Name: in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da un perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) e da Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). L'Australian Postgraduate Award da parte dell'Università di Sydney riconosce anche la ricezione di un Australian Postgraduate Award. Ringraziamo Pat Pisansarakit e la signora Morgan Jones per l'assistenza nell'isolamento dei monociti e nella cultura dei tessuti.

L'HMDM è stato isolato dai preparati per le mani di bufala umana forniti dalla banca del sangue con l'approvazione etica del distretto sanitario locale di Sydney.
1. Cultura HMDM
<ol><li>Isolare i monociti dai preparati del camice buffo preparati dal sangue periferico di donatori umani sani utilizzando una preparazione disponibile in commercio per isolare i linfociti, seguita da eluriazione centrifuga contrastata19, 20.</li>
	<li>C...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation:+implication+for+the+inflammatory+disease+condition.">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).</li><li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypochlorous+acid+(HOCl)+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation.">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival.">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li><li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminase+inhibition+reduces+vascular+damage+and+modulates+innate+immune+responses+in+murine+models+of+atherosclerosis.">Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis.</a> Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).</li><li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis.">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).</li><li>Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Footprints+of+neutrophil+extracellular+traps+as+predictors+of+cardiovascular+risk.">Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).</li><li>Goldmann, O., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+world+of+extracellular+traps:+not+only+neutrophils+but+much+more.">The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more.</a> Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+derived+from+macrophages,+mast+cells,+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis.">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Extracellular+Traps:+A+Scoping+Review.">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+low-density+lipoprotein+results+in+the+time-dependent+accumulation+of+cholesteryl+esters+and+apolipoprotein+B-100+protein+in+primary+human+monocyte-derived+macrophages.">Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages.</a> FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).</li><li>Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production.">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li><li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+&#176;C+to+35+&#176;C.">The acid ionization constant of HOCl from 5 &#176;C to 35 &#176;C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li><li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid.">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li></ol>

La generazione e la visualizzazione della formazione MET utilizzando HmDM differenziate M1 rappresenta un nuovo modello in vitro che può essere utile per studiare il potenziale ruolo patologico di queste strutture macrofaghe, in particolare sotto l'infiammatorio cronico Condizioni. Fornisce un protocollo robusto per la stimolazione dei macrofagi umani primari per rilasciare MET, che può anche essere utilizzato in studi correlati con linee cellulari monociti o macrofagi murini. La riuscita implementazione di questo prot...

Il rilascio di ET dai neutrofili è stato identificato per la prima volta come una risposta immunitaria innata innescata da infezione batterica1. Sono costituite da una spina dorsale del DNA a cui sono legate varie proteine del granulo con proprietà antibatteriche, tra cui l'elastasi neutrofilo e la mieloperossia2. Il ruolo principale degli ET neutrofili (NET) è quello di catturare gli agenti patogeni e facilitarne l'eliminazione3. Tuttavia, oltre al ruolo protettivo degli ET nella difesa immunitaria, un numero crescente di studi ha anche scoperto un ruolo nella patogenesi della malattia, in particolare durante lo sviluppo di malattie basate sull'infiammazione (ad es. artrite reumatoide e aterosclerosi4). Il rilascio degli ET può essere innescato da varie citochine pro-infiammatorie, tra cui l'interleuchina 8 (IL-8) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF)5,6, e l'accumulo localizzato di ET può aumentare i danni ai tessuti ed evocare risposta pro-infiammatoria7. Ad esempio, le ET sono state implicate come un ruolo causale nello sviluppo dell'aterosclerosi8,promuovendo la trombosi9e prevedendo il rischio cardiovascolare10.
Ora si riconosce che oltre ai neutrofili, altre cellule immunitarie (ad esempio, mastociti, eosofili e macrofagi) possono anche rilasciare ET in caso di esposizione alla stimolazione microbica o pro-infiammatoria11,12. Questo può essere particolarmente significativo nel caso dei macrofagi, considerando il loro ruolo chiave nello sviluppo, nella regolamentazione e nella risoluzione delle malattie infiammatorie croniche. Pertanto, è importante ottenere una maggiore comprensione della potenziale relazione tra il rilascio di ET dai macrofagi e lo sviluppo di malattie correlate all'infiammazione. Recenti studi hanno dimostrato la presenza di MET e NET in placche aterosclerotiche umane intatte e trombi organizzi13. Allo stesso modo, i MET sono stati implicati nel guidare lesioni renali attraverso la regolazione delle risposte infiammatorie14. Tuttavia, a differenza dei neutrofili, ci sono dati limitati sui meccanismi della formazione MET dai macrofagi. Recenti studi che utilizzano modelli in vitro umano di formazione MET mostrano alcune differenze nei percorsi coinvolti in ogni tipo di cellula (cioè, per quanto riguarda l'assenza di citrigazione istone con macrofagi)6. Tuttavia, alcuni hanno dimostrato che il rilascio di NET può verificarsi anche in assenza di citrullination istone15.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un metodo semplice e diretto per valutare il rilascio MET in un modello di macrofago clinicamente rilevante. Ci sono un certo numero di diversi modelli di cellule di macrofago in vitro che sono stati utilizzati per studiare MET (cioè, la linea cellulare monocito umano THP-1 e varie linee cellulari del macrofano murino)16. Esistono alcune limitazioni associate a questi modelli. Ad esempio, la differenziazione dei monociti THP-1 ai macrofagi richiede solitamente una fase di innesco, come l'aggiunta di acetato di forbol miristatico (PMA), che a sua volta attiva percorsi dipendenti dalla chinasi proteica C (PKC). Questo processo è noto per innescare larelease 4 ET e si traduce in un basso rilascio MET basale da cellule THP-1. Altri studi hanno evidenziato alcune differenze nella bioattività e nelle risposte infiammatorie montate dai macrofagi in vivo rispetto alle cellule THP-1 trattate daPMA.
Allo stesso modo, il comportamento e le risposte infiammatorie di diverse linee cellulari simili a macrofagi murini non rappresentano completamente lo spettro di risposta dei macrofagi umani primari18. Pertanto, allo scopo di studiare la formazione di ET macrofaci nell'ambiente clinico, si ritiene che i macrofagi derivati da monofagi (HMDM) primari siano un modello più rilevante piuttosto che linee cellulari monocitiche o murine simili a macrofagi.
Il rilascio di ET dagli HMDM polarizzati M1 è stato dimostrato in seguito all'esposizione di queste cellule a diversi stimoli infiammatori, tra cui l'acido ipocilno ossidante derivato da mieloperossia derivato da minidrica (HOCl), PMA, TNF e IL-86. Descritto qui è un protocollo per polarizzare gli HMDM al fenotipo M1 e visualizzare il successivo rilascio MET dopo l'esposizione a questi stimoli infiammatori. PMA è usato come stimolo del rilascio MET per facilitare il confronto con studi precedenti che hanno usato neutrofili. È importante sottolineare che, HOCl, IL-8, e TNF , sono utilizzati anche per stimolare il rilascio di MET, che si crede di essere modelli migliori dell'ambiente infiammatorio in vivo. Il metodo microscopico per la visualizzazione del rilascio di ET consiste nel macchiare il DNA extracellulare nelle colture di cellule vive utilizzando il verde SYTOX, una macchia di acido nucleico verde fluorescente impermeabile che è stata applicata con successo nei precedenti studi neutrofili. Questo metodo consente una valutazione rapida e qualitativa del rilascio di ET, ma non è appropriato come metodo autonomo per la quantificazione dell'estensione del rilascio ET. La metodologia alternativa deve essere utilizzata se è necessaria la quantificazione per confrontare l'entità del rilascio di ET derivante da diverse condizioni o interventi di trattamento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120Q broad spectrum fluorescent light source</td>
			<td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>24606</td>
			<td>Characterisation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14025050</td>
			<td>For washing steps and HOCl treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorous acid (HOCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>PMC4031</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>rhil-4</td>
			<td>For M2 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 8</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-943</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59202C</td>
			<td>Added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td>1114544</td>
			<td>For isolation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>For washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For MET visulaization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-200 brightfield light source</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>300-01A-50</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages

Il rilascio di trappole extracellulari (ET) da parte dei neutrofili è stato identificato come un fattore che contribuisce allo sviluppo di malattie legate all'infiammazione cronica. Neutrophil ETs (NETs) sono costituiti da una rete di DNA, proteine istone, e varie proteine granulo (cioè, mieloperossiasi, elastasi, e cathepsin G). Altre cellule immunitarie, compresi i macrofagi, possono anche produrre ET; tuttavia, fino a che punto ciò si verifica in vivo e se le trappole extracellulari dei macrofazini (MET) svolgono un ruolo nei meccanismi patologici non è stato esaminato in dettaglio. Per comprendere meglio il ruolo delle MET nelle patologie infiammatorie, è stato sviluppato un protocollo per visualizzare il rilascio di MET dai macrofagi umani primari in vitro, che può essere sfruttato anche negli esperimenti di immunofluorescenza. Ciò consente un'ulteriore caratterizzazione di queste strutture e il loro confronto con gli ET rilasciati dai neutrofili. I macrofagi derivati dai monofati umani (HMDM) producono MET dopo l'esposizione a diversi stimoli infiammatori a seguito della differenziazione al fenotipo pro-infiammatorio M1. Il rilascio di MET può essere visualizzato mediante microscopia utilizzando una macchia di acido nucleico fluorescente verde che è impermeantto alle cellule vive (ad esempio, verde SYTOX). L'uso di macrofagi primari appena isolati, come l'HMDM, è vantaggioso nella modellazione di eventi infiammatori in vivo rilevanti per potenziali applicazioni cliniche. Questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare il rilascio di MET da linee cellulari monocitiche umane (ad esempio, THP-1) a seguito di differenziazione in macrofagi con acetato di mirino phorbol o altre linee cellulari di macrofalo (ad esempio, le cellule J774A.1 simili a murini.

Le immagini di Brightfield che mostrano i cambiamenti morfologici dell'HMDM in risposta agli stimoli per la differenziazione cellulare sono mostrate nella Figura 1. I macrofagi polarizzati M1 da esperimenti con HMDM esposti a IFN e LPS hanno mostrato una forma di cella allungata e simile a un mandrino, come indicato dalle frecce nere nella Figura 1 (pannello centrale). Per fare un confronto, la morfologia dei macrofagi polarizzati M2 dopo l'esposizione dell'HMDM...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Presentato qui è un protocollo per rilevare la produzione di trap extracellulari macrofalo (MET) nella coltura di cellule vive utilizzando microscopia e colorazione a fluorescenza. Questo protocollo può essere ulteriormente esteso per esaminare specifici marcatori proteici MET mediante colorazione immunofluorescenza.

Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Il rilascio di trappole extracellulari da parte di neutrofili e altre cellule immunitarie è importante nell'immunità innata ma anche fortemente legato a patologie infiammatorie. Si sa molto poco di questo processo nei macrofagi anche se queste cellule svolgono un ruolo critico nella risposta infiammatoria. Questo protocollo fornisce un modello umano primario in vitro di trappola extracellulare di macrofagi o rilascio di alberi.Ci fornisce un modello per studiare una potenziale crescita fisiologica di questa struttura in vivo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule di questo protocollo sono cellule primarie isolate dai preparati umani di buffy coat. Non è necessario alcun passo di adescamento per differenziare il monocita in macrofagi, che è in contrasto con altre linee cellulari monocite come la linea cellulare THP-1.Questo protocollo è facilmente adattabile ad altre cellule immunitarie tra cui neutrofilo isolato e microglia. La trappola extracellulare prodotta dai macrofagi è molto fragile, quindi bisogna fare attenzione tra un passo e l'altro per preservare l'integrità delle trappole macchiate. In condizioni sterili, preparare il mezzo di adescamento M1 aggiungendo al mezzo di coltura RPMI-1640 completo, gamma di interferone alla concentrazione di 20 nanogrammi per millilitro e lipopaccaride alla concentrazione di un microgrammo per millilitro.Preparare i supporti di adescamento M2 aggiungendo l'interleuchina 4 al supporto di coltura RPMI-1640 completo alla concentrazione di 20 nanogrammi per millilitro. In condizioni sterili, aspirare i supporti dai pozzi di coltura dei tessuti seminati e coltivati contenenti HMDM. Aggiungere con cura in ogni pozzo, un millilitro di PBS sterile pre-riscaldato a 37 gradi Celsius.Rimuovere il buffer PBS e lavare altre due volte. Aggiungere un millilitro del supporto di adescamento M1 o M2 a ciascun pozzo contenente l'HMDM. Incubare le cellule per 48 ore a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica in un incubatore di cellule.In condizioni sterili, preparare i supporti di coltura contenenti diversi stimolatori del rilascio di MET sui supporti RPMI-1640 completi. Per gli esperimenti con stimolazione dell'acido ipocloroso, preparare 200 micromolari di acido ipocloroso in un tubo Falcon con HBSS che è stato pre-riscaldato a 37 gradi Celsius. Dopo il trattamento di polarizzazione, aspirare il supporto cellulare da ogni pozzo e lavare accuratamente le cellule tre volte con aliquote di millilitro di PBS sterile per la stimolazione di PMA, TNF alpha e interleuchina 8 o HBSS per la stimolazione dell'acido ipocloroso.Dopo aver rimosso il PBS nella fase finale di lavaggio, aggiungere un millilitro di supporti completi contenenti PMA, TNF alpha o interleuchina 8. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in un incubatore di cellule per sei ore per la stimolazione alfa TNF e 24 ore per la stimolazione PMA o interleuchina 8. Per gli esperimenti con acido ipocloroso, dopo aver rimosso l'HBSS nella fase finale di lavaggio, aggiungere un millilitro di acido ipocloroso appena preparato.Quindi incubare le cellule per 15 minuti a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica in un incubatore di cellule. Successivamente, aspirare attentamente il supernatante delle cellule e lavare le cellule tre volte con aliquote di un millilitro di HBSS. Dopo aver rimosso l'HBSS dalla fase di lavaggio finale, aggiungere un millilitro di supporti di coltura RPMI-1640 completi.Quindi incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica in un incubatore di cellule. Preparare il colorante verde SYTOX in HBSS a una concentrazione di 40 micromolari. Aggiungere direttamente 25 microlitri del colorante ad ogni pozzo contenente HMDM.Incubare le cellule a temperatura ambiente per 5 minuti al buio. Quindi posizionare l'HMDM nei pozzi di coltura tissutale sullo stadio del microscopio di un microscopio fluorescente invertito per l'imaging. Accendi una sorgente luminosa fluorescente ad ampio spettro, una sorgente luminosa a campo luminoso e un microscopio invertito installato con una fotocamera digitale a colori ad alta risoluzione.Ruotare la ruota filtrante nella posizione numero due per la fluorescenza verde con eccitazione a 504 nanometri e dimensione a 523 nanometri. Utilizzando l'obiettivo 5X, mettere a fuoco l'immagine con la messa a fuoco grossolana, quindi le manopole di messa a fuoco fine sul microscopio fino a quando l'immagine appare nitida, chiara e focalizzata. Passare dal microscopio alla modalità Fotocamera.Avviare il software associato. Fare clic sul pulsante Riproduci per visualizzare in anteprima l'immagine e regolare la manopola di messa a fuoco fine sul microscopio fino a quando l'immagine appare nitida, chiara e focalizzata nella finestra di anteprima del software. Fare clic sul pulsante Acquisizione.All'interno del software fare clic su File. Salvare come tipo di file di immagine richiesto. Al microscopio, ruotare la ruota del filtro fino alla posizione numero cinque per l'imaging a campo luminoso e ripetere le procedure di acquisizione per ottenere l'immagine del campo luminoso corrispondente.Qui sono mostrate immagini a campo brillante che mostrano i cambiamenti morfologici dell'HMDM in risposta agli stimoli. I macrofagi polarizzati M1 da esperimenti con HMDM esposti a gamma di interferone e lipopolysaccaride mostravano una forma cellulare allungata e simile a un mandrino. Per confronto, la morfologia dei macrofagi polarizzati M2 dopo l'esposizione di HMDM all'interleuchina 4 per 48 ore era tipicamente rotonda e piatta.La capacità dei fenotipi HMDM differenziati di rilasciare MET è stata vista dall'imaging a fluorescenza a cellule vive con verde SYTOX. Il controllo ottenuto da ogni fenotipo HMDM incubato per 24 ore in assenza di stimoli pro-infiammatori ha mostrato una colorazione verde molto limitata. La colorazione positiva per i MET, mostrata come striature verdi, è stata ottenuta con l'esposizione di M1-HMDM ad acido ipocloroso, PMA, interleuchina 8 o TNF alpha.La presenza di alcune macchie verdi evidenti nelle cellule riflette la perdita di integrità della membrana che può derivare dalla morte cellulare che è indipendente dal rilascio di trappole extracellulari. Gli esperimenti eseguiti con M2-HMDM esposti all'interleuchina 4 non hanno mostrato alcun rilascio di DNA dalle cellule, come indicato dall'assenza dei filamenti o delle striature di DNA extracellulare. Tuttavia, c'è stata una certa diffusione cellulare del colorante fluorescente verde con l'acido ipocloroso e il TNF alfa.È importante evitare la luce intensa diretta che può sovraesporre la colorazione prima dell'imaging. Il DNA extracellulare può essere quantificato mediante analisi qPCR sul DNA nucleare e mitocondriale presente nel supernatante cellulare. Un'ulteriore caratterizzazione della struttura dell'albero e dei suoi ruoli nell'infiammazione cronica usando l'HMDM può essere più clinicamente rilevante rispetto ad altri negozi di macrofagi della linea cellulare immortalati.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infezione da modello per lo studio<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 in Interazioni umane Le cellule immunitarie primarie derivate da monociti

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Misura High Throughput di extracellulare DNA di uscita e quantitativa NET Formazione in neutrofili umani<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Un semplice test di fluorescenza per la quantificazione del Canine neutrofili extracellulare Trappola di uscita

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...