Name: analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia
Uploaded: 2020-02-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia at JoVE.com

이 작품은 경련 하반신 마비 재단, 블레이저 재단과 NIH (R21NS109837)에 의해 지원되었다.

1. iPSCs에서 텔렌세팔성 글루타마티터지뉴런 생성
참고: iPSCs를 유지하기 위한 상세한 프로토콜과 텔렌세팔산 글루탐매터기뉴런으로의 분화는 앞서설명한 18과유사하다. 여기서, 인간 다능성 줄기 세포의 분화 동안 중요한 과정이 도입되고 강조된다.
<ol><li>마우스 배아 섬유아세포(MEF) 피더에 대한 배양 iPSCs는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 배지에서 섬유아세포 ...

<ol>
	<li>Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+membranous+and+nonmembranous+cargoes:+a+unified+perspective.">Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective.</a> Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons.">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).</li><li>Schwarz, T. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+of+mitochondria.">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).</li><li>Course, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+axonal+defects+by+targeting+mitochondrial+dynamics+in+hereditary+spastic+paraplegias.">Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias.</a> Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photostable+naphthalimide-based+fluorescent+probe+for+mitochondrial+imaging+and+tracking.">New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).</li><li>Carvalho, P. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+Tracker:+ImageJ+plugins+for+fully+automated+analysis+of+multiple+axonal+transport+parameters.">Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).</li><li>Reis, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motor+function+in+axonal+transport+in+vivo+probed+by+genetic+and+computational+analysis+in+Drosophila.">Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).</li><li>Broeke, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+of+cellular+traffic+in+living+cells.">Automated quantification of cellular traffic in living cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).</li><li>Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy.</a> Autophagy. 12, 1 (2016).</li><li>Metivier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofluorometric+detection+of+mitochondrial+alterations+in+early+CD95/Fas/APO-1-triggered+apoptosis+of+Jurkat+T+lymphoma+cells.+Comparison+of+seven+mitochondrion-specific+fluorochromes.">Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes.</a> Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+proper+fluorescent+dyes,+proteins,+and+imaging+techniques+to+study+mitochondrial+dynamics+in+mammalian+cells.">Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells.</a> Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).</li><li>Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mitochondrial+transport+in+neurons.">Characterization of mitochondrial transport in neurons.</a> Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).</li></ol>

이 기사에서는 적색 형광 염료 및 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 뉴런 축색의 미토콘드리아 수송 및 형태를 분석하는 방법을 설명하며, 둘 다 신경 퇴행성 질환에서 축사 변성 및 미토콘드리아 형태를 연구하는 독특한 플랫폼을 제공합니다. 프로토콜에는 미토콘드리아의 염색, 살아있는 세포 화상 진찰 및 심상 분석을 포함하여 몇몇 중요한 단계가 있습니다. 이 방법에서는, 형광 염료를 미토콘드?...

미토콘드리아 운동성 및 분포는 편광 뉴런의 가변적이고 전문적인 에너지 요구를 충족시키는 데 중요한 역할을 합니다. 뉴런은 Ca2+ 버퍼링 및 이온 전류에 대한 높은 수준의 에너지를 요구하는 시냅스의 형성을 통해 표적과 연결하기 위해 매우 긴 축세포를 확장할 수 있습니다. 소마에서 축종으로미토콘드리아를 운반하는 것은 뉴런의 축축및 시냅스 기능을 지원하는 데 매우 중요합니다. 공간적 및 시간적으로 동적 미토콘드리아 운동은 초당 수 마이크로미터의 속도로 빠른 축색 수송에 의해 수행됩니다1.
구체적으로, 운동 또는 어댑터 단백질, 예컨대 키네신 및 다인, 미토콘드리아2,3의움직임을 조절하기 위해 마이크로소튜플을 따라 빠른 소기관 수송에 참여한다. 정상적인 신경 활동은 뉴런 소마에서 말단 축종 (전방 축색 수송)으로 새로 조립 된 미토콘드리아의 적절한 수송을 필요로하고 원위 축사에서 다시 세포체로 미토콘드리아의 역수송 (역행 수송). 최근 연구에 따르면 부적절한 미토콘드리아 할당은 신경 성 결함 및 운동 신경 퇴행성 질환4,5와강하게 연관되어 있음을 나타냈다. 따라서, 신경 변성에서 미토콘드리아의 역할을 해부하기 위해, 살아있는 문화에서 축색을 따라 미토콘드리아 운동을 검사하는 방법을 확립하는 것이 중요합니다.
미토콘드리아의 추적을 검사하고 분석하는 데는 두 가지 주요 과제가 있습니다: (1) 모든 프레임의 배경에서 미토콘드리아를 식별하고, (2) 모든 프레임 간의 연결을 분석하고 생성합니다. 제1 과제를 해결하기 위해, 형광 표지 접근법은 미토콘드리아염 또는 형광 융합 미토콘드리아 표적단백질(예를 들어, 미토콘드리아 표적화 단백질)의 형광-융합 미토콘드리아 표적화 단백질(예를 들어, 미토-GFP)의 백질과 같은 배경으로부터 미토콘드리아를 구별하기 위해 널리 사용된다(예를 들어, 미토콘드리아 표적화)6,7,8. 프레임 간의 연관성을 분석하기 위해 이전 연구9에서여러 알고리즘 및 소프트웨어 도구가 설명되었습니다. 최근 논문에서 연구원들은 4개의 다른 자동화 도구(예: Volocity, Imaris, wrMTrck 및 차이 추적기)를 비교하여 미토콘드리아 수송을 정량화했습니다. 결과는 트랙 길이, 미토콘드리아 변위, 이동 지속 시간 및 속도의 불일치에도 불구하고, 이러한 자동화된 도구는 치료 후 수송 차이를 평가하기에 적합하다는 것을 보여주었다10. 이러한 도구 외에도 ImageJ용 통합 플러그인 "매크로"(Rietdorf 및 Seitz가 작성)는 미토콘드리아전송(11)을분석하는 데 널리 사용되어 왔다. 이 방법은 미토콘드리아 운동을 분석하는 데 사용할 수있는 척추 그래프를 생성, 전위 및 역행 방향 모두에서 속도를 포함.
미토콘드리아는 생리적 및 병리학적 조건에 반응하여 수와 형태학이 끊임없이 변화하는 매우 역동적인 세포기관입니다. 미토콘드리아 분열과 융합은 미토콘드리아 형태와 항상성을 엄격하게 조절합니다. 미토콘드리아 핵분열과 융합 사이의 불균형은 미토콘드리아 기능을 손상시키고 비정상적인 신경 활동과 신경 변성을 초래할 수 있는 매우 짧거나 긴 미토콘드리아 네트워크를 유도할 수 있습니다. 미토콘드리아 수송 및 형태학 장애는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 유전적 경련 하반신마비(HSP)12,13,14,15와 같은 다양한 신경퇴행성 질환에 관여한다. HSP는 코르티코척추의 변성 및 하반신 근육을 조절하는 후속 실패를 특징으로 하는 상속된 신경 장애의 이질적인그룹(16,17)이다. 이 연구에서는, iPSC 파생 된 전뇌 뉴런은 HSP에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하는 데 사용됩니다. 이 방법은 살아있는 문화에서 뉴런 축색의 미토콘드리아 역학을 검사하기위한 독특한 패러다임을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 SERIES A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall Legend X1R/ 75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Chemiglass Life Sciences</td>
			<td>1760-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic AMP (cAMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#39;&#39; glass pipetes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-6274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker CMXRos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPle Serum-Free Supplement</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope IX83</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83-ZDC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41/ IX2-SLP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine))</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#956;m Millipore Express&#174; Plus Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 &#956;M PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr1 antibody (1:2000)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks (untreated)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugins for softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-formats Package</td>
			<td><a href="http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/" target="_blank">http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td><a href="https://fiji.sc/" target="_blank">https://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kymograph Plugin</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultipleKymograph.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultipleOverlay.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WalkingAverage.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackDifference.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straighten_.jar</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tsp050706.txt</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia

뉴런은 그들의 기능을 지원 하기 위해 높은 에너지에 대 한 강렬한 요구. 축 세포를 따라 손상 된 미토 콘 드리 아 수송 인간의 신경에서 관찰 되었습니다., 다양 한 질병 상태에서 신경 변성에 기여할 수 있는. 살아있는 인간 신경에 있는 미토콘드리아 역학을 검토하는 것은 도전적이더라도, 그 같은 패러다임은 신경 변성에서 미토콘드리아의 역할을 공부하기 를 위해 중요합니다. 여기서 기재된 것은 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)로부터 유래된 전뇌 뉴런 축에서 미토콘드리아 수송 및 미토콘드리아 형태를 분석하기 위한 프로토콜이다. iPSCs는 잘 확립된 방법을 사용하여 텔렌세팔산 글루탐생성 뉴런으로 분화됩니다. 뉴런의 미토콘드리아는 미토트래커 CMXRos로 염색되고, 축색내미토콘드리아 운동은 세포 배양을 위한 인큐베이터가 장착된 살아있는 세포 이미징 현미경을 사용하여 포획된다. 시간 경과 이미지는 "MultiKymograph", "바이오 포맷 수입기", "매크로"플러그인소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 미토콘드리아 수송의 척추 그래프가 생성되고, 전위 및 역행 방향의 평균 미토콘드리아 속도가 kymograph에서 읽습니다. 미토콘드리아 형태 분석에 관해서는, 미토콘드리아 길이, 면적 및 종횡비는 ImageJ를 사용하여 얻어진다. 요약하면,이 프로토콜은 축삭을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화및 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하기 위해 자신의 형태학의 분석을 할 수 있습니다.

여기서, 인간 iPSCs는 텔렌세팔산 글루타마티터지뉴런으로 분화되었고, 이는 Tbr1 및 βIII 튜불린 마커로 면역염색을 특징으로하였다(도 1A). 미토콘드리아의 축색 수송을 검사하기 위해, 이들 세포는 적색 형광 염료로 염색되었고, 시간 경과 이미징을 수행하였다. ImageJ는 쉽게 사용할 수 있고 쉽게 얻을 수 있기 때문에, 미토콘드리아 수송은 그림 1?...

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Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

손상된 미토콘드리아 수송 및 형태는 각종 신경 퇴행성 질환에 관여합니다. 제시된 프로토콜은 유전 경직 성 하반신 마비에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하기 위해 유도 된 다능성 줄기 세포 유래 전뇌 뉴런을 사용합니다. 이 프로토콜은 축축을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화와 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하는 형태학의 분석을 허용합니다.

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

미토콘드리아 기능 장애는 많은 신경 퇴행성 질환의 근간을 이복합니다. 우리의 프로토콜은 축산기의 미토콘드리아 역학을 검사하기 위한 중요한 도구를 제공하여 축산 변성을 수반하는 신경 질환연구를 용이하게 합니다. 미토콘드리아 라벨링, 라이브 세포 이미징 및 유도된 다능성 줄기 세포 기술을 결합하여 우리의 프로토콜은 인간 축축을 따라 미토콘드리아 인신 매매를 특성화하고 그들의 형태를 분석하는 데 사용될 수 있습니다.손상된 미토콘드리아 수송 및 형태는 줄기 세포 배양 및 이러한 질환 치료에 대한 잠재적 인 치료 목표를 제공하는 신경 퇴행성 질환의 동물 모델에서 관찰 될 수 있습니다. 문화의 35일 후에, 인간 유도한 다능성 줄기 세포에서 분화된 신경구를 37°C에서 2분 동안 1 mg/ml의 세포 분리 용액으로 작은 군집으로 해리합니다. 인큐베이션의 끝에서 원심분리에 의해 세포 클러스터를 수집하고 NDM의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다.폴리오니틴 과 유당 탈수소 효소 100 마이크로리터에 약 5개의 세포 클러스터를 플레이트하여 바이러스가 없는 감소된 성장인자 지하 막 매트릭스코팅 35mm 유리 바닥 접시. 그런 다음 B27, 순환 아데노신 모노인산염, 인슐린 과 같은 성장 인자, 인간 뇌 유래 신경 영양인 및 각 배양에 신경 세포 유래 신경 영양계인으로 보충된 NDM의 1밀리리터를 추가합니다. 선뇌 뉴런의 축축을 따라 미토콘드리아를 시각화하기 위해 NDM에서 37도에서 3분 동안 50나노몰러 적색 형광염으로 뉴런을 먼저 얼룩지게 하고 따뜻한 NDM에서 2개의 세차스를 넣습니다.다음으로, 형광 현미경의 단계에 문화를 배치하고 40X 목표를 선택합니다. 위상 필드에서 그들의 형태학적 특성에 따라 축축을 식별합니다. 축축을 따라 미토콘드리아 운동의 방향을 구별하기 위해 뉴런의 세포 체를 명확하게 식별한다.세포 체와 축축을 구별한 후 축선에서 미토콘드리아의 노출 시간과 초점을 조정하고 총 5분 동안 5초마다 축산 내의 미토콘드리아 수송을 포착한다. ImageJ 오픈 피지에서 미토콘드리아 수송을 분석하고 바이오 포맷 플러그인을 선택합니다. 바이오 포맷 가져오기를 사용하여 티프 시리즈의 타임랩스 이미지를 가져오고 표준 ImageJ 및 모든 계열을 엽니다.자동 배율 분할 채널을 확인하고 확인을 클릭하여 픽셀단위로 이미지의 프레임 수와 크기를 기록합니다. 모든 60 프레임에 대한 밝기와 대비를 조정한 후 분할된 라인을 사용하여 셀 바디에서 단자 축슨으로 선을 그립니다. Kymograph를 생성하려면 여러 Kymograph 플러그인을 선택하고 라인 너비를 선택합니다.움직이는 미토콘드리아 오픈 tsp050607의 거리, 시간 값 및 속도를 측정합니다. 매크로 플러그인에 txt. 그리고 열등한 부위로부터 키모그래프상미토콘드리아 운동의 흔적 위에 분할된 선을 그립니다.선을 연 후 매크로 플러그인의 tsp에서 속도를 읽고 라인에 해당하는 분할 된 속도를 읽습니다. 다음은 원본 이미지를 열고 선 도구를 사용하여 배율 막대를 따라 선을 그립니다. 분석을 선택하여 선의 길이를 측정하고 현재 DX와 픽셀에서 마이크로미터까지 의 거리 단위를 변환합니다.그런 다음 시간을 픽셀에서 초로 변경합니다. ImageJ에서 축축물 내의 미토콘드리아 길이 및 면적을 분석하려면 스트레이트 밑점 점 JAR 플러그인을 설치하고 축슨 이미지를 열어 관심 있는 이미지를 엽니다. 32비트 이미지를 8비트로 변환하고 분할된 선 도구를 사용하여 축축을 추적합니다.스트레이트엔 밑줄 JAR 플러그인을 선택하고 필라멘트 와이드 라인의 너비를 50픽셀로 설정합니다. 축축을 다시 추적하여 곧게 펴진 축축을 생성하고 이미지 임계값을 조정합니다. 세트 측정을 분석경계에 맞는 타원과 형상 설명자를 선택하여 측정값을 설정하고 라인 함수를 사용하여 원래 이미지의 스케일 막대를 측정합니다.분석 하 고 설정 하는 스케일픽셀 알려진 거리와 길이 단위로 거리를 입력 하여 스케일을 설정 합니다. 그런 다음 전역을 선택하여 모든 이미지로 스케일 설정을 설정합니다. 마지막으로 입자 를 분석하고 분석하여 영역을 결정하고 디스플레이 결과를 선택하여 결과 측정을 봅니다.텔뇌스팔릭 글루타미테르기스 뉴런으로 분화한 후 세포는 T-B-R 1 및 베타 3tubulin 마커 발현을 특징으로 할 수 있다. 적색 형광염과 시간 경과 이미징으로 염색하면 미토콘드리아의 축산 운송을 평가할 수 있습니다. 단일 미토콘드리온은 축록소 내에서 정전기를 유지하거나 전방 또는 역행 방향으로 이동할 수 있습니다.축축을 따라 미토콘드리아 운동의 속도는 도시된 바와 같이 정량화될 수 있다. 예를 들어 상업적으로 이용 가능한 분석 소프트웨어를 사용하여 용이성 미토콘드리아의 백분율은 야생 형 뉴런에 비해 S-P-G-3-A 뉴런에서 현저히 감소된다. 미토콘드리아 영역 길이 및 종횡비 축축을 분석하기 위해 이미지 분석 소프트웨어에서 바로펴고 임계값을 조정하여 선택할 수 있다.미토콘드리아 영역 둘레 길이 폭 및 종횡비는 곧게 펴진 축축으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어 미토콘드리아 길이와 종횡비는 대조군 야생형 축축에 비해 S-P-G 15 뉴런 축록에서 현저히 감소된다. 매체와 현미경 인큐베이터를 따뜻하게 하여 세포를 부드럽게 씻고 세포가 이미징 전에 20 분 동안 안정되도록하는 것이 중요합니다.살아있는 세포 화상 진찰 후에 배양은 관심있는 그밖 단백질의 발현을 검토하기 위하여 면역 염색을 고정식하고 복종할 수 있습니다. 살아있는 인간 신경에서 미토콘드리아 역학을 검사하는 것은 도전적입니다. 이 기술은 신경 질환의 미토콘드리아 역학 및 신경 변성의 연구를위한 독특한 도구를 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

연구

신경과학

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩 내에서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 구획화

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...