Name: analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia
Uploaded: 2020-02-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Paraplejia Espástica, la Fundación Blazer y la NIH (R21NS109837).

1. Generación de neuronas glutamatérgicas telencéfalas a partir de ISCs
NOTA: El protocolo detallado para mantener los iPSC y su diferenciación en neuronas glutamatérgicas telencéfalas son similares a los descritos anteriormente18. Aquí, se introduce y resalta el proceso crítico durante la diferenciación de células madre pluripotentes humanas.
<ol><li>IPSCs de cultivo en alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en un medio de células madre...

<ol>
	<li>Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+membranous+and+nonmembranous+cargoes:+a+unified+perspective.">Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective.</a> Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons.">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).</li><li>Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+trafficking+in+neurons.">Mitochondrial trafficking in neurons.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).</li><li>Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+of+mitochondria.">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).</li><li>Course, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+Mitochondrial+Transport+in+Neurons.">Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons.</a> Neuromethods. 123, 49-66 (2017).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+mitochondria+with+fluorescent+dyes+for+imaging.">Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+Mitochondrial+Movement+Within+Neurons:+Manual+Versus+Automated+Tracking+Methods.">Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods.</a> Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).</li><li>Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. 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S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parkinsonian+mimetic,+MPP+,+specifically+impairs+mitochondrial+transport+in+dopamine+axons.">The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).</li><li>Shirendeb, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+huntingtin's+interaction+with+mitochondrial+protein+Drp1+impairs+mitochondrial+biogenesis+and+causes+defective+axonal+transport+and+synaptic+degeneration+in+Huntington's+disease.">Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease.</a> Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).</li><li>Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia:+clinical-genetic+characteristics+and+evolving+molecular+mechanisms.">Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms.</a> Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).</li><li>Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+of+hereditary+spastic+paraplegia.">Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia.</a> Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+axonal+defects+by+targeting+mitochondrial+dynamics+in+hereditary+spastic+paraplegias.">Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias.</a> Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photostable+naphthalimide-based+fluorescent+probe+for+mitochondrial+imaging+and+tracking.">New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).</li><li>Carvalho, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+benzothiadiazole+fluorophores+for+selective+mitochondrial+imaging+and+dynamics.">Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics.</a> Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).</li><li>Yamakoshi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+Raman+probe+based+on+bisarylbutadiyne+for+live+cell+imaging+of+mitochondria.">A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).</li><li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoAnalyzer:+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons.">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantifying+mitochondrial+axonal+transport.">A new method for quantifying mitochondrial axonal transport.</a> Protein &amp; Cell. 7 (11), 804-819 (2016).</li><li>De Vos, K. J., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+mitochondrial+dynamics+in+living+animal+cells.">Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells.</a> Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).</li><li>Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Axonal+Phenotypes+with+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).</li><li>Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+Tracker:+ImageJ+plugins+for+fully+automated+analysis+of+multiple+axonal+transport+parameters.">Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).</li><li>Reis, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motor+function+in+axonal+transport+in+vivo+probed+by+genetic+and+computational+analysis+in+Drosophila.">Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).</li><li>Broeke, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+of+cellular+traffic+in+living+cells.">Automated quantification of cellular traffic in living cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).</li><li>Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+robust+method+for+automated+analysis+of+axonal+transport.">A fast and robust method for automated analysis of axonal transport.</a> European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).</li><li>Mukherjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+kymograph+analysis+for+profiling+axonal+transport+of+secretory+granules.">Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules.</a> Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy.</a> Autophagy. 12, 1 (2016).</li><li>Metivier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofluorometric+detection+of+mitochondrial+alterations+in+early+CD95/Fas/APO-1-triggered+apoptosis+of+Jurkat+T+lymphoma+cells.+Comparison+of+seven+mitochondrion-specific+fluorochromes.">Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes.</a> Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+proper+fluorescent+dyes,+proteins,+and+imaging+techniques+to+study+mitochondrial+dynamics+in+mammalian+cells.">Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells.</a> Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).</li><li>Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mitochondrial+transport+in+neurons.">Characterization of mitochondrial transport in neurons.</a> Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).</li></ol>

Este artículo describe un método para analizar el transporte mitocondrial y la morfología en axones neuronales utilizando tinte fluorescente rojo y software ImageJ, que proporcionan una plataforma única para estudiar la degeneración axonal y la morfología mitocondrial en enfermedades neurodegenerativas. Hay varios pasos críticos en el protocolo, incluyendo la tinción de las mitocondrias, la creación de imágenes de células vivas y el análisis de las imágenes. En este método, se utilizó un tinte fluorescente...

La motilidad mitocondrial y la distribución juegan un papel vital en el cumplimiento de las demandas energéticas variables y especializadas en las neuronas polarizadas. Las neuronas pueden extender axónes extremadamente largos para conectarse con objetivos a través de la formación de sinapsis, que exigen altos niveles de energía para Ca2+ amortiguación y corrientes ióndas. El transporte de mitocondrias de soma a axón es fundamental para apoyar la función axonal y sináptica de las neuronas. El movimiento mitocondrial dinámica espacial y temporal se lleva a cabo mediante un transporte axonal rápido a velocidades de varios micrómetros por segundo1.
Específicamente, las proteínas motoras o adaptadoras, como la cinaína y la dinanina, participan en el transporte rápido de orgánulos a lo largo de los microtúbulos para controlar el movimiento de las mitocondrias2,3. La actividad neuronal normal requiere el transporte adecuado de las mitocondrias recién ensambladas desde el soma neuronal al axón distal (transporte axonal anterogrado) y el transporte inverso de mitocondrias desde el axón distal de vuelta al cuerpo celular (transporte retrógrado). Estudios recientes han indicado que la asignación mitocondrial inadecuada está fuertemente asociada con defectos neuronales y enfermedades degenerativas de neuronas motoras4,5. Por lo tanto, para diseccionar el papel de las mitocondrias en la neurodegeneración, es importante establecer métodos para examinar el movimiento mitocondrial a lo largo de los axons en cultivos vivos.
Hay dos desafíos principales en el examen y análisis del seguimiento de las mitocondrias: (1) identificar las mitocondrias desde el fondo en cada fotograma, y (2) analizar y generar las conexiones entre cada fotograma. Para resolver el primer desafío, se utiliza ampliamente un enfoque de etiquetado de fluorescencia para distinguir las mitocondrias del fondo, como el tinte MitoTracker o la transfección de la proteína de orientación mitocondrial fusionada con fluorescencia (por ejemplo, mito-GFP)6,7,8. Para analizar la asociación entre fotogramas, en estudios anteriores9se han descrito varios algoritmos y herramientas de software. En un artículo reciente, los investigadores compararon cuatro herramientas automatizadas diferentes (por ejemplo, Volocity, Imaris, wrMTrck y Difference Tracker) para cuantificar el transporte mitocondrial. Los resultados mostraron que, a pesar de las discrepancias en la longitud de la pista, el desplazamiento mitocondrial, la duración del movimiento y la velocidad, estas herramientas automatizadas son adecuadas para evaluar la diferencia de transporte después del tratamiento10. Además de estas herramientas, un plugin integrado "Macros" para ImageJ (escrito por Rietdorf y Seitz) ha sido ampliamente utilizado para analizar el transporte mitocondrial11. Este método genera kymographs que se pueden utilizar para analizar el movimiento mitocondrial, incluyendo la velocidad en direcciones anterogradas y retrógradas.
Las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos que cambian constantemente en número y morfología en respuesta a condiciones fisiológicas y patológicas. La fiscalidad mitocondrial y la fusión regulan estrechamente la morfología mitocondrial y la homeostasis. El desequilibrio entre la fission mitocondrial y la fusión puede inducir redes mitocondriales extremadamente cortas o largas, lo que puede afectar la función mitocondrial y dar lugar a actividades neuronales anormales y neurodegeneración. El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están implicados en diversas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la paraplejia espástica hereditaria (HSP)12,13,14,15. El HSP es un grupo heterogéneo de trastornos neurológicos hereditarios caracterizadopor la degeneración del tracto corticoespinal y la posterior falta de control de los músculos inferiores de las extremidades16,17. En este estudio, las neuronas forebrain derivadas de iPSC se utilizan para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en HSP. Este método proporciona un paradigma único para examinar la dinámica mitocondrial de los axons neuronales en cultivos vivos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 SERIES A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall Legend X1R/ 75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Chemiglass Life Sciences</td>
			<td>1760-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic AMP (cAMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#39;&#39; glass pipetes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-6274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker CMXRos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPle Serum-Free Supplement</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope IX83</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83-ZDC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41/ IX2-SLP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine))</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#956;m Millipore Express&#174; Plus Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 &#956;M PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr1 antibody (1:2000)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks (untreated)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugins for softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-formats Package</td>
			<td><a href="http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/" target="_blank">http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td><a href="https://fiji.sc/" target="_blank">https://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kymograph Plugin</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultipleKymograph.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultipleOverlay.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WalkingAverage.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackDifference.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straighten_.jar</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tsp050706.txt</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia

Las neuronas tienen intensas demandas de alta energía con el fin de apoyar sus funciones. Se ha observado un deterioro del transporte mitocondrial a lo largo de los axones en las neuronas humanas, que puede contribuir a la neurodegeneración en varios estados de la enfermedad. Aunque es difícil examinar la dinámica mitocondrial en los nervios humanos vivos, estos paradigmas son críticos para estudiar el papel de las mitocondrias en la neurodegeneración. Aquí se describe un protocolo para analizar el transporte mitocondrial y la morfología mitocondrial en axónicos de neuronas forebrain derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Los IPSCse se diferencian en neuronas glutamatérgicas telencéfalas utilizando métodos bien establecidos. Las mitocondrias de las neuronas están manchadas con MitoTracker CMXRos, y el movimiento mitocondrial dentro de los axones se captura mediante un microscopio de imágenes de células vivas equipado con una incubadora para el cultivo celular. Las imágenes de lapso de tiempo se analizan utilizando software con plugins "MultiKymograph", "Bioformat importer" y "Macros". Se generan kymographs de transporte mitocondrial, y la velocidad mitocondrial promedio en las direcciones anteroógradas y retrógradas se lee en el kymograph. En cuanto al análisis de morfología mitocondrial, la longitud mitocondrial, el área y la relación de aspecto se obtienen utilizando el ImageJ. En resumen, este protocolo permite la caracterización del tráfico mitocondrial a lo largo de los axons y el análisis de su morfología para facilitar los estudios de enfermedades neurodegenerativas.

Aquí, los IPSC humanos se diferenciaron en neuronas glutamatérgicas telencéfalas, que se caracterizaban por inmunostaining con marcadores de tubulina Tbr1 y III(Figura 1A). Para examinar el transporte axonal de las mitocondrias, estas células se teñían con un tinte fluorescente rojo y se realizaban imágenes de lapso de tiempo. Dado que ImageJ está fácilmente disponible y es más fácil de obtener, el transporte mitocondrial se analizó más a fondo con los plugins "...

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Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están involucrados en diversas enfermedades neurodegenerativas. El protocolo presentado utiliza neuronas anticerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en paraplejia espástica hereditaria. Este protocolo permite la caracterización del tráfico mitocondrial a lo largo de los axones y el análisis de su morfología, lo que facilitará el estudio de la enfermedad neurodegenerativa.

Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

La disfunción mitocondrial subyace a muchas enfermedades neurodegenerativas. Nuestro protocolo proporciona una herramienta importante para examinar la dinámica mitocondrial en los axones, facilitando el estudio de enfermedades neurológicas que implican la degeneración axonal. Mediante la combinación de etiquetado mitocondrial, imágenes de células vivas y tecnología de células madre pluripotentes inducidas, nuestro protocolo se puede utilizar para caracterizar el tráfico mitocondrial a lo largo de los axones humanos y analizar sus morfologías.El transporte mitocondrial deteriorado y la morfología se pueden observar en cultivos con células madre y modelos animales de enfermedades neurodegenerativas que proporcionan posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de estas enfermedades. Después del año treinta y cinco de cultivo, disociar las neuroesferas diferenciadas de las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano en pequeños racimos con 1 mg/ml de solución de desprendimiento celular durante dos minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación recoger los cúmulos celulares por centrifugación y resuspend el pellet en un mililitro de NDM.Placa de unos cinco grupos de células en cien microlitros de medio por poliornitina y lactosa deshidrogenasa elevando la matriz de membrana de sótano de factor de crecimiento reducido libre de virus recubierta 35 milímetros de vidrio platos inferiores. Luego agregue un mililitro de NDM complementado con B27, monofosfato de adenosina cíclico, factor de crecimiento insulina-like, factor neurotrófico derivado del cerebro humano y factor neurotrófico derivado de células gliales a cada cultivo. Para visualizar las mitocondrias a lo largo de los axones de las neuronas del antebrado, primero manchar las neuronas con 50 nanomolares rojos fluorescentes en NDM durante tres minutos a 37 grados Celsius seguido de dos lavados en NDM caliente.A continuación, coloque el cultivo en el escenario de un microscopio de fluorescencia y seleccione el objetivo 40X. En el campo de fase, identifique los axones en función de sus características morfológicas. Para distinguir la dirección del movimiento mitocondrial a lo largo de los axones identificar claramente los cuerpos celulares de las neuronas.Después de distinguir el cuerpo celular y el axón, ajuste el tiempo de exposición y el enfoque de las mitocondrias en los axones y capture el transporte mitocondrial dentro de los axones cada cinco segundos durante un total de cinco minutos. Para analizar el transporte mitocondrial en ImageJ, abra Fiji y seleccione el plugin Bio-Formats. Utilice el importador de biotemos para importar las imágenes de lapso de tiempo de la serie tiff y seleccione las series estándar ImageJ y Open all.Compruebe la escala automática de canales divididos y haga clic en Aceptar teniendo cuidado de anotar el número de fotograma y el tamaño de las imágenes en píxeles. Después de ajustar el brillo y el contraste de los 60 fotogramas, utilice la línea segmentada para dibujar una línea desde el cuerpo de la celda hasta el axón terminal. Para generar el Kymograph seleccione el plugin Kymograph múltiple y seleccione el ancho de línea.Para medir la distancia, los valores de tiempo y la velocidad de las mitocondrias móviles abiertas tsp050607. txt en el plugin macros. Y dibuje una línea segmentada sobre el rastro del movimiento mitocondrial en el cifógrafo de la región superior a inferior.Después de dibujar la línea abierta leer velocidades de tsp en el plugin macros para leer las velocidades segmentadas correspondientes a la línea. A continuación, abra la imagen original y utilice la herramienta de línea para dibujar una línea a lo largo de la barra de escala. Seleccione analizar para medir la longitud de la línea y convertir el dx ahora y las unidades de distancia de píxeles a micrómetros.A continuación, cambia el tiempo de píxel a segundo. Para analizar la longitud mitocondrial y el área dentro de los axones en ImageJ, instale el plugin JAR de punto de subrayado enderezar y abra la imagen de axón de interés. Convierta la imagen de 32 bits a ocho bits y utilice la herramienta de línea segmentada para trazar el axón.Seleccione el plugin JAR de subrayado Straighten y establezca el ancho de la línea ancha del filamento en 50 píxeles. Trace el axón de nuevo para generar un axón enderezado y ajustar el umbral de la imagen. Seleccione analizar los descriptores de elipse y forma de ajuste perimetral de medidas de conjunto para establecer la medida y utilizar la función de línea para medir la barra de escala en la imagen original como se ha demostrado.En Analizar y establecer la escala, introduzca la distancia en píxeles de distancia conocida y la unidad de longitud para establecer la escala. A continuación, seleccione global para establecer la configuración de escala en todas las imágenes. Finalmente seleccione analizar y analizar partículas para determinar el área y seleccione los resultados de visualización para ver la medición resultante.Después de la diferenciación en neuronas glutamatérgicas telencéfalas las células se pueden caracterizar por su T-B-R uno y beta tres expresión marcador de tubulina. La tinción con tinte fluorescente rojo y lapso de tiempo permite evaluar el transporte axonal de las mitocondrias. Un solo mitocondrión puede permanecer estático o moverse en una dirección anterograda o retrógrada dentro de un axón.La velocidad del movimiento mitocondrial a lo largo del axón se puede cuantificar como se ilustra. Por ejemplo, el uso de software de análisis disponible comercialmente el porcentaje de mitocondrias móviles se reduce significativamente en las neuronas S-P-G-3-A en comparación con las neuronas de tipo salvaje. Para analizar la longitud del área mitocondrial y la relación de aspecto axones se pueden enderezar en el software de análisis de imágenes y seleccionar mediante el ajuste del umbral.La anchura de la longitud perimetral del área mitocondrial y la relación de aspecto se pueden obtener a partir del axón enderezado. Por ejemplo, tanto la longitud mitocondrial como la relación de aspecto se reducen significativamente en los axones de neuronas S-P-G 15 en comparación con los axones de tipo salvaje de control. Es importante calentar el medio y la incubadora del microscopio para lavar las células suavemente y permitir que las células se estabilicen durante veinte minutos antes de la toma de imágenes.Después de las imágenes de células vivas, los cultivos pueden ser fijos y sometidos a inmunosuchación para examinar la expresión de otras proteínas de interés. Es difícil examinar la dinámica mitocondrial en los nervios humanos vivos. Esta técnica proporciona la herramienta única para el estudio de la dinámica mitocondrial y la degeneración nerviosa en la enfermedad neurológica.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

La neuromodulación y mitocondrial de transporte: Imágenes en vivo en las neuronas del hipocampo durante largos períodos de tiempo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Investigación

Neurociencias

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

La especificación de telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelado de la infección del Virus Zika del desarrollo cerebro humano In Vitro usando células madre derivado Cerebral organitas

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Método para la lesión de estiramiento de alta velocidad de humanos inducida por las neuronas derivadas de células madre pluripotentes en formato de 96 pocillos

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartmentalización de las neuronas derivadas de células madre humanas dentro de chips microfluídicos plásticos preensamblados

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...