Name: in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

Bu çalışma, Sürekli IMPACT Hibesi (IPAP201601422) ve Novo Nordisk Vakfı Biyomedikal Proje Hibesi (NNF17OC0028990) tarafından desteklenmiştir. YZ ayrıca Sydney Üniversitesi'nden Avustralya Lisansüstü Ödülü'nü kabul eder. Biz monosit izolasyon ve doku kültürü ile yardım için Bay Pat Pisansarakit ve Bayan Morgan Jones teşekkür etmek istiyorum.

HMDM, Sydney Yerel Sağlık Bölgesi'nin etik onayı ile kan bankası tarafından sağlanan insan buffy ceket preparatlarından izole edildi.
1. HMDM Kültürü
<ol><li>Lenfositleri izole etmek için ticari olarak kullanılabilir bir hazırlık kullanarak sağlıklı insan donörlerin periferik kan hazırlanan buffy kat preparatları monositler izole, karşı akım santrifüj elutriation takip19, 20. yıl.</li>
	<li>Monosit karakter...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation:+implication+for+the+inflammatory+disease+condition.">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).</li><li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypochlorous+acid+(HOCl)+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation.">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival.">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li><li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminase+inhibition+reduces+vascular+damage+and+modulates+innate+immune+responses+in+murine+models+of+atherosclerosis.">Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis.</a> Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).</li><li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis.">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).</li><li>Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Footprints+of+neutrophil+extracellular+traps+as+predictors+of+cardiovascular+risk.">Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).</li><li>Goldmann, O., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+world+of+extracellular+traps:+not+only+neutrophils+but+much+more.">The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more.</a> Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+derived+from+macrophages,+mast+cells,+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis.">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Extracellular+Traps:+A+Scoping+Review.">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+low-density+lipoprotein+results+in+the+time-dependent+accumulation+of+cholesteryl+esters+and+apolipoprotein+B-100+protein+in+primary+human+monocyte-derived+macrophages.">Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages.</a> FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).</li><li>Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production.">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li><li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+&#176;C+to+35+&#176;C.">The acid ionization constant of HOCl from 5 &#176;C to 35 &#176;C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li><li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid.">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li></ol>

M1 diferansiye HMDM'ler kullanılarak MET oluşumunun oluşturulması ve görselleştirilmesi, özellikle kronik inflamatuar altında, bu makrofaj yapıların potansiyel patolojik rolünü araştırmak için yararlı olabilecek yeni bir in vitro modeli temsil eder Koşul -ları. Aynı zamanda insan monosit veya murine makrofaj hücre hatları ile ilgili çalışmalarda kullanılabilir METs serbest bırakmak için birincil insan makrofajların uyarılması için sağlam bir protokol sağlar. HMDM tarafından MET oluşumun...

Nötrofillerden edinen ET salınımı ilk olarak bakteriyel enfeksiyon tarafından tetiklenen doğuştan gelen bir immün yanıt olarak tanımlanmıştır1. Nötrofil elastaz ve miyeloperoksidaz2gibi anti-bakteriyel özelliklere sahip çeşitli granül proteinlerin bağlı olduğu bir DNA omurgası oluşur. Nötrofil ETs birincil rolü (NETs) patojenleri yakalamak ve bunların ortadan kaldırılması kolaylaştırmaktır 3. Bununla birlikte, immün savunmada ET'lerin koruyucu rolüne ek olarak, özellikle inflamasyona dayalı hastalıkların (örneğin romatoid artrit ve ateroskleroz4). ET salınımı interlökin 8 (IL-8) ve tümör nekroz faktörü alfa (TNFα)5,6dahil olmak üzere çeşitli pro-inflamatuar sitokinler tarafından tetiklenebilir ve ET'lerin lokalize birikimi doku hasarı artırabilir ve bir uyandırmak pro-inflamatuar yanıt7. Örneğin, ET'ler ateroskleroz gelişiminde nedensel bir rol oynadığı için karıştığı edilmiştir8, tromboz teşvik9, ve kardiyovasküler risk tahmin10.
Şimdi nötrofiller ek olarak, diğer bağışıklık hücreleri (yani, mast hücreleri, eozinofiller, ve makrofajlar) ayrıca mikrobiyal veya pro-inflamatuar stimülasyon 11 ,12maruz kalma ET'ler serbest bırakabilirsiniz kabul edilmektedir. Bu durum, kronik inflamatuar hastalıkların gelişiminde, düzenlenmesinde ve çözümünde kilit rol oynadıkları göz önünde bulundurularak makrofajlar açısından özellikle önemli olabilir. Bu nedenle, makrofajlar et sürümü ve inflamasyona bağlı hastalık gelişimi arasındaki potansiyel ilişki daha iyi anlaşılması önemlidir. Son çalışmalar sağlam insan aterosklerotik plaklar ve organize trombüs13METs ve NETs varlığını göstermiştir. Benzer şekilde, METs inflamatuar yanıtların düzenlenmesi ile böbrek hasarı sürüş karıştığı edilmiştir14. Ancak nötrofillerin aksine makrofajlardan MET oluşumu mekanizmaları hakkında sınırlı veri vardır. MET oluşumuinsan in vitro modellerini kullanarak yapılan son çalışmalar, her hücre tipinde yer alan yollarda bazı farklılıklar göstermektedir (yani, makrofajlarla histon sitrullination yokluğu ile ilgili)6. Ancak, bazı NET sürümü de histon sitrullination yokluğunda oluşabilir göstermiştir15.
Bu protokolün genel amacı, MET salınımını klinik olarak ilgili bir makrofaj modelinde değerlendirmek için basit ve doğrudan bir yöntem sağlamaktır. MET'leri incelemek için kullanılan farklı in vitro makrofaj hücre modelleri vardır (yani, THP-1 insan monosit hücre hattı ve çeşitli murine makrofaj hücre hatları)16. Bu modeller ile ilişkili bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, THP-1 monositlerinin makrofajlara farklılaşması genellikle protein kinaz C (PKC) bağımlı yolları aktive eden phorbol myristate asetat (PMA) eklenmesi gibi bir astar adım gerektirir. Bu işlem ET salınımıtetiklediği bilinmektedir 4 ve THP-1 hücrelerinden düşük bazal MET sürümü ile sonuçlanır. Diğer çalışmalar pma tedavi THP-1 hücreleri17ile karşılaştırıldığında in vivo makrofajlar tarafından monte biyoaktivite ve inflamatuar yanıtları bazı farklılıklar vurgulamıştır.
Benzer şekilde, farklı murine makrofaj benzeri hücre hatlarının davranışı ve inflamatuar yanıtları tamamen birincil insan makrofajlarının yanıt spektrumu temsil etmez18. Bu nedenle, klinik ortamda makrofaj ET oluşumunu araştırmak amacıyla, birincil insan monosit kaynaklı makrofajlar (HMDM) monositik veya murine makrofaj benzeri hücre hatları yerine daha alakalı bir model olduğuna inanılmaktadır.
M1 polarize HMDM et sürümü farklı inflamatuar uyaranların bir dizi bu hücrelerin maruz kalma sonrasında gösterilmiştir, miyeloperoksidaz türetilmiş oksidan hipokloröz asit de dahil olmak üzere (HOCl), PMA, TNFα, ve IL-86. Burada açıklanan M1 fenotip HMDMs polarize etmek ve bu inflamatuar uyaranlara maruz kalma üzerine sonraki MET sürümü görselleştirmek için bir protokoldür. PMA nötrofil kullanmış önceki çalışmalara karşılaştırmaları kolaylaştırmak için MET sürümü bir uyarıcı olarak kullanılır. Daha da önemlisi, HOCl, IL-8, ve TNFα da MET salınımını uyarmak için kullanılır, hangi in vivo inflamatuar ortamın daha iyi modelleri olduğuna inanılmaktadır. ET salınımını görselleştirme için mikroskobik yöntem, önceki nötrofil çalışmalarında başarıyla uygulanmış bir geçirimsiz floresan yeşil nükleik asit lekesi olan SYTOX yeşili kullanılarak canlı hücre kültürlerinde hücre dışı DNA'nın boyanmasını içerir. Bu yöntem ET salınımının hızlı ve nitel olarak değerlendirilmesine olanak sağlar, ancak ET salınım kapsamının nicelleştirilmesi için tek başına bir yöntem olarak uygun değildir. Farklı tedavi koşullarından veya müdahalelerden kaynaklanan ET salınımının kapsamını karşılaştırmak için niceleme gerekiyorsa alternatif metodoloji kullanılmalıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120Q broad spectrum fluorescent light source</td>
			<td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>24606</td>
			<td>Characterisation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14025050</td>
			<td>For washing steps and HOCl treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorous acid (HOCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>PMC4031</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>rhil-4</td>
			<td>For M2 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 8</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-943</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59202C</td>
			<td>Added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td>1114544</td>
			<td>For isolation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>For washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For MET visulaization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-200 brightfield light source</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>300-01A-50</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages

Nötrofiller tarafından hücre dışı tuzakların (ET) salınımı kronik inflamasyona bağlı hastalıkların gelişimine katkıda bulunan bir faktör olarak tanımlanmıştır. Nötrofil ET'ler (NETs) DNA, histon proteinleri ve çeşitli granül proteinlerinden (yani miyeloperoksidaz, elastaz ve kathepsin G) oluşur. Makrofajlar da dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücreleri, aynı zamanda ET üretebilir; ancak, bunun ne ölçüde meydana geldiği ve makrofaj hücre dışı tuzakların (METs) patolojik mekanizmalarda rol oynayıp oynamadığı ayrıntılı olarak incelenmemiştir. Met'lerin inflamatuar patolojilerde rolünü daha iyi anlamak için, immünoresans deneylerinde de yararlanılabilen primer insan makrofajlarından MET salınımını in vitro olarak görselleştirmek için bir protokol geliştirilmiştir. Bu, bu yapıların daha fazla karakterizasyonuna ve nötrofillerden salınan ED'lerle karşılaştırılmasına olanak sağlar. İnsan monosit kaynaklı makrofajlar (HMDM), M1 pro-inflamatuar fenotipten farklılaşmasını takiben farklı inflamatuar uyaranlara maruz kalındığında MET üretirler. MET salınımı canlı hücreler (örneğin, SYTOX yeşili) için imperkast olan yeşil floresan nükleik asit lekesi kullanılarak mikroskopi ile görselleştirilebilir. HMDM gibi yeni izole edilmiş primer makrofajların kullanımı, potansiyel klinik uygulamalarla ilgili in vivo inflamatuar olayların modelalınmasında avantajlıdır. Bu protokol aynı zamanda insan monosit hücre hatlarından MET salınımını incelemek için de kullanılabilir (örn. THP-1) phorbol myristate asetat veya diğer makrofaj hücre hatları (örn. rürin makrofaj benzeri J774A.1 hücreleri) ile makrofajlara farklılaşmayı takiben.

Hücre farklılaşması için uyaranlara yanıt olarak HMDM'nin morfolojik değişikliklerini gösteren brightfield görüntüleri Şekil 1'degösterilmiştir. IFNγ ve LPS'ye maruz kalan HMDM ile yapılan deneylerdeki M1 polarize makrofajlar, Şekil 1'deki (orta panel) siyah oklarda gösterildiği gibi uzamış ve mil benzeri bir hücre şekli gösterdi. Karşılaştırma için, HMDM'nin 48 saat il-4'e maruz kalmasından sonra M2 polarize makrofajların morfolo...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Burada mikroskopve floresan boyama kullanarak canlı hücre kültüründe makrofaj ekstrasellüler tuzak (MET) üretimini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, immünoresans boyama ile spesifik MET protein belirteçlerini incelemek için daha da genişletilebilir.

Diferansiye İnsan Monosit türevi Makrofajlarda Hücre Dışı Tuzak Salınımının İn Vitro Stimülasyon ve Görselleştirilmesi

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Nötrofiller ve diğer bağışıklık hücreleri tarafından ekstrasellüler tuzakların salınımı doğuştan gelen bağışıklık ta önemlidir, ancak aynı zamanda inflamatuar patolojilerle de güçlü bir şekilde bağlantılıdır. Bu hücreler inflamatuar yanıtta kritik bir rol oynasa da makrofajlarda bu süreç hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu protokol makrofajlar ekstrasellüler tuzak veya mast serbest birincil insan in vitro modeli sağlar.Bu yapının potansiyel fizyolojik büyümesini in vivo olarak incelemek için bize bir model sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu protokoldeki hücrelerin insan buffy kat preparatlarından izole edilmiş birincil hücreler olmasıdır. ThP-1 hücre hattı gibi diğer monosit hücre hattı ile tezat makrofajlar, monosit ayırt etmek için gerekli hiçbir astar adım yoktur.Bu protokol izole nötrofil ve mikroglia dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücrelerine kolayca uyarlanmıştır. Makrofajlar tarafından üretilen ekstrasellüler tuzak çok kırılgandır, bu nedenle lekeli tuzakların bütünlüğünü korumak için adım arasında özen verilmelidir. Steril koşullar altında, tam RPMI-1640 kültür ortamı, mililitre başına 20 nanogram konsantrasyonuna interferon gama ve mililitre başına bir mikrogram konsantrasyonuna lipopolisakkarit ekleyerek M1 priming orta hazırlamak.Mililitre başına 20 nanogram konsantrasyonuna komple RPMI-1640 kültür ortamına interlökin 4 ekleyerek M2 priming ortamını hazırlayın. Steril koşullarda, HMDM içeren tohumlu ve kültürlü doku kültürü plaka kuyularından aspire ortamı. Dikkatle her kuyuiçine ekleyin, steril PBS bir mililitre önceden 37 santigrat dereceye ısıtılır.PBS arabelleği çıkarın ve iki kez daha yıkayın. HMDM içeren her kuyuya bir mililitre M1 veya M2 astar lı ortam ekleyin. Bir hücre kuluçka makinesinde %5 karbondioksit varlığında hücreleri 37 derecede 48 saat kuluçkaya yatırın.Steril koşullar altında, tam RPMI-1640 medya MET sürümü farklı uyarıcılar içeren kültür medya hazırlamak. Hipokloröz asit stimülasyon deneyleri için, 37 santigrat dereceönceden ısıtılmış olan HBSS ile falcon tüpünde 200 mikromolar hipokloröz asit hazırlayın. Polarizasyon tedavisinden sonra, her kuyudan hücre ortamını aspire edin ve hücreleri PMA, TNF alfa ve interlökin 8 stimülasyon veya hipokloröz asit stimülasyonu için HBSS için bir mililitre lik alquot ile dikkatlice yıkayın.Son yıkama adımında PBS'yi çıkardıktan sonra, PMA, TNF alfa veya interlökin 8 içeren bir mililitre tam ortam ekleyin. TNF alfa stimülasyonu için altı saat ve PMA veya interlökin 8 stimülasyon için 24 saat boyunca bir hücre kuluçka makinesinde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit hücreleri kuluçka. Hipokloröz asit ile deneyler için, son yıkama adımında HBSS çıkardıktan sonra, taze hazırlanmış hipokloröz asit bir mililitre ekleyin.Sonra hücreleri 15 dakika boyunca 37 derecede bir hücre kuvözde %5 karbondioksit varlığında kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, dikkatlice hücrelerin supernatant aspire ve HBSS bir mililitre aliquots ile hücreleri üç kez yıkayın. HBSS'yi son yıkama adımından çıkardıktan sonra, bir mililitre tam RPMI-1640 kültür ortamı ekleyin.Sonra hücreleri 24 saat boyunca 37 derecede bir hücre kuvözde %5 karbondioksit bulundurun. HBSS'de 40 mikromolar konsantrasyonda SYTOX yeşil boya hazırlayın. DOĞRUDAN HMDM içeren her kuyuya boya 25 mikrolitre ekleyin.Karanlıkta 5 dakika oda sıcaklığında hücreleri kuluçkaya yatırın. Daha sonra HMDM'yi doku kültürü kuyularına yerleştirin ve görüntüleme için ters floresan mikroskobun mikroskobun mikroskop aşamasına yerleştirin. Geniş spektrumlu floresan ışık kaynağını, parlak alan ışık kaynağını ve yüksek çözünürlüklü renkli dijital fotoğraf makinesiyle yüklü ters mikroskobu açın.Filtre tekerleğini yeşil floresan için iki numaralı konuma döndürün ve 504 nanometrede uyarma ve 523 nanometrede boyut. 5X hedefini kullanarak, görüntüyü kaba odakla odaklayın ve görüntü keskin, net ve odaklanmış görünene kadar ince odak lama ları mikroskoba odaklanın. Mikroskobu Kamera moduna geçirin.İlişkili yazılımı başlatın. Görüntüyü önizlemek için Oynat düğmesini tıklatın ve görüntü net, net ve yazılım önizleme penceresinde odaklanana kadar mikroskoptaki ince odak düğmesini ayarlayın. Yakala düğmesini tıklatın.Yazılım içinde Dosya'yı tıklatın. Gerekli görüntü dosyası türü olarak kaydedin. Mikroskopta, filtre tekerleğini parlak alan görüntüleme için beş numaralı konuma döndürün ve ilgili parlak alan görüntüsünü elde etmek için yakalama yordamlarını tekrarlayın.HMDM'nin uyaranlara yanıt olarak morfolojik değişikliklerini gösteren parlak alan görüntüleri burada gösterilmiştir. M1-polarize makrofajlar HMDM ile interferon gama ve lipopolisakkarit maruz kalan bir uzamış ve iğ benzeri hücre şekli gösterdi. Karşılaştırma için, HMDM'nin interlökin 4'e 48 saat maruz kalmasından sonra M2-polarize makrofajların morfolojisi tipik olarak yuvarlak ve düzidi.Farklılaştırılmış HMDM fenotiplerinin MET salgılayabilme yeteneği SYTOX yeşili ile canlı hücre floresan görüntülemesi ile görselleştirildi. Herhangi bir pro-inflamatuar uyaran yokluğunda 24 saat boyunca kuluçkaya yatırılanan her HMDM fenotipten elde edilen kontrol, çok sınırlı yeşil boyama gösterdi. Yeşil çizgiler olarak gösterilen MET'ler için pozitif boyama, M1-HMDM'lerin hipokloröz asit, PMA, interlökin 8 veya TNF alfaya maruz kalmasıyla elde edildi.Hücrelerde belirgin bazı yeşil boyama varlığı hücre dışı tuzak salınımından bağımsız hücre ölümü sonucu ortaya çıkabilecek membran bütünlüğünün kaybını yansıtır. Interlökin 4'e maruz kalan M2-HMDM'lerle yapılan deneylerde, hücre dışı DNA iplikçiklerinin veya çizgilerin inanılarak belirtildiği gibi hücrelerden DNA salınımı yapılmadı. Ancak, hipokloröz asit ve TNF alfa ile yeşil floresan boya bazı hücresel alımı vardı.Görüntülemeden önce lekelenmeyi aşırı maruz bırakabilecek doğrudan parlak ışıktan kaçınmak önemlidir. Hücre dışı DNA, hücre supernatantında bulunan nükleer ve mitokondriyal DNA üzerinde qPCR analizi ile ölçülebilir. Mast yapısının daha fazla karakterizasyonu ve HMDM kullanarak kronik inflamasyondaki rolleri diğer ölümsüzleştirilmiş hücre hattı makrofaj depolarına göre klinik olarak daha uygun olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...