Name: analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia
Uploaded: 2020-02-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Spastic Paraplegia Foundation, der Blazer Foundation und der NIH (R21NS109837) unterstützt.

1. Erzeugung von telenzephalen glutamatergen Neuronen aus iPSCs
HINWEIS: Das detaillierte Protokoll zur Aufrechterhaltung von iPSCs und ihre Differenzierung in telenzephalische Glutamatergenneuronen ähneln denen, die zuvor18beschrieben wurden. Hierwird der kritische Prozess bei der Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen eingeführt und hervorgehoben.
<ol><li>Kultur iPSCs auf Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) Feedern in menschlichen embryonalen Stamm...

<ol>
	<li>Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+membranous+and+nonmembranous+cargoes:+a+unified+perspective.">Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective.</a> Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons.">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).</li><li>Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+trafficking+in+neurons.">Mitochondrial trafficking in neurons.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).</li><li>Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+of+mitochondria.">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).</li><li>Course, M. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+proper+fluorescent+dyes,+proteins,+and+imaging+techniques+to+study+mitochondrial+dynamics+in+mammalian+cells.">Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells.</a> Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).</li><li>Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mitochondrial+transport+in+neurons.">Characterization of mitochondrial transport in neurons.</a> Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).</li></ol>

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Analyse des mitochondrialen Transports und der Morphologie in neuronalen Axonen mit rotem Fluoreszenzfarbstoff und ImageJ-Software, die beide eine einzigartige Plattform zur Untersuchung der axonalen Degeneration und der mitochondrialen Morphologie bei neurodegenerativen Erkrankungen bieten. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll, einschließlich der Färbung von Mitochondrien, Live-Zell-Bildgebung, und die Analyse der Bilder. Bei dieser Methode wurde ein fluoreszierende...

Mitochondriale Beweglichkeit und Verteilung spielen eine entscheidende Rolle bei der Erfüllung variabler und spezialisierter energetischer Anforderungen in polarisierten Neuronen. Neuronen können extrem lange Axone verlängern, um sich durch die Bildung von Synapsen mit Zielen zu verbinden, die ein hohes Maß an Energie für Ca2+-Puffer- und Ionenströme erfordern. Der Transport von Mitochondrien von Soma zu Axon ist entscheidend für die Unterstützung der axonalen und synaptischen Funktion von Neuronen. Die räumlich und zeitlich dynamische mitochondriale Bewegung wird durch schnellen axonalen Transport mit Geschwindigkeiten von mehreren Mikrometern pro Sekunde1durchgeführt.
Insbesondere nehmen Motor- oder Adapterproteine wie Kinesin und Dynein am schnellen Organellentransport entlang von Mikrotubuli teil, um die Bewegung von Mitochondrien2,3zu steuern. Normale neuronale Aktivität erfordert einen ordnungsgemäßen Transport von neu zusammengesetzten Mitochondrien vom neuronalen Soma zum distalen Axon (anterograde axonaler Transport) und umgekehrten Transport von Mitochondrien vom distalen Axon zurück zum Zellkörper (retrograde Transport). Jüngste Studien haben gezeigt, dass unsachgemäße mitochondriale Zuordnung stark mit neuronalen Defekten und motorischen neuronen degenerativen Erkrankungen4,5verbunden ist. Daher ist es wichtig, Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Bewegung entlang von Axonen in lebenden Kulturen zu etablieren, um die Rolle der Mitochondrien bei der Neurodegeneration zu sezieren.
Es gibt zwei Hauptherausforderungen bei der Untersuchung und Analyse der Verfolgung von Mitochondrien: (1) Identifizierung von Mitochondrien aus dem Hintergrund in jedem Frame und (2) Analyse und Generierung der Verbindungen zwischen jedem Frame. Bei der Lösung der ersten Herausforderung wird ein Fluoreszenz-Etikettierungsansatz häufig verwendet, um Mitochondrien vom Hintergrund zu unterscheiden, wie MitoTracker-Farbstoff oder Transfektion von fluoreszenzgebundenem mitochondrialem Targeting-Protein (z. B. Mito-GFP)6,7,8. Um die Zuordnung zwischen Frames zu analysieren, wurden in früheren Studien9mehrere Algorithmen und Softwaretools beschrieben. In einem kürzlich erschienenen Papier verglichen die Forscher vier verschiedene automatisierte Werkzeuge (z. B. Volocity, Imaris, wrMTrck und Difference Tracker), um den mitochondrialen Transport zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigten, dass trotz Diskrepanzen in Gleislänge, mitochondrialer Verdrängung, Bewegungsdauer und Geschwindigkeit diese automatisierten Werkzeuge für die Bewertung der Transportdifferenz nach behandlung10geeignet sind. Zusätzlich zu diesen Tools wurde ein integriertes Plugin "Macros" für ImageJ (geschrieben von Rietdorf und Seitz) weit verbreitet für die Analyse des mitochondrialen Transports11verwendet. Diese Methode erzeugt Kymographen, die verwendet werden können, um mitochondriale Bewegungen zu analysieren, einschließlich der Geschwindigkeit sowohl in anterograde als auch in retrograde Richtungen.
Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die sich ständig in Anzahl und Morphologie als Reaktion auf physiologische und pathologische Bedingungen verändern. Mitochondriale Spaltspaltung und Fusion regulieren die mitochondriale Morphologie und Homöostase streng. Das Ungleichgewicht zwischen mitochondrialer Spaltspaltung und Fusion kann extrem kurze oder lange mitochondriale Netzwerke induzieren, die die mitochondriale Funktion beeinträchtigen und zu abnormalen neuronalen Aktivitäten und Neurodegeneration führen können. Beeinträchtigter mitochondrialer Transport und Morphologie sind an verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt, wie Alzheimer, Parkinson, Huntington und erbliche spastische Paraplegie (HSP)12,13,14,15. HSP ist eine heterogene Gruppe von vererbten neurologischen Erkrankungen, die durch die Degeneration des Kortikospinaltraktes und das anschließende Versagen bei der Kontrolle der unteren Gliedmaßenmuskulatur16,17gekennzeichnet sind. In dieser Studie werden iPSC-abgeleitete Vorhirn-Neuronen verwendet, um mitochondrialen Transport und Morphologie in HSP zu bewerten. Diese Methode bietet ein einzigartiges Paradigma für die Untersuchung der mitochondrialen Dynamik neuronaler Axone in lebenden Kulturen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 SERIES A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall Legend X1R/ 75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Chemiglass Life Sciences</td>
			<td>1760-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic AMP (cAMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#39;&#39; glass pipetes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-6274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker CMXRos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPle Serum-Free Supplement</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope IX83</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83-ZDC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41/ IX2-SLP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine))</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#956;m Millipore Express&#174; Plus Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 &#956;M PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr1 antibody (1:2000)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks (untreated)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugins for softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-formats Package</td>
			<td><a href="http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/" target="_blank">http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td><a href="https://fiji.sc/" target="_blank">https://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kymograph Plugin</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultipleKymograph.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultipleOverlay.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WalkingAverage.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackDifference.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straighten_.jar</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tsp050706.txt</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia

Neuronen haben intensive Anforderungen an hohe Energie, um ihre Funktionen zu unterstützen. Beeinträchtigter mitochondrialer Transport entlang von Axonen wurde bei menschlichen Neuronen beobachtet, die zur Neurodegeneration in verschiedenen Krankheitszuständen beitragen können. Obwohl es schwierig ist, die mitochondriale Dynamik in lebenden menschlichen Nerven zu untersuchen, sind solche Paradigmen entscheidend für die Untersuchung der Rolle von Mitochondrien bei der Neurodegeneration. Beschrieben hier ist ein Protokoll zur Analyse des mitochondrialen Transports und der mitochondrialen Morphologie in Vorhirn-Neuronaxonen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleitet wurden. Die iPSCs werden mit etablierten Methoden in telencephalische Glutamatergen-Neuronen unterschieden. Mitochondrien der Neuronen werden mit MitoTracker CMXRos gefärbt, und die mitochondriale Bewegung innerhalb der Axone wird mit einem Live-Zell-Bildgebungsmikroskop erfasst, das mit einem Inkubator für die Zellkultur ausgestattet ist. Zeitrafferbilder werden mit Software mit den Plugins "MultiKymograph", "Bioformat importer" und "Macros" analysiert. Kymographen des mitochondrialen Transports werden erzeugt, und die durchschnittliche mitochondriale Geschwindigkeit in anterograde und retrograde Richtungen wird aus dem Kymographen gelesen. In Bezug auf die mitochondriale Morphologieanalyse werden mit der Bildj die mitochondriale Länge, Fläche und das Seitenverhältnis ermittelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Charakterisierung des mitochondrialen Handels entlang von Axonen und die Analyse ihrer Morphologie ermöglicht, um Studien zu neurodegenerativen Erkrankungen zu erleichtern.

Hier wurden menschliche iPSCs in telencephalische Glutamaterge Neuronen unterschieden, die sich durch Immunfärbung mit Tbr1- und III-Tubulin-Markern auszeichneten (Abbildung 1A). Um den axonalen Transport von Mitochondrien zu untersuchen, wurden diese Zellen mit rotem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt, und es wurde eine Zeitraffer-Bildgebung durchgeführt. Da ImageJ leicht verfügbar und leichter zu erhalten ist, wurde der mitochondriale Transport mit den "MultiKymograph" und "...

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Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Beeinträchtigter mitochondrialer Transport und Morphologie sind an verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das vorgestellte Protokoll verwendet induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Vorhirn-Neuronen, um mitochondrialen Transport und Morphologie bei erblicher spastischer Paraplegie zu bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung des mitochondrialen Handels entlang von Axonen und die Analyse ihrer Morphologie, die das Studium neurodegenerativer Erkrankungen erleichtern wird.

Analyse von mitochondrialem Transport und Morphologie bei humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen bei erblicher spastischer Paraplegie

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Mitochondriale Dysfunktion liegt vielen neurodegenerativen Erkrankungen zugrunde. Unser Protokoll stellt ein wichtiges Instrument zur Untersuchung der mitochondrialen Dynamik in den Axonen bereit und erleichtert die Untersuchung neurologischer Erkrankungen mit axonaler Degeneration. Durch die Kombination von mitochondrialer Etikettierung, Live-Zell-Bildgebung und induzierter pluripotenter Stammzelltechnologie kann unser Protokoll verwendet werden, um den mitochondrialen Handel entlang menschlicher Axone zu charakterisieren und ihre Morphologien zu analysieren.Beeinträchtigter mitochondrialer Transport und Morphologie können in Stammzellkulturen und Tiermodellen neurodegenerativer Erkrankungen beobachtet werden, die potenzielle therapeutische Ziele für die Behandlung dieser Krankheiten bieten. Nach Tag fünfunddreißig der Kultur, dissoziieren Die Neurosphären von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in kleine Cluster mit 1 mg/ml Zellablösung für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius differenzieren. Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Zellcluster durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter NDM wieder auf.Platte etwa fünf Cluster von Zellen in hundert Mikroliter Medium pro Polyornithin und Lactose-Dehydrogenase erhöhen virusfreie reduzierten Wachstumsfaktor Keller Membran Matrix beschichtet 35 Millimeter GlasbodenSchalen. Dann fügen Sie einen Milliliter NDM mit B27, zyklischea Adenosin Monophosphat, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor, menschliche Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor und Gliazell abgeleitetneurotrophen Faktor zu jeder Kultur. Um Mitochondrien entlang der Axone von Vorhirn-Neuronen zu visualisieren, färben die Neuronen zuerst die Neuronen mit 50 nanomolarem roten Fluoreszenzfarbstoff enden in NDM für drei Minuten bei 37 Grad Celsius, gefolgt von zwei Washes in warmen NDM.Als nächstes stellen Sie die Kultur auf die Bühne eines Fluoreszenzmikroskops und wählen Sie das 40X-Objektiv aus. Unter dem Phasenfeld identifizieren Sie die Axone anhand ihrer morphologischen Eigenschaften. Um die Richtung der mitochondrialen Bewegung entlang der Axone klar zu unterscheiden, identifizieren Sie die Zellkörper von Neuronen deutlich.Nach der Unterscheidung des Zellkörpers und des Axons passen Sie die Belichtungszeit und den Fokus der Mitochondrien in den Axonen an und erfassen Sie den mitochondrialen Transport innerhalb der Axone alle fünf Sekunden für insgesamt fünf Minuten. Um den mitochondrialen Transport in ImageJ zu analysieren, öffnen Sie Fidschi und wählen Sie das Bio-Formats-Plugin. Verwenden Sie den Importvon Bio-Formats, um die Zeitrafferbilder der tiff-Serie zu importieren und standardmäßigimageJ und Open all series auszuwählen.Überprüfen Sie die automatische Skalierung von geteilten Kanälen, und klicken Sie auf OK, um die Framenummer und -größe der Bilder in Pixel nok zu notieren. Nachdem Sie die Helligkeit und den Kontrast für alle 60 Frames angepasst haben, verwenden Sie die segmentierte Linie, um eine Linie vom Zellkörper zum Terminalaxon zu zeichnen. Um den Kymograph zu generieren, wählen Sie das multiple Kymograph-Plugin und wählen Sie die Linienbreite aus.Zur Messung der Entfernung, Zeitwerte und Geschwindigkeit für die sich bewegenden Mitochondrien öffnen tsp050607. txt im Makro-Plugin. Und zeichnen Sie eine segmentierte Linie über die Spur der mitochondrialen Bewegung auf dem Kymographen von der überlegenen zur unteren Region.Nach dem Zeichnen der Linie öffnen Sie Lesegeschwindigkeiten aus TL im Makro-Plugin, um die segmentierten Geschwindigkeiten zu lesen, die der Linie entsprechen. Öffnen Sie anschließend das Originalbild, und verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie entlang der Maßstabsleiste zu zeichnen. Wählen Sie Analysieren aus, um die Länge der Linie zu messen, und konvertieren Sie jetzt den dx und die Entfernungseinheiten von Pixeln in Mikrometer.Ändern Sie dann die Zeit von Pixel zu Sekunden. Um die mitochondriale Länge und Fläche innerhalb von Axonen in ImageJ zu analysieren, installieren Sie das Begradigungsunterstrich-JAR-Plugin und öffnen Sie das Axon-Image von Interesse. Konvertieren Sie das 32-Bit-Bild in acht Bit, und verwenden Sie das segmentierte Linienwerkzeug, um das Axon zu verfolgen.Wählen Sie das STRAIGHTen Unterstrich JAR Plugin und legen Sie die Breite der Filament breite Linie auf 50 Pixel. Verfolgen Sie das Axon erneut, um ein begradigtes Axon zu erzeugen, und passen Sie den Bildschwellenwert an. Wählen Sie Set-Messungen analysieren, um Ellipsen und Formdeskriptoren anzupassen, um die Messung festzulegen, und verwenden Sie die Linienfunktion, um die Maßstabsleiste im Originalbild wie gezeigt zu messen.Geben Sie unter Analysieren und Festlegen der Skala den Abstand in pixelbekannten Abstand und die Längeneinheit ein, um die Skala festzulegen. Wählen Sie dann global aus, um die Skalierungseinstellung auf alle Bilder festzulegen. Wählen Sie schließlich Analysieren und Analysieren von Partikeln aus, um den Bereich zu bestimmen, und wählen Sie Anzeigeergebnisse aus, um die resultierende Messung anzuzeigen.Nach der Differenzierung in telenzephalische glutamaterge Neuronen können die Zellen durch ihre T-B-R ein und beta drei Tubulin Marker Expression gekennzeichnet werden. Die Färbung mit rotem Fluoreszenzfarbstoff und die Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Auswertung des axonalen Transports von Mitochondrien. Ein einzelnes Mitochondrion kann statisch bleiben oder sich in anterograder oder retrograder Richtung innerhalb eines Axons bewegen.Die Geschwindigkeit der mitochondrialen Bewegung entlang des Axons kann wie dargestellt quantifiziert werden. Zum Beispiel mit kommerziell erhältlichen Analyse-Software ist der Prozentsatz der motilen Mitochondrien deutlich reduziert in S-P-G-3-A Neuronen im Vergleich zu wilden Typ Neuronen. Zur Analyse der mitochondrialen Flächenlänge und des Seitenverhältnisses können Axone in der Bildanalysesoftware begradigt und durch Anpassen des Schwellenwerts ausgewählt werden.Die mitochondriale Flächenumfangsbreite und das Seitenverhältnis können dann aus dem begradigten Axon gewonnen werden. Zum Beispiel sind sowohl die mitochondriale Länge als auch das Seitenverhältnis in S-P-G 15 Neuronaxonen im Vergleich zu Wild-Typ-Axonen signifikant reduziert. Es ist wichtig, das Medium und den Mikroskop-Inkubator zu erwärmen, um die Zellen sanft zu waschen und die Zellen vor der Bildgebung für zwanzig Minuten stabilisieren zu lassen.Nach der Live-Zell-Bildgebung können die Kulturen fixiert und immunstainiert werden, um die Expression anderer Proteine von Interesse zu untersuchen. Es ist eine Herausforderung, die mitochondriale Dynamik in lebenden menschlichen Nerven zu untersuchen. Diese Technik bietet das einzigartige Werkzeug für die Untersuchung der mitochondrialen Dynamik und Nervendegeneration bei neurologischen Erkrankungen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Forschung

Neurowissenschaften

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellierung der Zika-Virus-Infektion des entwickelnden menschlichen Gehirns In Vitro mit Stammzellen abgeleitet zerebrale Organellen

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Unterteilung menschlicher Stammzellen-abgeleiteter Neuronen in vormontierte Mikrofluidchips aus Kunststoff

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-Differenzierung Replating von Human Pluripotent Stem Cell abgeleiteten Neuronen für High-Content Screening von Neuritogenese und Synapse Reifung

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...