Name: analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia
Uploaded: 2020-02-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Spastic Paraplegia Foundation, Blazer Foundation og NIH (R21NS109837).

1. Generation af telencephalic glutamatergic neuroner fra iPSCs
BEMÆRK: Den detaljerede protokol for vedligeholdelse af iPSCs og deres differentiering i telencephalic glutamatergic neuroner svarer til dem, der er beskrevet tidligere18. Her introduceres og fremhæves den kritiske proces under differentieringen af humane pluripotente stamceller.
<ol><li>Kultur iPSCs på mus embryonale fibroblast (MEF) foderautomater i menneskelige embryonale stamceller (hESC) medium su...

<ol>
	<li>Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+membranous+and+nonmembranous+cargoes:+a+unified+perspective.">Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective.</a> Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons.">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).</li><li>Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+trafficking+in+neurons.">Mitochondrial trafficking in neurons.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).</li><li>Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+of+mitochondria.">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).</li><li>Course, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+Mitochondrial+Transport+in+Neurons.">Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons.</a> Neuromethods. 123, 49-66 (2017).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+mitochondria+with+fluorescent+dyes+for+imaging.">Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+Mitochondrial+Movement+Within+Neurons:+Manual+Versus+Automated+Tracking+Methods.">Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods.</a> Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).</li><li>Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+biogenesis,+defective+axonal+transport+of+mitochondria,+abnormal+mitochondrial+dynamics+and+synaptic+degeneration+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).</li><li>Denton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+dynamics+underlie+axonal+defects+in+hereditary+spastic+paraplegias.">Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias.</a> Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).</li><li>Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parkinsonian+mimetic,+MPP+,+specifically+impairs+mitochondrial+transport+in+dopamine+axons.">The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).</li><li>Shirendeb, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+huntingtin's+interaction+with+mitochondrial+protein+Drp1+impairs+mitochondrial+biogenesis+and+causes+defective+axonal+transport+and+synaptic+degeneration+in+Huntington's+disease.">Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease.</a> Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).</li><li>Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia:+clinical-genetic+characteristics+and+evolving+molecular+mechanisms.">Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms.</a> Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).</li><li>Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+of+hereditary+spastic+paraplegia.">Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia.</a> Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).</li><li>Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+rescue+of+axon+growth+defects+in+a+human+iPSC+model+of+hereditary+spastic+paraplegia+SPG3A.">Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).</li><li>Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Time-Lapse+Imaging+in+the+Zebrafish+Lateral+Line:+A+Flexible,+Open-Ended+Research+Project+for+an+Undergraduate+Neurobiology+Laboratory+Course.">In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).</li><li>Kang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docking+of+axonal+mitochondria+by+syntaphilin+controls+their+mobility+and+affects+short-term+facilitation.">Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation.</a> Cell. 132 (1), 137-148 (2008).</li><li>Mou, Y., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+axonal+defects+by+targeting+mitochondrial+dynamics+in+hereditary+spastic+paraplegias.">Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias.</a> Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photostable+naphthalimide-based+fluorescent+probe+for+mitochondrial+imaging+and+tracking.">New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).</li><li>Carvalho, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+benzothiadiazole+fluorophores+for+selective+mitochondrial+imaging+and+dynamics.">Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics.</a> Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).</li><li>Yamakoshi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+Raman+probe+based+on+bisarylbutadiyne+for+live+cell+imaging+of+mitochondria.">A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).</li><li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoAnalyzer:+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons.">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantifying+mitochondrial+axonal+transport.">A new method for quantifying mitochondrial axonal transport.</a> Protein &amp; Cell. 7 (11), 804-819 (2016).</li><li>De Vos, K. J., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+mitochondrial+dynamics+in+living+animal+cells.">Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells.</a> Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).</li><li>Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Axonal+Phenotypes+with+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).</li><li>Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+Tracker:+ImageJ+plugins+for+fully+automated+analysis+of+multiple+axonal+transport+parameters.">Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).</li><li>Reis, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motor+function+in+axonal+transport+in+vivo+probed+by+genetic+and+computational+analysis+in+Drosophila.">Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).</li><li>Broeke, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+of+cellular+traffic+in+living+cells.">Automated quantification of cellular traffic in living cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).</li><li>Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+robust+method+for+automated+analysis+of+axonal+transport.">A fast and robust method for automated analysis of axonal transport.</a> European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).</li><li>Mukherjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+kymograph+analysis+for+profiling+axonal+transport+of+secretory+granules.">Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules.</a> Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy.</a> Autophagy. 12, 1 (2016).</li><li>Metivier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofluorometric+detection+of+mitochondrial+alterations+in+early+CD95/Fas/APO-1-triggered+apoptosis+of+Jurkat+T+lymphoma+cells.+Comparison+of+seven+mitochondrion-specific+fluorochromes.">Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes.</a> Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+proper+fluorescent+dyes,+proteins,+and+imaging+techniques+to+study+mitochondrial+dynamics+in+mammalian+cells.">Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells.</a> Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).</li><li>Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mitochondrial+transport+in+neurons.">Characterization of mitochondrial transport in neurons.</a> Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).</li></ol>

Denne artikel beskriver en metode til at analysere mitokondriel transport og morfologi i neuronal axoner ved hjælp af rød fluorescerende farvestof og ImageJ software, som begge giver en unik platform til at studere axonal degeneration og mitokondriel morfologi i neurodegenerative sygdomme. Der er flere kritiske trin i protokollen, herunder farvning af mitokondrier, levende celle billeddannelse, og analysere billederne. I denne metode blev et fluorescerende farvestof brugt til at plette mitokondrier. Da menneskelige iPS...

Mitokondriel motilitet og distribution spiller en afgørende rolle i opfyldelsen af variable og specialiserede energiske krav i polariserede neuroner. Neuroner kan udvide ekstremt lange axoner til at forbinde med mål gennem dannelsen af synapser, som kræver høje niveauer af energi til Ca2 + buffering og ion strømme. Transport af mitokondrier fra soma til axon er afgørende for at støtte axonal og synaptisk funktion af neuroner. Rumligt og tidsmæssigt dynamisk mitokondriel bevægelse udføres ved hurtig aksonal transport med hastigheder på flere mikrometer pr.sekund 1.
Specifikt, motor eller adapter proteiner, såsom kinesin og dynein, deltage i den hurtige organelle transport langs mikrotubuli til at kontrollere flytning af mitokondrier2,3. Normal neuronal aktivitet kræver korrekt transport af nyligt samlede mitokondrier fra neuronal soma til distale axon (anterograde axonal transport) og omvendt transport af mitokondrier fra den distale axon tilbage til cellekroppen (retrograd transport). Nylige undersøgelser har vist, at forkert mitokondriel tildeling er stærkt forbundet med neuronale defekter og motorneuron degenerative sygdomme4,5. Derfor, at dissekere rollen som mitokondrier i neurodegeneration, er det vigtigt at etablere metoder til at undersøge mitokondrielle bevægelse langs axoner i levende kulturer.
Der er to største udfordringer i at undersøge og analysere sporing af mitokondrier: (1) identificere mitokondrier fra baggrunden i hver ramme, og (2) analysere og generere forbindelserne mellem hver ramme. Ved løsningen af den første udfordring anvendes en fluorescensmærkningsmetode bredt til at skelne mitokondrier fra baggrunden, såsom MitoTracker farvestof eller omladning af fluorescens-smeltet mitokondrielt målretningsprotein (f.eks. mito-GFP)6,7,8. For at analysere sammenhængen mellem rammer, flere algoritmer og softwareværktøjer er blevet beskrevet i tidligere undersøgelser9. I et nyligt papir sammenlignede forskerne fire forskellige automatiserede værktøjer (f.eks. volocity, Imaris, wrMTrck og Difference Tracker) for at kvantificere mitokondriel transport. Resultaterne viste, at på trods af uoverensstemmelser i sporlængde, mitokondriel forskydning, bevægelsesvarighed og hastighed er disse automatiserede værktøjer egnede til vurdering af transportforskellen efter behandling10. Ud over disse værktøjer, en integreret plugin "Makroer" for ImageJ (skrevet af Rietdorf og Seitz) har været meget anvendt til at analysere mitokondriel transport11. Denne metode genererer kymografer, der kan bruges til at analysere mitokondriel bevægelse, herunder hastighed i både anterograde og retrograd retninger.
Mitokondrier er meget dynamiske organeller, der konstant ændrer sig i antal og morfologi som reaktion på både fysiologiske og patologiske tilstande. Mitokondriel fission og fusion stramt regulere mitokondriel morfologi og homøostase. Ubalancen mellem mitokondriel fission og fusion kan fremkalde ekstremt korte eller lange mitokondrielle netværk, som kan forringe mitokondriel funktion og resultere i unormale neuronale aktiviteter og neurodegeneration. Nedsat mitokondrielle transport og morfologi er involveret i forskellige neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, Huntingtons Sygdom, og arvelig spastisk paraplegi (HSP)12,13,14,15. HSP er en heterogen gruppe af arvelige neurologiske lidelser karakteriseret ved degeneration af korticospinaltarmkanalen og efterfølgende manglende kontrol af muskelmuskler i underekstremiteterne16,17. I denne undersøgelse, iPSC-afledte forhjernen neuroner bruges til at vurdere mitokondriel transport og morfologi i HSP. Denne metode giver et unikt paradigme for at undersøge mitokondriel dynamik neuronal axoner i levende kulturer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 SERIES A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall Legend X1R/ 75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Chemiglass Life Sciences</td>
			<td>1760-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic AMP (cAMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#39;&#39; glass pipetes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-6274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker CMXRos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPle Serum-Free Supplement</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope IX83</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83-ZDC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41/ IX2-SLP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine))</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#956;m Millipore Express&#174; Plus Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 &#956;M PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr1 antibody (1:2000)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks (untreated)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugins for softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-formats Package</td>
			<td><a href="http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/" target="_blank">http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td><a href="https://fiji.sc/" target="_blank">https://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kymograph Plugin</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultipleKymograph.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultipleOverlay.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WalkingAverage.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackDifference.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straighten_.jar</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tsp050706.txt</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia

Neuroner har intense krav til høj energi for at støtte deres funktioner. Nedsat mitokondrielle transport langs axoner er blevet observeret i menneskelige neuroner, som kan bidrage til neurodegeneration i forskellige sygdomstilstande. Selv om det er udfordrende at undersøge mitokondrielle dynamik i levende menneskelige nerver, sådanne paradigmer er afgørende for at studere den rolle mitokondrier i neurodegeneration. Beskrevet her er en protokol til analyse af mitokondriel transport og mitokondriel morfologi i forhjernen neuron axoner stammer fra menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSCs). IPSCs er differentieret i telencephalic glutamatergic neuroner ved hjælp af veletablerede metoder. Mitokondrier af neuroner er plettet med MitoTracker CMXRos, og mitokondrielle bevægelse i axoner er fanget ved hjælp af en live-celle imaging mikroskop udstyret med en kuvøse for cellekultur. Time-lapse billeder analyseres ved hjælp af software med "MultiKymograph", "Bioformat importør", og "Makroer" plugins. Kymographs af mitokondriel transport genereres, og gennemsnitlig mitokondriel hastighed i anterograde og retrograd retninger læses fra kymografen. Med hensyn til mitokondriel morfologi analyse, mitokondriel længde, område, og billedformat opnås ved hjælp af ImageJ. Sammenfattende giver denne protokol mulighed for karakterisering af mitokondriel handel langs axoner og analyse af deres morfologi for at lette undersøgelser af neurodegenerative sygdomme.

Her blev humane iPC'er differentieret i telencephalic glutamatergic neuroner, som var karakteriseret ved immunfarvning med Tbr1 og βIII tubulinmarkører (figur 1A). For at undersøge den axonale transport af mitokondrier, disse celler blev plettet med rød fluorescerende farvestof, og time-lapse imaging blev udført. Da ImageJ er let tilgængelige og lettere at opnå, mitokondriel transport blev yderligere analyseret med "MultiKymograph" og "Macros" ImageJ plugins, vist i <...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia at JoVE.com

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Nedsat mitokondrielle transport og morfologi er involveret i forskellige neurodegenerative sygdomme. Den præsenterede protokol bruger inducerede pluripotente stamceller-afledte forhjernen neuroner til at vurdere mitokondrielle transport og morfologi i arvelig spastisk paraplegi. Denne protokol giver mulighed for karakterisering af mitokondriel handel langs axoner og analyse af deres morfologi, som vil lette studiet af neurodegenerative sygdomme.

Analyse mitokondriel transport og morfologi i Human Induceret pluripotente stamceller-afledte neuroner i arvelige spastiske paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Mitokondriel dysfunktion ligger til grund for mange neurodegenerative sygdomme. Vores protokol giver et vigtigt redskab til at undersøge mitokondrielle dynamik i axoner, lette studiet af neurologiske sygdomme, der involverer axonal degeneration. Ved at kombinere mitokondriel mærkning, levende celle billeddannelse og induceret pluripotent stamcelleteknologi vores protokol kan bruges til at karakterisere mitokondriel handel langs menneskelige axoner og til at analysere deres morfologier.Nedsat mitokondriel transport og morfologi kan observeres i stamcellekulturer og dyremodeller af neurodegenerative sygdomme, der giver potentielle terapeutiske mål for behandling af disse sygdomme. Efter dag 35 af kultur, adskille neurosfærer differentieret fra humane inducerede pluripotente stamceller i små klynger med 1 mg / ml celle udstationering løsning i to minutter ved 37 grader Celsius. Ved slutningen af inkubationen indsamles celleklyngerne ved centrifugering og resuspenderet pellet i en milliliter NDM.Plade omkring fem klynger af celler i hundrede mikroliter af medium per polyornitin og laktose dehydrogenase opløftende virus-fri nedsat vækstfaktor kælder membran matrix belagt 35 millimeter glas bund retter. Derefter tilsættes en milliliter NDM suppleret med B27, cyklisk adenosin monophosphat, insulin-lignende vækstfaktor, menneskelige hjerne-afledt neurotrofisk faktor og glia celle-afledt neurotrofisk faktor til hver kultur. At visualisere mitokondrier langs axoner af forhjernen neuroner første plet neuroner med 50 nanomolar rød fluorescerende farvestof i NDM i tre minutter ved 37 grader Celsius efterfulgt af to vasker i varm NDM.Dernæst placere kulturen på scenen af en fluorescens mikroskop og vælg 40X mål. Under fasefeltet identificere axoner baseret på deres morfologiske egenskaber. At skelne retningen af mitokondrielle bevægelse langs axonerne klart identificere celle organer neuroner.Efter at have skelnet cellekroppen og aksonen justere eksponeringstiden og fokus for mitokondrier i axonerne og fange mitokondrielle transport inden for axonerne hvert femte sekund i alt fem minutter. At analysere mitokondriel transport i ImageJ åbne Fiji og vælge Bio-Formater plugin. Brug importøren bioformater til at importere time-lapse-billederne i tiff-serien, og vælg standard ImageJ og Åbn alle serier.Kontroller automatisk skalering af opdelte kanaler, og klik på OK for at notere billednummeret og størrelsen på billederne i pixel. Når lysstyrken og kontrasten for alle 60 rammer er justeret, skal du bruge den segmenterede linje til at tegne en linje fra cellekroppen til terminalaksonen. Hvis du vil generere Kymograph, skal du vælge multipel Kymograph-plugin og vælge linjebredden.For at måle afstanden, tidsværdier og hastighed for de bevægelige mitokondrier åbne tsp050607. txt i makroer plugin. Og trække en segmenteret linje over sporet af mitokondriel bevægelse på kymograph fra den overlegne end den ringere region.Efter tegning linjen åbne læse hastigheder fra tsp i makroer plugin til at læse de segmenterede hastigheder, der svarer til linjen. Åbn derefter det oprindelige billede, og brug stregværktøjet til at tegne en streg langs skalalinjen. Vælg Analyser for at måle linjens længde og konvertere dx'en nu og afstandsenhederne fra pixel til mikrometer.Skift derefter tiden fra pixel til sekunder. At analysere mitokondrielle længde og område inden axons i ImageJ installere rette understreger prik JAR plugin og åbne axon billede af interesse. Konverter 32-bit-billedet til otte bit, og brug det segmenterede stregværktøj til at spore axonen.Vælg Ret understreger JAR plugin og indstille bredden af glødetråd bred linje til 50 pixels. Spor axonen igen for at generere en udjænt axon, og juster billedtærsklen. Vælg analyser sætmål perimeter fit ellipse og form beskrivelser til at indstille målingen og bruge linjefunktionen til at måle skalalinjen i det oprindelige billede som vist.Under analysere og for at indstille skala indtaste afstanden i pixels kendt afstand og enheden af længde for at indstille skalaen. Vælg derefter global for at indstille skaleringsindstillingen til alle billederne. Endelig vælge analysere og analysere partikler til at bestemme området og vælge visningsresultater for at se den resulterende måling.Efter differentiering i telencephalic glutamatergic neuroner cellerne kan karakteriseres ved deres T-B-R en og beta tre tubulin markør udtryk. Farvning med rødt fluorescerende farvestof og time-lapse imaging giver mulighed for evaluering af axonal transport af mitokondrier. En enkelt mitokondrion kan forblive statisk eller bevæge sig i en anterograde eller tilbageskridt i en axon.Hastigheden af mitokondriel bevægelse langs axon kan kvantificeres som illustreret. For eksempel ved hjælp af kommercielt tilgængelige analyse software procentdelen af motile mitokondrier er væsentligt reduceret i S-P-G-3-A neuroner i forhold til vilde type neuroner. For at analysere mitokondrielle område længde og højde-bredde-forhold axoner kan rettes i billedet analyse software og valgt ved at justere tærsklen.Mitokondrielle område perimeter længde bredde og højde-bredde kan derefter fås fra den rettede axon. For eksempel er både mitokondriel længde og højde-bredde-forholdet væsentligt reduceret i S-P-G 15 neuron axoner sammenlignet med kontrol vilde type axoner. Det er vigtigt at varme mediet og mikroskopskkubatoren for at vaske cellerne forsigtigt og lade cellerne stabilisere sig i tyve minutter før billeddannelse.Efter levende cellebilleddannelse kan kulturerne fastsættes og udsættes for immunstaining for at undersøge ekspressionen af andre proteiner af interesse. Det er udfordrende at undersøge mitokondrielle dynamik i levende menneskelige nerver. Denne teknik giver det unikke værktøj til undersøgelse af mitokondriel dynamik og nervedegeneration i neurologiske sygdomme.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv derivering af humane Neuronal progenitorer og neuroner fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen af ​​Telencephalic glutamaterge neuroner fra humane pluripotente stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse Dendritiske Morfologi i Kolonner og Lag

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion i udviklingslandene menneskelige hjerne In Vitro ved hjælp af stamceller afledt Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metode for høj hastighed Stretch skade af menneskelig induceret pluripotente stamceller-afledt neuroner i en 96-brønds Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Opdeling af humane stamcelle-afledte neuroner inden for præ-monterede plastik Microfluidic chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-differentiering Replating af humane pluripotente stamcelle-afledte neuroner for højt indhold screening af Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omdannelse af humane induceret pluripotente stamceller (iPSCs) til funktionel spinal og kraniel motor neuroner brug PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...