Name: evaluation of cerebral blood flow autoregulation in the rat using laser doppler flowmetry
Uploaded: 2020-01-19T15:00:00
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Os autores expressam seus sinceros agradecimentos a Kaleigh Kozak, Megan Stumpf e Jack Bullis por sua excelente assistência na conclusão deste estudo e na preparação do manuscrito. Apoio ao Subsídio: NIH #R01-HL128242, #R21-OD018309 e #R21-OD024781.

O Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aprovou todos os protocolos descritos neste artigo e todos os procedimentos estão em conformidade com o National Institutes of Health (NIH) Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) Regulamentos.
1. Animais experimentais e preparação para gravação
<ol><li>Use 8-12 semanas de idade, ratos Sprague-Dawley masculinos pesando 250-300 g. Para estes experimentos, alimentar ratos uma dieta padrão composta por 0...

Avaliação das respostas do fluxo sanguíneo de tecidos com flowmetria laser doppler (LDF). Como observado acima, o sinal LDF é proporcional ao número e velocidade das partículas em movimento, neste caso RBC, na microcirculação. As leituras de LDF em diferentes órgãos estão bem correlacionadas com o fluxo sanguíneo de órgãos inteiros avaliado por métodos estabelecidos, como medidores de fluxo eletromagnético e microesferas radioativas30 e são geralmente consistentes...

Os mecanismos de autoregulação na circulação cerebral desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase e da função normal no cérebro. A autoregulação do fluxo sanguíneo cerebral é afetada por múltiplos fatores, incluindo frequência cardíaca, velocidade arterial, pressão de perfusão, diâmetro das artérias de resistência cerebral e resistência microcirculatória, que desempenham um papel na manutenção da constante do fluxo sanguíneo cerebral total no cérebro sobre a faixa fisiológica das pressões sanguíneas sistêmicas. Quando a pressão arterial aumenta, esses mecanismos restringem as artérias e artérias de resistência para evitar aumentos perigosos na pressão intracraniana. Quando a pressão arterial diminui, os mecanismos de controle local dilatam as artérias para manter a perfusão do tecido e o parto O2. Várias condições patológicas, como hipercapnia, lesão cerebral hipóxica traumática ou global, e microangiopatia diabética1,2,3,4,5, 6podem perturbar a capacidade do cérebro de autoregular seu fluxo sanguíneo. Por exemplo, a hipertensão crônica desloca a faixa autoreguladora efetiva em direção a pressões mais altas7,8,9,e uma dieta de alto teor de sal (HS) não só interfere com a dilatação normal dependente do endotelio na microcirculação cerebral10,mas também prejudica a capacidade dos mecanismos autoreguladores na circulação cerebral de dilatar e manter a perfusão de tecidoquando a pressão arterial é reduzida11. A autoregulação cerebral também é prejudicada em ratos sensíveis ao sal de Dahl quando são alimentados com uma dieta HS12.
Durante as reduções na pressão arterial, a dilatação das artérias e arterioles da resistência cerebral retorna inicialmente o fluxo sanguíneo cerebral para controlar valores apesar da pressão reduzida da perfusão. Como a pressão arterial é reduzida ainda mais, o fluxo sanguíneo cerebral permanece constante na pressão mais baixa (fase de platô da resposta autoreguladora) até que a vasculatura não possa mais dilatar para manter o fluxo sanguíneo com pressão mais baixa. A menor pressão em que um órgão pode manter o fluxo sanguíneo normal é denominada o limite inferior da autoregulação (LLA). Em pressões abaixo do LLA, o fluxo sanguíneo cerebral diminui significativamente a partir de valores de repouso e diminui de forma linear com cada redução na pressão de perfusão arterial13,14. Uma mudança ascendente no LLA, como observado na hipertensão7,8,9,pode aumentar o risco e a gravidade da lesão isquêmica durante as condições em que a pressão de perfusão arterial é reduzida (por exemplo, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral isquêmico ou choque circulatório).
LDF provou ser uma abordagem extremamente valiosa para avaliar o fluxo sanguíneo na microcirculação uma variedade de circunstâncias, incluindo a autoregulação do fluxo sanguíneo na circulação cerebral11,14,15. Além de avaliar as respostas autoreguladoras, ldf pode ser usado para monitorar o fluxo sanguíneo cortical ao investigar metabólico, miogênico, endotelial, humoral, ou mecanismos neurais que regulam o fluxo sanguíneo cerebral e o impacto de várias intervenções experimentais e condições patológicas no fluxo sanguíneo cerebral10,16,17,18,19,20,21.
LDF mede a mudança na luz laser refletida em resposta ao número e velocidade de partículas em movimento - neste caso, os glóbulos vermelhos (RBC). Para estudos de autoregulação vascular cerebral, a pressão arterial arterial é alterada pela infusão de um agonista alfa-adrenergic para aumentar a pressão arterial (porque a circulação cerebral em si é insensível aos agonistas vasoconstrictor alfa-adrenergic)12,15 ou através de retirada de volume sanguíneo controlado para reduzir a pressão arterial11,14. No presente estudo, ldf é utilizado para demonstrar os efeitos das reduções graduadas na pressão arterial sobre a auto-regulação cerebral em um rato saudável. Embora métodos de crânio aberto e fechado tenham sido descritos na literatura22,23,24,25,o presente artigo demonstra uma preparação fechada do crânio, permitindo que o fluxo sanguíneo cerebral seja avaliado sem penetrar no crânio ou instalar uma câmara ou janela cerebral.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-0 braided black silk suture</td>
			<td>Midwest Vet</td>
			<td>193.73000.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arterial Pressure Transducer</td>
			<td>Merit Medical</td>
			<td>041516504A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Data Acquisition Systems (WINDAQ &#38; BIOPAC system)</td>
			<td>DATAQ Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pressure Display Unit</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating warm water pump</td>
			<td>Gaymar Industries</td>
			<td>T-pump</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End-tidal CO2 monitor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>Capstar-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Midwest Vet</td>
			<td>191.46720.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Flow Meter</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PeriFlux 5000 LDPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Refill Motility Standard</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE240) (for trachea cannula)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63018-828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE50) (for femoral catheters)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Ventilator</td>
			<td>Cwe/Stoelting</td>
			<td>SAR-830/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Midwest Vet</td>
			<td>193.74504.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley Outbred Rats</td>
			<td>Variable</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rats were ordered from various companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Rat Chow</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Cwe/Stoelting</td>
			<td>Clasic Lab Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cerebral blood flow autoregulation in the rat using laser doppler flowmetry

Ao investigar os mecanismos do corpo para regular o fluxo sanguíneo cerebral, uma medida relativa do fluxo sanguíneo microcirculatório pode ser obtida usando fluimetria laser Doppler (LDF). Este papel demonstra uma preparação fechada do crânio que permita que a circulação sanguínea cerebral seja avaliada sem penetrar o crânio ou instalar uma câmara ou uma janela cerebral. Para avaliar os mecanismos de autoregulação, um modelo de redução controlada da pressão arterial por meio de hemorragia graduada pode ser utilizado ao mesmo tempo em que emprega o LDF. Isso permite o rastreamento em tempo real das alterações relativas no fluxo sanguíneo em resposta às reduções na pressão arterial produzida pela retirada do volume sanguíneo circulante. Esse paradigma é uma abordagem valiosa para estudar a autoregulação do fluxo sanguíneo cerebral durante reduções na pressão arterial e, com pequenas modificações no protocolo, também é valiosa como modelo experimental de choque hemorrágico. Além de avaliar as respostas autoregulatórias, ldf pode ser usado para monitorar o fluxo sanguíneo cortical ao investigar metabólico, miogênico, endotélico, humoral, ou mecanismos neurais que regulam o fluxo sanguíneo cerebral e o impacto de vários intervenções e condições patológicas no fluxo sanguíneo cerebral.

A Figura 2 resume os resultados de experimentos realizados em 10 ratos machos Sprague-Dawley alimentados com ração laboratorial padrão. Nesses experimentos, a LCBF média foi mantida dentro de 20% do valor da premorrágica após as três primeiras retiradas do volume sanguíneo, até que a pressão arterial média atingiu o LLA. As retiradas subseqüentes do volume de sangue em pressões abaixo do LLA causaram uma redução progressiva de LCBF, mostrando que a circulação cerebral era j?...

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Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Este artigo demonstra o uso de fluimetria laser Doppler para avaliar a capacidade da circulação cerebral para autoregular seu fluxo sanguíneo durante reduções na pressão arterial.

Avaliação da autoregulação do fluxo sanguíneo cerebral no rato usando fluimetria de laser

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Este protocolo é ideal para avaliar a capacidade da microcirculação cerebral de regular seu próprio fluxo sanguíneo durante as alterações da pressão arterial em condições normais e patológicas. O LDF fornece um método relativamente não invasivo para o monitoramento contínuo do fluxo sanguíneo cerebral sob uma variedade de condições que não é possível com outros métodos. A metria de fluxo de laser Doppler pode ser usada para avaliação do fluxo sanguíneo não invasivo.Por exemplo, para avaliar os efeitos de uma dieta rica em sal na regulação do fluxo sanguíneo prejudicado em mulheres jovens saudáveis. O LDF permite que o fluxo sanguíneo seja facilmente monitorado em muitos leitos vasculares diferentes de humanos e animais, e pode ser usado em uma ampla variedade de estudos. Demonstrando o procedimento com Adrienne Allen será Megan Stumpf, minha tecnóloga de pesquisa e gerente de laboratório.Antes de iniciar o procedimento, coloque o rato em um manta de água circulante mantido a 37 graus Celsius e confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal em um rato experimental anestesiado. Aplique pomada nos olhos dos animais e raspe a parte superior do crânio, área do pescoço ventral e triângulos femorais. Remova qualquer perda de cabelo da pele exposta.E desinfetar a pele com álcool esfregando. Mova o rato para uma almofada de aquecimento com uma bomba de água morna circulante. E use fita médica para fixar temporariamente o rato na posição supina.Encha duas cânulas PE 50 com uma unidade por mL de heparina em solução isotônica de cloreto de sódio. E desnível a extremidade aberta dos cateteres com tesoura cirúrgica para facilitar a inserção nas artérias. Depois de separar cuidadosamente as artérias femorais do tecido circundante sob um microscópio dissecando, ligar a extremidade distal do segmento isolado da artéria femoral e colocar duas suturas adicionais ao redor das extremidades média e proximal da artéria sem apertar os nós.Insira um fio em forma de V feito a partir de um clipe de papel sob a artéria para ocluir o vaso até que a cânula tenha sido presa. Em seguida, use uma tesoura de vannas para fazer uma pequena incisão na artéria femoral perto da ligadura distal. Insira a extremidade chanfrada da cânula na incisão e avance a cânula na artéria femoral.Remova o clipe de papel. Aperte o nó na ligadura do meio sobre a cânula para fixar a cânula no lugar. Solte a tensão na ligadura de elevação, em seguida, aperte a ligadura proximal e feche a incisão.Imediatamente após a colocação das cânulas, coloque o animal em posição severa. E fixar a cabeça em um dispositivo estereotaxista tomando cuidado para não desalojar os cateteres. Faça uma incisão elíptica na pele cobrindo o crânio.E use um cotonete para remover qualquer tecido conjuntivo, garantindo que o crânio esteja limpo e seco. Coloque um pequeno pedaço de papel de tecido alongado enrolado ao redor da incisão no couro cabeludo para parar qualquer sangramento e sob o microscópio dissecando, use uma broca de tamanho apropriado com uma broca de 2,15 mm para afinar uma área de 0,5 a 1 cm de osso na área parietal sobre o córtex somatossensorial esquerdo ou direito, dependendo do tamanho do rato. Afina o osso lentamente e cuidadosamente para evitar penetrar no crânio.Ao realizar esta etapa, a solução salina deve ser aplicada liberalmente para evitar que a área sobreaque o aquecimento. Quando a área tiver uma aparência rosa e/ou vasos sanguíneos podem ser visualizados, cubra o osso diluído com óleo mineral. E use um micromanipulador para posicionar a sonda doppler laser sobre a microcirculação cerebral exposta de modo que a ponta da sonda esteja apenas tocando o topo da piscina de óleo mineral.Para a colocação inicial da sonda, é melhor começar com um sinal de aproximadamente 150 unidades para garantir que a sonda esteja posicionada sobre a micro circulação. Quando a sonda de fluxo de doppler laser estiver no lugar, permita que o animal descanse por um período de equilíbrio de 30 a 45 minutos antes de retirar 1,5 mL de sangue da cânula da artéria femoral apropriada durante um período de 30 segundos. Para manter a patente do cateter, infundir 100 unidades por mL de heparina em soro fisiológico isotônico na cânula após cada coleta de sangue.Deixe o rato se recuperar por dois minutos e, em seguida, meça LDF e pressão arterial a cada 30 segundos por dois minutos. Após as medidas de pressão arterial e LDF, repita a retirada do volume sanguíneo a cada dois minutos até que o animal atinja uma pressão arterial média de aproximadamente 20mmHg. Nestes experimentos representativos, o fluxo sanguíneo médio cerebral a laser de 10 ratos Sprague-Dawley alimentados com chow de laboratório padrão foi mantido dentro de 20% do valor pré-hemorragia após as três primeiras retiradas de volume sanguíneo, até que a pressão arterial média atingiu o limite mais baixo de autoregulação.As subsequentes retiradas de volume sanguíneo em pressões abaixo do limite inferior da autoregulação, causaram uma redução progressiva do fluxo sanguíneo cerebral a laser demonstrando que a circulação cerebral não era mais capaz de produzir um nível suficiente de vasodilatação para manter o fluxo sanguíneo cerebral constante nas pressões de profusão mais baixas. Nas pressões acima ou acima do limite inferior de autoregulação, não houve correlação significativa entre o fluxo sanguíneo cerebral laser e a pressão arterial, indicando que o fluxo sanguíneo cerebral a laser era independente da pressão arterial na faixa platô da curva autoregulatória. Abaixo do limite inferior da autoregulação, a relação de pressão arterial de fluxo sanguíneo cerebral a laser teve uma inclinação negativa.E o fluxo sanguíneo cerebral a laser estava significativamente correlacionado com a pressão arterial. As coisas mais importantes a se lembrar são afinar o crânio com muito cuidado e garantir que a sonda LDF permaneça firmemente ancorada sobre a mesma área de tecido. Este procedimento pode ser utilizado para testar a reatividade da microcirculação de vários agentes após a infusão retrógrada através da artéria carótida, ou para avaliar a hiperemia funcional e o acoplamento neurovascular na circulação cerebral.Essa técnica possibilitou a investigação dos efeitos de diferentes fármacos e anestésicos na circulação cerebral e as alterações na autoregulação cerebral em modelos de doenças como a hipertensão.

Research

JoVE Journal

Medicine

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Intraluminal artéria cerebral média Oclusão Model (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com Laser Doppler Fluxometria Orientação em Ratos

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

Medicina

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Guiada por MRI rompimento da barreira hemato-encefálica utilizando Ultrassom Focalizado transcraniana em um modelo de rato

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Endotelina-1 Induzida Médio modelo de oclusão da artéria cerebral para AVC isquêmico com Laser Orientação Fluxometria Doppler em ratos

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Sistema otimizado para Monitorização de perfusão cerebral no modelo do rato do curso de oclusão da artéria cerebral média intraluminal

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Manuseio do Rato Cotton em Estudos para a avaliação pré-clínica de Vírus Oncolíticos

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Quantificação do imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

Avaliação In Vivo das Propriedades Mecanicas e Viscoelásticas da Língua do Rato

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: Uma ferramenta para medir ilhota Pancreatic Microvascular Vasomotion In Vivo

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

Teste de hemocompatibilidade de implantes de contato com o sangue em um modelo de loop de fluxo imitando o fluxo sanguíneo humano

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

Imagem de perfusão doppler laser no hindlimb mouse

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...