Name: analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia
Uploaded: 2020-02-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia at JoVE.com

Эта работа была поддержана Фондом Спастик Параплегия, Фондом Блейзера и NIH (R21NS109837).

1. Поколение теленецефалических глутаматергических нейронов от iPSCs
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол для поддержания iPSCs и их дифференциации в теленецефалических глутамергических нейронов аналогичны описанным ранее18. Здесь вводится и подчеркивается критичес?...

<ol>
	<li>Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+membranous+and+nonmembranous+cargoes:+a+unified+perspective.">Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective.</a> Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons.">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).</li><li>Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+trafficking+in+neurons.">Mitochondrial trafficking in neurons.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).</li><li>Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+of+mitochondria.">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).</li><li>Course, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+Mitochondrial+Transport+in+Neurons.">Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons.</a> Neuromethods. 123, 49-66 (2017).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+mitochondria+with+fluorescent+dyes+for+imaging.">Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+Mitochondrial+Movement+Within+Neurons:+Manual+Versus+Automated+Tracking+Methods.">Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods.</a> Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).</li><li>Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+biogenesis,+defective+axonal+transport+of+mitochondria,+abnormal+mitochondrial+dynamics+and+synaptic+degeneration+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).</li><li>Denton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+dynamics+underlie+axonal+defects+in+hereditary+spastic+paraplegias.">Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias.</a> Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).</li><li>Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parkinsonian+mimetic,+MPP+,+specifically+impairs+mitochondrial+transport+in+dopamine+axons.">The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).</li><li>Shirendeb, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+huntingtin's+interaction+with+mitochondrial+protein+Drp1+impairs+mitochondrial+biogenesis+and+causes+defective+axonal+transport+and+synaptic+degeneration+in+Huntington's+disease.">Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease.</a> Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).</li><li>Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia:+clinical-genetic+characteristics+and+evolving+molecular+mechanisms.">Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms.</a> Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).</li><li>Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+of+hereditary+spastic+paraplegia.">Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia.</a> Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).</li><li>Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+rescue+of+axon+growth+defects+in+a+human+iPSC+model+of+hereditary+spastic+paraplegia+SPG3A.">Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).</li><li>Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Time-Lapse+Imaging+in+the+Zebrafish+Lateral+Line:+A+Flexible,+Open-Ended+Research+Project+for+an+Undergraduate+Neurobiology+Laboratory+Course.">In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).</li><li>Kang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docking+of+axonal+mitochondria+by+syntaphilin+controls+their+mobility+and+affects+short-term+facilitation.">Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation.</a> Cell. 132 (1), 137-148 (2008).</li><li>Mou, Y., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+axonal+defects+by+targeting+mitochondrial+dynamics+in+hereditary+spastic+paraplegias.">Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias.</a> Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photostable+naphthalimide-based+fluorescent+probe+for+mitochondrial+imaging+and+tracking.">New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).</li><li>Carvalho, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+benzothiadiazole+fluorophores+for+selective+mitochondrial+imaging+and+dynamics.">Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics.</a> Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).</li><li>Yamakoshi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+Raman+probe+based+on+bisarylbutadiyne+for+live+cell+imaging+of+mitochondria.">A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).</li><li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoAnalyzer:+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons.">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantifying+mitochondrial+axonal+transport.">A new method for quantifying mitochondrial axonal transport.</a> Protein &amp; Cell. 7 (11), 804-819 (2016).</li><li>De Vos, K. J., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+mitochondrial+dynamics+in+living+animal+cells.">Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells.</a> Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).</li><li>Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Axonal+Phenotypes+with+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).</li><li>Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+Tracker:+ImageJ+plugins+for+fully+automated+analysis+of+multiple+axonal+transport+parameters.">Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).</li><li>Reis, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motor+function+in+axonal+transport+in+vivo+probed+by+genetic+and+computational+analysis+in+Drosophila.">Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).</li><li>Broeke, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+of+cellular+traffic+in+living+cells.">Automated quantification of cellular traffic in living cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).</li><li>Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+robust+method+for+automated+analysis+of+axonal+transport.">A fast and robust method for automated analysis of axonal transport.</a> European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).</li><li>Mukherjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+kymograph+analysis+for+profiling+axonal+transport+of+secretory+granules.">Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules.</a> Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy.</a> Autophagy. 12, 1 (2016).</li><li>Metivier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofluorometric+detection+of+mitochondrial+alterations+in+early+CD95/Fas/APO-1-triggered+apoptosis+of+Jurkat+T+lymphoma+cells.+Comparison+of+seven+mitochondrion-specific+fluorochromes.">Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes.</a> Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+proper+fluorescent+dyes,+proteins,+and+imaging+techniques+to+study+mitochondrial+dynamics+in+mammalian+cells.">Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells.</a> Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).</li><li>Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mitochondrial+transport+in+neurons.">Characterization of mitochondrial transport in neurons.</a> Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).</li></ol>

В этой статье описывается метод анализа митохондриального транспорта и морфологии в нейрональных аксонах с использованием красного флуоресцентного красителя и программного обеспечения ImageJ, оба из которых обеспечивают уникальную платформу для изучения аксональной дегенерации и мит...

Митохондриальная подвижность и распределение играют жизненно важную роль в выполнении переменных и специализированных энергетических требований в поляризованных нейронах. Нейроны могут расширять очень длинные аксоны, чтобы соединиться с целями через образование синапсов, которые требуют высоких уровней энергии для буферизации Ca2 и ионных токов. Перенос митохондрий от сомы к аксону имеет решающее значение для поддержки аксональной и синаптической функции нейронов. Пространственно и временно динамическое митохондриальное движение осуществляется быстрым аксональным транспортом со скоростью несколько микрометров всекунду 1.
В частности, моторные или адаптерные белки, такие как кинезин и динейн, участвуют в быстром переносе органелл ы вдоль микротрубок, чтобы контролировать движение митохондрий2,3. Нормальная нейрональная активность требует надлежащей транспортировки вновь собранных митохондрий от нейрональной сомы к дистальной аксон (антероградный аксональный транспорт) и обратной транспортировки митохондрий из дистального аксона обратно в клеточное тело (ретроградный транспорт). Недавние исследования показали, что неправильное распределение митохондрий тесно связано с дефектами нейронов и двигательных нейронных дегенеративных заболеваний4,5. Поэтому, чтобы вскрыть роль митохондрий в нейродегенерации, важно установить методы изучения митохондриального движения вдоль аксонов в живых культурах.
Существует две основные проблемы в изучении и анализе отслеживания митохондрий: (1) выявление митохондрий от фона в каждом кадре, и (2) анализ и генерация связей между каждым кадром. При решении первой задачи широко используется подход к маркировке флуоресценции для разграничения митохондрий от фона, таких как краситель MitoTracker или трансфекция флуоресценции, слитого митохондриального прицеливания белка (например, мито-ГФП)6,7,8. Для анализа связи между кадрами, несколько алгоритмов и программных средств были описаны в предыдущих исследованиях9. В недавней работе исследователи сравнили четыре различных автоматизированных инструмента (например, Volocity, Imaris, wrMTrck и Difference Tracker) для количественной оценки митохондриального транспорта. Результаты показали, что, несмотря на расхождения в длине трека, митохондриальной смещения, продолжительности движения и скорости, эти автоматизированные инструменты подходят для оценки разницы в транспортировке после обработки10. В дополнение к этим инструментам, интегрированный плагин "Macros" для ImageJ (написано Rietdorf и Seitz) широко используется для анализа митохондриального транспорта11. Этот метод генерирует kymographs, которые могут быть использованы для анализа митохондриальных движений, в том числе скорости как в антероградных и ретроградных направлениях.
Митохондрии являются высокодинамическими органеллами, которые постоянно меняются в численности и морфологии в ответ как на физиологические, так и на патологические состояния. Митохондриальная расщепление и слияние жестко регулируют митохондриальную морфологию и гомеостаз. Дисбаланс между митохондриальным делением и слиянием может вызвать чрезвычайно короткие или длинные митохондриальные сети, которые могут ухудшить митохондриальную функцию и привести к аномальной нейронной деятельности и нейродегенерации. Нарушение митохондриального транспорта и морфологии участвуют в различных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, и наследственной спастической параплегии (HSP)12,13,14,15. HSP является неоднородной группой наследственных неврологических расстройств, характеризующихся дегенерацией кортикоспинального тракта и последующей неспособностью контролировать мышцы нижних конечностей16,17. В этом исследовании, iPSC полученных предмозг нейронов используются для оценки митохондриального транспорта и морфологии в HSP. Этот метод обеспечивает уникальную парадигму для изучения митохондриальной динамики нейрональных аксонов в живых культурах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 SERIES A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall Legend X1R/ 75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Chemiglass Life Sciences</td>
			<td>1760-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic AMP (cAMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#39;&#39; glass pipetes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-6274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker CMXRos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPle Serum-Free Supplement</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope IX83</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83-ZDC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41/ IX2-SLP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine))</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#956;m Millipore Express&#174; Plus Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 &#956;M PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr1 antibody (1:2000)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks (untreated)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugins for softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-formats Package</td>
			<td><a href="http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/" target="_blank">http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td><a href="https://fiji.sc/" target="_blank">https://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kymograph Plugin</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultipleKymograph.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultipleOverlay.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WalkingAverage.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackDifference.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straighten_.jar</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tsp050706.txt</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia

Нейроны имеют интенсивные потребности в высокой энергии для того, чтобы поддерживать свои функции. Нарушение митохондриального переноса вдоль аксонов наблюдается в человеческих нейронов, которые могут способствовать нейродегенерации в различных состояниях болезни. Хотя это сложно изучить митохондриальной динамики в живых человеческих нервов, такие парадигмы имеют решающее значение для изучения роли митохондрий в нейродегенерации. Описано здесь протокол для анализа митохондриального транспорта и митохондриальной морфологии в аксонах нейронов предмозга, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). IPSCs дифференцированы в теленецефалические глутаметергические нейроны с использованием устоявшихся методов. Митохондрии нейронов окрашены MitoTracker CMXRos, а митохондриальные движения в аксонах фиксируются с помощью живого изображения микроскопа, оснащенного инкубатором для клеточной культуры. Изображения замедленного анализа анализируются с помощью программного обеспечения с помощью плагинов "MultiKymograph", "Bioformat importer" и "Macros". Сгенерированы гирографы митохондриального транспорта, а средняя митохондриальная скорость в антероградских и ретроградных направлениях считывается с кимографа. Что касается анализа митохондриальной морфологии, митохондриальной длины, области и соотношения сторон получаются с помощью ImageJ. Таким образом, этот протокол позволяет охарактеризовать митохондриальный оборот вдоль аксонов и анализ их морфологии для облегчения исследований нейродегенеративных заболеваний.

Здесь, человека iPSCs были дифференцированы в теленецефалических глутамерных нейронов, которые были разработаны иммуно-пятно с Tbr1 и III тубулина маркеров (Рисунок 1A). Для изучения аксонального переноса митохондрий эти клетки были окрашены красным флуоресцентным ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia at JoVE.com

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Нарушение митохондриального транспорта и морфологии участвуют в различных нейродегенеративных заболеваний. Представленный протокол использует индуцированные плюрипотентные стволовые клетки полученных нейронов мозга для оценки митохондриального транспорта и морфологии в наследственной спастической параплегии. Этот протокол позволяет охарактеризовать митохондрийный оборот по аксонам и анализ их морфологии, что облегчит изучение нейродегенеративных заболеваний.

Анализ митохондриального транспорта и морфологии в антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронов в наследственной спастической параплегии

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Митохондриальная дисфункция лежит в основе многих нейродегенеративных заболеваний. Наш протокол является важным инструментом для изучения митохондриальной динамики в аксонах, облегчая изучение неврологических заболеваний, связанных с аксональной дегенерацией. Комбинируя митохондриальную маркировку, живую клеточную визуализацию и индуцированную плюрипотентную технологию стволовых клеток, наш протокол может быть использован для характеристики митохондриальной торговли вдоль человеческих аксонов и для анализа их морфологий.Нарушение митохондриального транспорта и морфологии можно наблюдать в культурах стволовых клеток и животных моделях нейродегенеративных заболеваний, обеспечивающих потенциальные терапевтические цели для лечения этих заболеваний. После дня тридцать пять культуры, разъедижевать нейросферы дифференцированы от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в небольших кластеров с 1 мг / мл клеточного раствора отряда в течение двух минут при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации собирайте клеточные кластеры путем центрифугации и повторно посовекуйте гранулы в один миллилитр NDM.Плита около пяти кластеров клеток в сто микролитров среднего на полиорнитин и лактозы дегидрогеназы подъема вирус-бесплатно снижение фактора роста мембраны мембраны матрицы покрыты 35 миллиметров стеклянной нижней посуды. Затем добавьте один миллилитр NDM, дополненный B27, циклическим аденозин-монофосфатом, инсулиноподобным фактором роста, нейротрофическим фактором, полученным мозгом человека, и нейротрофическим фактором, полученным из глиальных клеток, к каждой культуре. Чтобы визуализировать митохондрии вдоль аксонов нейронов forebrain первый пятно нейронов с 50 наномолярного красного флуоресцентного красителя в NDM в течение трех минут при 37 градусов по Цельсию, а затем два моет в теплой NDM.Далее поместите культуру на сцену флуоресцентный микроскоп и выберите цель 40X. Под фазово-полем идентифицируют аксоны на основе их морфологических характеристик. Для различения направления митохондриального движения вдоль аксонов четко идентифицируются клеточные тела нейронов.После различения клеточного тела и аксона корректировать время экспозиции и фокус митохондрий в аксонах и захватывать митохондриальный транспорт в аксонах каждые пять секунд в общей сложности пять минут. Для анализа митохондриального транспорта в ImageJ откройте Фиджи и выберите плагин Bio-Formats. Используйте импортера Bio-Formats для импорта временных изображений серии tiff и выбора стандартных ImageJ и Open всех серий.Проверьте автоматические раздельные каналы и нажмите OK, чтобы отметить количество кадров и размер изображений в пикселях. После регулировки яркости и контрастности для всех 60 кадров используйте сегментированную линию, чтобы провести линию от тела ячейки до терминального аксона. Для создания Kymograph выберите несколько плагинов Kymograph и выберите ширину линии.Для измерения расстояния, значений времени и скорости для движущихся митохондрий откройте tsp050607. txt в плагине макросов. И нарисуйте сегментированную линию над следом митохондриального движения на кимографе от начальника к низшей области.После рисования линии открыты скорости чтения из чайной ложки в плагине макросов, чтобы прочитать сегментированные скорости, соответствующие линии. Затем откройте исходное изображение и используйте линейный инструмент, чтобы нарисовать линию вдоль бара масштаба. Выберите анализ для измерения длины линии и преобразования dx сейчас и единиц расстояния от пикселей до микрометров.Затем измените время от пикселя к секундам. Для анализа митохондриальной длины и области в аксонах в ImageJ установите выпрямительную точку плагина JAR и откройте интересное изображение аксона. Преобразуй 32-битное изображение в восемь битов и используйте инструмент сегментированных линий для отслеживания аксона.Выберите плагин Straighten underscore JAR и установите ширину линии шириной нити до 50 пикселей. Отслеживайте аксон снова, чтобы создать выпрямленный аксон и настроить порог изображения. Выберите анализ набора измерений периметра подходят эллипсы и формы дескрипторов для настройки измерения и использовать функцию линии для измерения шкалы бар в исходном изображении, как попродемонстрировано.При анализе и настройке шкалы введите расстояние в пикселях известное расстояние и единицу длины для настройки шкалы. Затем выберите глобальную, чтобы установить параметр масштаба для всех изображений. Наконец, выберите анализ и анализ частиц для определения области и выбора результатов отображения для просмотра полученного измерения.После дифференциации в теленцефалических глутаматергических нейронов клетки могут быть охарактеризованы их T-B-R один и бета три тубулина маркер выражения. Окрашивание красным флуоресцентным красителем и покадровая визуализация позволяют оценку аксонального транспорта митохондрий. Один митохондрион может оставаться статичным или двигаться в антероградном или ретроградном направлении в аксоне.Скорость митохондриального движения вдоль аксона можно количественно оценить как проиллюстрированную. Например, с помощью коммерчески доступного программного обеспечения анализа процент пестрых митохондрий значительно снижается в S-P-G-3-A нейронов по сравнению с дикими нейронами типа. Для анализа длины митохондриальной области и соотношения сторон аксоны могут выпрямиться в программном обеспечении анализа изображений и выбраны путем корректировки порога.Затем из выпрямленного аксона можно получить митохондриальную ширину периметра и соотношение сторон. Например, как митохондриальная длина, так и соотношение сторон значительно уменьшены в аксонах нейронов S-P-G 15 по сравнению с контрольом аксонов дикого типа. Важно, чтобы согреть среды и микроскоп инкубатор мыть клетки мягко и позволить клеткам стабилизироваться в течение двадцати минут до изображения.После живой клеточной визуализации культуры могут быть исправлены и подвергнуты иммуностеинированию для изучения экспрессии других белков, представляющих интерес. Трудно изучить митохондриальную динамику в живых человеческих нервах. Этот метод обеспечивает уникальный инструмент для изучения митохондриальной динамики и дегенерации нервов при неврологических заболеваниях.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Нейромодуляция и митохондриальной Транспорт: Live изображений в нейронах гиппокампа в течение длительного времени

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав нейронов и нейронов прародителей из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Спецификация конечного мозга глутаматергической нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Анализ Дендритные Морфология в столбцах и слоях

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Моделирования Зика вирус развивающегося мозга человека в пробирке с помощью стволовых клеток получены мозгового Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Метод для высокой скорости стретч травмы человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток нейронов в формате 96-луночных

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Сравнение стволовых клеток человека, полученных нейронов в предварительно собранных пластиковых микрофлюидных чипов

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Постдифференцирование Replating человека Плюрипотентные стволовые клетки полученных нейронов для высокого содержания скрининга неуритогенеза и синапсового созревания

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Преобразование индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в функциональные спинномозговых и черепных двигательных нейронов с помощью переносчиков

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...