, la pressione di perfusione, il diametro delle arterie di resistenza cerebrale e la resistenza microcircolatoria, che svolgono un ruolo nel mantenere costante il flusso sanguigno cerebrale totale nel cervello sulla gamma fisiologica delle pressioni sistemiche. Quando aumenta la pressione arteriosa, questi meccanismi restringono arteriole e arterie di resistenza per prevenire aumenti pericolosi nella pressione intracranica. Quando la pressione sanguigna arteriosa diminuisce, i meccanismi di controllo locali dilatano le arteriole per mantenere la perfusione dei tessuti e la consegna di O2. Varie condizioni patologiche come l'ipercapnia, la lesione cerebrale ipossica traumatica o globale e la microangiopatia diabetica1,2,3,4,5,6 possono interrompere la capacità del cervello di autoregolarne il suo flusso sanguigno. Ad esempio, l'ipertensione cronica sposta l'effettiva gamma di autoregolazione verso pressioni più elevate7,8,9e una dieta ad alto sale (HS) non solo interferisce con la normale dilatazione dipendente dall'endotelio nella microcircolazione cerebrale10, ma compromette anche la capacità dei meccanismi di autoregolamentazione nella circolazione cerebrale di dilatare e mantenere la perfusione dei tessuti quando la pressione arteriosa è ridotta di11. L'autoregolazione cerebrale è compromessa anche nei ratti sensibili al sale Dahl quando vengono alimentati con una dieta HS12.
Durante la riduzione della pressione arteriosa, la dilatazione delle arterie di resistenza cerebrale e arteriole ritorna inizialmente il flusso sanguigno cerebrale ai valori di controllo nonostante la ridotta pressione di perfusione. Man mano che la pressione arteriosa si riduce ulteriormente, il flusso sanguigno cerebrale rimane costante alla pressione inferiore (fase plateau della risposta autoregolatoria) fino a quando la vascolatura non può più dilatare per mantenere il flusso sanguigno alla pressione più bassa. La pressione più bassa alla quale un organo può mantenere il flusso sanguigno normale è definita il limite inferiore dell'autoregolazione (LLA). A pressioni inferiori al LLA, il flusso sanguigno cerebrale diminuisce in modo significativo dai valori di riposo e diminuisce in modo lineare con ogni riduzione della pressione arteriosaperfusione 13,14. Uno spostamento verso l'alto nel LLA, come osservato nell'ipertensione7,8,9, può aumentare il rischio e la gravità della lesione ischemica in condizioni in cui la pressione perlano arteriosa è ridotta (ad esempio, infarto miocardico, ictus ischemico o shock circolatorio).
LDF ha dimostrato di essere un approccio estremamente prezioso per valutare il flusso sanguigno nella microcircolazione in una varietà di circostanze, tra cui l'autoregolazione del flusso sanguigno nella circolazione cerebrale11,14,15. Oltre a valutare le risposte autoregolatorie, LDF può essere utilizzato per monitorare il flusso sanguigno corticale quando si studia meccanismi metabolici, miogenici, endoteliali, umorali o neurali che regolano il flusso sanguigno e l'impatto di vari interventi sperimentali e condizioni patologiche sul flusso sanguigno cerebrale10,16,17,18,19,20,21.
LDF misura lo spostamento della luce laser riflessa in risposta al numero e alla velocità delle particelle in movimento, in questo caso i globuli rossi (RBC). Per gli studi di autoregolazione vascolare cerebrale, la pressione arteriosa viene modificata dall'infusione di un agonista alfa-avverso per aumentare la pressione arteriosa (perché la circolazione cerebrale stessa è insensibile agli agonisti vasoconstrictor alfa-sensibili)12,15 o tramite ritiro controllato del volume sanguigno per ridurre la pressione arteriosa11,14. Nel presente studio, LDF è utilizzato per dimostrare gli effetti della riduzione graduata della pressione sanguigna sull'autoregolazione cerebrale in un ratto sano. Sebbene i metodi del cranio aperto e chiuso siano stati descritti nella letteratura22,23,24,25, il presente documento dimostra una preparazione del cranio chiusa, consentendo di valutare il flusso sanguigno cerebrale senza penetrare il cranio o installare una camera o una finestra cerebrale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-0 braided black silk suture</td>
			<td>Midwest Vet</td>
			<td>193.73000.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arterial Pressure Transducer</td>
			<td>Merit Medical</td>
			<td>041516504A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Data Acquisition Systems (WINDAQ &#38; BIOPAC system)</td>
			<td>DATAQ Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pressure Display Unit</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating warm water pump</td>
			<td>Gaymar Industries</td>
			<td>T-pump</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End-tidal CO2 monitor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>Capstar-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Midwest Vet</td>
			<td>191.46720.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Flow Meter</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PeriFlux 5000 LDPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Refill Motility Standard</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE240) (for trachea cannula)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63018-828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE50) (for femoral catheters)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Ventilator</td>
			<td>Cwe/Stoelting</td>
			<td>SAR-830/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Midwest Vet</td>
			<td>193.74504.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley Outbred Rats</td>
			<td>Variable</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rats were ordered from various companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Rat Chow</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Cwe/Stoelting</td>
			<td>Clasic Lab Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cerebral blood flow autoregulation in the rat using laser doppler flowmetry

Quando si studiano i meccanismi del corpo per regolare il flusso sanguigno cerebrale, è possibile ottenere una misurazione relativa del flusso sanguigno microcircolatorio utilizzando la flowmetria Doppler laser (LDF). Questo documento dimostra una preparazione del cranio chiusa che consente di valutare il flusso sanguigno cerebrale senza penetrare il cranio o installare una camera o una finestra cerebrale. Per valutare i meccanismi di autoregolamentazione, un modello di riduzione controllata della pressione sanguigna tramite emorragia graduata può essere utilizzato mentre allo stesso tempo impiega l'LDF. Ciò consente il monitoraggio in tempo reale dei cambiamenti relativi nel flusso sanguigno in risposta a riduzioni della pressione arteriosa prodotta dal ritiro del volume sanguigno circolante. Questo paradigma è un valido approccio per studiare l'autoregolazione del flusso sanguigno cerebrale durante la riduzione della pressione sanguigna arteriosa e, con piccole modifiche nel protocollo, è anche prezioso come modello sperimentale di shock emorragico. Oltre a valutare le risposte autoregolatorie, LDF può essere utilizzato per monitorare il flusso sanguigno corticale durante lo studio dei meccanismi metabolici, miogenici, endoteliali, umorali o neurali che regolano il flusso sanguigno cerebrale e l'impatto di vari meccanismi sperimentali interventi e condizioni patologiche sul flusso sanguigno cerebrale.

La figura 2 riassume i risultati degli esperimenti condotti in 10 ratti Maschi Sprague-Dawley alimentati con chow di laboratorio standard. In tali esperimenti, media LCBF è stato mantenuto entro il 20% del valore di emorragia dopo i primi tre prelievi del volume di sangue, fino a quando la pressione arteriosa media ha raggiunto il LLA. I successivi prelievi di volume sanguigno a pressioni al di sotto del LLA hanno causato una progressiva riduzione di LCBF, dimostrando che la circolazione ce...

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Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Questo articolo dimostra l'uso di flussometria Doppler laser per valutare la capacità della circolazione cerebrale di autoregolare il suo flusso sanguigno durante la riduzione della pressione arteriosa.

Valutazione dell'autoregolazione del flusso sanguigno cerebrale nel ratto utilizzando Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Questo protocollo è ideale per valutare la capacità del microcircolo cerebrale di regolare il proprio flusso sanguigno durante i cambiamenti della pressione sanguigna in condizioni normali e patologiche. LDF fornisce un metodo relativamente non invasivo per il monitoraggio continuo del flusso sanguigno cerebrale in una varietà di condizioni che non è possibile con altri metodi. La flowmetria Laser Doppler può essere utilizzata per la valutazione non invasiva del flusso sanguigno.Ad esempio, per valutare gli effetti di una dieta ad alto contenuto di sale sulla regolazione del flusso sanguigno compromessa nelle giovani donne sane. LDF consente di monitorare facilmente il flusso sanguigno in molti letti vascolari diversi di esseri umani e animali e può essere utilizzato in un'ampia varietà di studi. A dimostrare la procedura con Adrienne Allen sarà Megan Stumpf, il mio tecnologo di ricerca e responsabile di laboratorio.Prima di iniziare la procedura, posizionare il ratto su una coperta d'acqua circolante mantenuta a 37 gradi Celsius e confermare una mancanza di risposta al riflesso del pedale in un ratto sperimentale anestetizzato. Applicare unguento agli occhi degli animali e radere la parte superiore del cranio, la zona del collo ventrale e i triangoli femorali. Rimuovere i capelli persi dalla pelle esposta.E disinfettare la pelle con l'alcol di sfregamento. Spostare il topo su una pastiglia riscaldante con una pompa di acqua calda circolante. E utilizzare del nastro medico per fissare temporaneamente il topo in posizione supina.Riempire due cannule PE 50 con un'unità per mL di eparina in soluzione isotonica di cloruro di sodio. E smussare l'estremità aperta dei cateteri con forbici chirurgiche per facilitare l'inserimento nelle arterie. Dopo aver accuratamente separato le arterie femorali dal tessuto circostante sotto un microscopio sezionante, legare l'estremità distale del segmento dell'arteria femorale isolata e posizionare due suture aggiuntive intorno alle estremità centrali e prossimali dell'arteria senza stringere i nodi.Inserire un filo a forma di V modellato da una graffetta sotto l'arteria per occluderlo fino a quando la cannula non è stata fissata. Quindi usa le forbici vannas per fare una piccola incisione nell'arteria femorale vicino alla legatura distale. Inserire l'estremità smussata della cannula nell'incisione e far avanzare la cannula nell'arteria femorale.Rimuovere la graffetta. Stringere il nodo nella legatura centrale sopra la cannula per fissare la cannula in posizione. Rilasciare la tensione sulla legatura di sollevamento, quindi stringere la legatura prossimale e chiudere l'incisione.Immediatamente dopo che le cannule sono in posizione, posizionare l'animale in una posizione sternale. E fissare la testa in un dispositivo stereotassico facendo attenzione a non spodestare i cateteri. Fare un'incisione ellittica nella pelle che copre il cranio.E utilizzare un batuffolo di cotone per rimuovere qualsiasi tessuto connettivo, assicurando che il cranio sia pulito e asciutto. Posizionare un piccolo pezzo di carta velina allungato laminato intorno all'incisione sul cuoio capelluto per fermare qualsiasi sanguinamento e sotto il microscopio sezionato, utilizzare un trapano di dimensioni appropriato con una punta di perforazione da 2,15 mm per assottigliare un'area di osso da 0,5 a 1 cm nell'area parietale sulla corteccia somatosensoriale sinistra o destra, a seconda delle dimensioni del topo. Assottigliare l'osso lentamente e con attenzione per evitare di penetrare nel cranio.Durante l'esecuzione di questo passaggio, la soluzione salina deve essere applicata liberamente per evitare che l'area si suscaldi. Quando l'area ha un aspetto rosa e / o i vasi sanguigni possono essere visualizzati, coprire l'osso assottigliato con olio minerale. E usate un micromanipolatore per posizionare la sonda laser doppler sul microcircolo cerebrale esposto in modo che la punta della sonda tocchi solo la parte superiore della piscina di olio minerale.Per il posizionamento iniziale della sonda, è meglio iniziare con un segnale di circa 150 unità per garantire che la sonda sia posizionata sulla microcircolazione. Quando la sonda di flusso doppler laser è in posizione, lasciare riposare l'animale per un periodo di equilibrità da 30 a 45 minuti prima di prelevare 1,5 mL di sangue dall'appropriata cannula dell'arteria femorale per un periodo di 30 secondi. Per mantenere il brevetto del catetere, infondere 100 unità per mL di eparina in salina isotonica nella cannula dopo ogni estrazione di sangue.Lasciare recuperare il ratto per due minuti e quindi misurare LDF e pressione sanguigna ogni 30 secondi per due minuti. Dopo le misurazioni della pressione sanguigna e della LDF, ripetere il prelievo del volume sanguigno ogni due minuti fino a quando l'animale raggiunge una pressione arteriosa media di circa 20 mmHg. In questi esperimenti rappresentativi, il flusso sanguigno cerebrale laser medio di 10 ratti Sprague-Dawley alimentati con chow di laboratorio standard è stato mantenuto entro il 20% del valore pre-emorragia dopo i primi tre prelievi di volume sanguigno, fino a quando la pressione arteriosa media ha raggiunto il limite inferiore di autogulation.I successivi prelievi di volume sanguigno a pressioni inferiori al limite inferiore dell'autoregolazione, causarono una progressiva riduzione del flusso sanguigno cerebrale laser dimostrando che la circolazione cerebrale non era più in grado di produrre un livello sufficiente di vasodilatazione per mantenere costante il flusso sanguigno cerebrale alle pressioni di profusione più basse. A pressioni pari o superiori al limite inferiore dell'autoregulation, non c'era alcuna correlazione significativa tra il flusso sanguigno cerebrale laser e la pressione arteriosa, indicando che il flusso sanguigno cerebrale laser era indipendente dalla pressione arteriosa nell'intervallo di plateau della curva autoregolatoria. Al di sotto del limite inferiore di autoregolazione, la relazione laser cerebrale della pressione arteriosa del flusso sanguigno aveva una pendenza negativa.E il flusso sanguigno cerebrale laser era significativamente correlato con la pressione arteriosa. Le cose più importanti da ricordare sono assottigliare il cranio con molta attenzione e assicurarsi che la sonda LDF rimanga saldamente ancorata sulla stessa area di tessuto. Questa procedura può essere utilizzata per testare la reattività del microcircolo di vari agenti dopo infusione retrograda attraverso l'arteria carotide, o per valutare l'iperemia funzionale e l'accoppiamento neurovascolare nella circolazione cerebrale.Questa tecnica ha permesso di investigare gli effetti di diversi farmaci e anestetici sulla circolazione cerebrale e i cambiamenti nell'autoregolazione cerebrale nei modelli di malattia come l'ipertensione.

Research

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Medicine

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Medicina

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Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

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Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

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