Name: analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia
Uploaded: 2020-02-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia at JoVE.com

Bu çalışma Spastik Parapleji Vakfı, Blazer Vakfı ve NIH (R21NS109837) tarafından desteklenmiştir.

1. IPSCs telencephalic glutamaterjik nöronların üretimi
NOT: iPSC'lerin korunması ve bunların telensefalik glutamaterjik nöronlara farklılaşması için ayrıntılı protokol daha önce18açıklananlara benzer. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinin farklılaşması sırasında kritik süreç tanıtıldı ve vurgulanır.
<ol><li>İnsan embriyonik kök hücre (hESC) orta fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / mL) ile desteklenen fare embriyonik fibrob...

<ol>
	<li>Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+membranous+and+nonmembranous+cargoes:+a+unified+perspective.">Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective.</a> Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons.">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).</li><li>Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+trafficking+in+neurons.">Mitochondrial trafficking in neurons.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).</li><li>Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+of+mitochondria.">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).</li><li>Course, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+Mitochondrial+Transport+in+Neurons.">Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons.</a> Neuromethods. 123, 49-66 (2017).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+mitochondria+with+fluorescent+dyes+for+imaging.">Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+Mitochondrial+Movement+Within+Neurons:+Manual+Versus+Automated+Tracking+Methods.">Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods.</a> Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).</li><li>Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+biogenesis,+defective+axonal+transport+of+mitochondria,+abnormal+mitochondrial+dynamics+and+synaptic+degeneration+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).</li><li>Denton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+dynamics+underlie+axonal+defects+in+hereditary+spastic+paraplegias.">Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias.</a> Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).</li><li>Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parkinsonian+mimetic,+MPP+,+specifically+impairs+mitochondrial+transport+in+dopamine+axons.">The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).</li><li>Shirendeb, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+huntingtin's+interaction+with+mitochondrial+protein+Drp1+impairs+mitochondrial+biogenesis+and+causes+defective+axonal+transport+and+synaptic+degeneration+in+Huntington's+disease.">Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease.</a> Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).</li><li>Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia:+clinical-genetic+characteristics+and+evolving+molecular+mechanisms.">Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms.</a> Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).</li><li>Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+of+hereditary+spastic+paraplegia.">Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia.</a> Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).</li><li>Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+rescue+of+axon+growth+defects+in+a+human+iPSC+model+of+hereditary+spastic+paraplegia+SPG3A.">Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).</li><li>Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Time-Lapse+Imaging+in+the+Zebrafish+Lateral+Line:+A+Flexible,+Open-Ended+Research+Project+for+an+Undergraduate+Neurobiology+Laboratory+Course.">In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).</li><li>Kang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docking+of+axonal+mitochondria+by+syntaphilin+controls+their+mobility+and+affects+short-term+facilitation.">Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation.</a> Cell. 132 (1), 137-148 (2008).</li><li>Mou, Y., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+axonal+defects+by+targeting+mitochondrial+dynamics+in+hereditary+spastic+paraplegias.">Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias.</a> Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photostable+naphthalimide-based+fluorescent+probe+for+mitochondrial+imaging+and+tracking.">New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).</li><li>Carvalho, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+benzothiadiazole+fluorophores+for+selective+mitochondrial+imaging+and+dynamics.">Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics.</a> Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).</li><li>Yamakoshi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+Raman+probe+based+on+bisarylbutadiyne+for+live+cell+imaging+of+mitochondria.">A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).</li><li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoAnalyzer:+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons.">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantifying+mitochondrial+axonal+transport.">A new method for quantifying mitochondrial axonal transport.</a> Protein &amp; Cell. 7 (11), 804-819 (2016).</li><li>De Vos, K. J., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+mitochondrial+dynamics+in+living+animal+cells.">Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells.</a> Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).</li><li>Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Axonal+Phenotypes+with+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).</li><li>Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+Tracker:+ImageJ+plugins+for+fully+automated+analysis+of+multiple+axonal+transport+parameters.">Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).</li><li>Reis, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motor+function+in+axonal+transport+in+vivo+probed+by+genetic+and+computational+analysis+in+Drosophila.">Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).</li><li>Broeke, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+of+cellular+traffic+in+living+cells.">Automated quantification of cellular traffic in living cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).</li><li>Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+robust+method+for+automated+analysis+of+axonal+transport.">A fast and robust method for automated analysis of axonal transport.</a> European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).</li><li>Mukherjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+kymograph+analysis+for+profiling+axonal+transport+of+secretory+granules.">Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules.</a> Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy.</a> Autophagy. 12, 1 (2016).</li><li>Metivier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofluorometric+detection+of+mitochondrial+alterations+in+early+CD95/Fas/APO-1-triggered+apoptosis+of+Jurkat+T+lymphoma+cells.+Comparison+of+seven+mitochondrion-specific+fluorochromes.">Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes.</a> Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+proper+fluorescent+dyes,+proteins,+and+imaging+techniques+to+study+mitochondrial+dynamics+in+mammalian+cells.">Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells.</a> Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).</li><li>Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mitochondrial+transport+in+neurons.">Characterization of mitochondrial transport in neurons.</a> Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).</li></ol>

Bu makalede, her ikisi de nörodejeneratif hastalıkaksonal dejenerasyon ve mitokondriyal morfoloji çalışma için benzersiz bir platform sağlamak kırmızı floresan boya ve ImageJ yazılımı kullanarak nöronal aksonlarda mitokondriyal taşıma ve morfoloji analiz etmek için bir yöntem açıklanır. Protokolde mitokondri boyama, canlı hücre görüntüleme ve görüntüleri analiz dahil olmak üzere çeşitli kritik adımlar vardır. Bu yöntemde mitokondriyi lekelemek için floresan boya kullanılmıştır. İn...

Mitokondriyal hareketlilik ve dağılım polarize nöronlarda değişken ve özel enerjik taleplerin karşılanmasında hayati bir rol oynamaktadır. Nöronlar, Ca2+ tamponlama ve iyon akımları için yüksek düzeyde enerji gerektiren sinapsoluşumu yoluyla hedeflerle bağlantı kurmak için son derece uzun aksonları genişletebilirler. Mitokondrinin somadan aksona taşınması nöronların aksonal ve sinaptik fonksiyonunu desteklemek için çok önemlidir. Mekansal ve zamansal dinamik mitokondriyal hareket saniyede birkaç mikrometre hızlarda hızlı aksonal taşıma ile yapılır1.
Özellikle, motor veya adaptör proteinleri, kinesin ve dinin in gibi, mitokondri hareketini kontrol etmek için mikrotübüller boyunca hızlı organel taşıma katılmak2,3. Normal nöronal aktivite, nöronal somadan distal aksona (anterograd aksonal taşıma) ve mitokondrinin distal aksondan hücre gövdesine geri geri taşınmasına (retrograd taşıma) yeni monte edilmiş mitokondrinin uygun şekilde taşınmasını gerektirir. Son çalışmalar uygunsuz mitokondriyal ayırma kuvvetle nöronal defektler ve motor nöron dejeneratif hastalıklar ile ilişkili olduğunu göstermiştir4,5. Bu nedenle, nörodejenerasyon da mitokondri rolünü incelemek için, canlı kültürlerde akson boyunca mitokondriyal hareketi incelemek için yöntemler kurmak önemlidir.
Mitokondrinin izlenmesinin incelenmesi ve analiz edilmesinde iki temel zorluk vardır: (1) her çerçevede arka plandan mitokondrinin tanımlanması ve (2) her kare arasındaki bağlantıların analiz edilmesi ve üretilmesi. İlk zorluğun çözümünde, mitokondriyi arka plandan ayırt etmek için yaygın olarak bir floresan etiketleme yaklaşımı kullanılır, örneğin MitoTracker boya veya floresan erimiş mitokondriyal hedefleme proteininin transfeksiyonu (örn. mito-GFP)6,7,8. Çerçeveler arasındaki ilişkiyi analiz etmek için, çeşitli algoritmalar ve yazılım araçları önceki çalışmalarda tanımlanmıştır9. Yakın tarihli bir makalede, araştırmacılar mitokondriyal taşımayı ölçmek için dört farklı otomatik aracı (örneğin, Volocity, Imaris, wrMTrck ve Difference Tracker) karşılaştırdılar. Sonuçlar, pist uzunluğu, mitokondriyal deplasman, hareket süresi ve hız daki farklılıklara rağmen, bu otomatik araçların tedavi sonrası taşıma farkını değerlendirmek için uygun olduğunu gösterdi10. Bu araçlara ek olarak, ImageJ için entegre bir eklenti "Makrolar" (Rietdorf ve Seitz tarafından yazılmış) yaygın mitokondriyal taşıma analiz etmek için kullanılmıştır11. Bu yöntem, hem anterograd hem de retrograd yönlerde hız da dahil olmak üzere mitokondriyal hareketi analiz etmek için kullanılabilecek kymograflar oluşturur.
Mitokondri, hem fizyolojik hem de patolojik durumlara yanıt olarak sayı ve morfolojide sürekli olarak değişen son derece dinamik organellerdir. Mitokondriyal fizyon ve füzyon mitokondriyal morfolojive homeostazı sıkı bir şekilde düzenler. Mitokondriyal fizyon ve füzyon arasındaki dengesizlik son derece kısa veya uzun mitokondriyal ağları neden olabilir, hangi mitokondriyal fonksiyon bozabilir ve anormal nöronal aktiviteler ve nörodejenerasyon neden olabilir. Bozulmuş mitokondriyal ulaşım ve morfoloji alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı ve kalıtsal spastik parapleji (HSP)12,13,14,15gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklar, yer almaktadır. HSP, kortikospinal sistemin dejenerasyonu ve alt ekstremite kaslarının kontrol altına alınmaması ile karakterize kalıtsal nörolojik hastalıkların heterojen bir grubudur16,17. Bu çalışmada HSP'de mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için iPSC kaynaklı ön beyin nöronlar kullanılmaktadır. Bu yöntem canlı kültürlerde nöronal aksonların mitokondriyal dinamikleri incelemek için benzersiz bir paradigma sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 SERIES A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall Legend X1R/ 75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Chemiglass Life Sciences</td>
			<td>1760-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic AMP (cAMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#39;&#39; glass pipetes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-6274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker CMXRos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPle Serum-Free Supplement</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope IX83</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83-ZDC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41/ IX2-SLP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine))</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#956;m Millipore Express&#174; Plus Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 &#956;M PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr1 antibody (1:2000)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks (untreated)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugins for softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-formats Package</td>
			<td><a href="http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/" target="_blank">http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td><a href="https://fiji.sc/" target="_blank">https://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kymograph Plugin</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultipleKymograph.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultipleOverlay.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WalkingAverage.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackDifference.class</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straighten_.jar</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tsp050706.txt</td>
			<td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia

Nöronlar işlevlerini desteklemek için yüksek enerji için yoğun talepleri var. Aksonları boyunca bozulmuş mitokondriyal taşıma insan nöronlarında gözlenmiştir, hangi çeşitli hastalık durumlarında nörodejenerasyon katkıda bulunabilir. Canlı insan sinirlerinde mitokondriyal dinamikleri incelemek zor olsa da, bu tür paradigmalar nörodejenerasyonda mitokondrinin rolünü incelemek için kritik öneme sahiptir. Burada açıklanan insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSCs) elde edilen ön beyin nöron aksonları mitokondriyal taşıma ve mitokondriyal morfoloji analiz etmek için bir protokoldür. IPSCs iyi kurulmuş yöntemler kullanılarak telensefalik glutamaterjik nöronlar ayrılır. Nöronların Mitokondrisi MitoTracker CMXRos ile boyanmış, ve aksonlar içinde mitokondriyal hareket hücre kültürü için bir kuluçka ile donatılmış bir canlı hücre görüntüleme mikroskobu kullanılarak yakalanır. Hızlandırılmış görüntüler "MultiKymograph", "Bioformat importer" ve "Macros" eklentileri içeren yazılımlar kullanılarak analiz edilir. Mitokondriyal taşımanın mitokondriyal taşımanın miyografları oluşturulur ve anterograd ve retrograd yönlerde ortalama mitokondriyal hız kymograflardan okunur. Mitokondriyal morfoloji analizi ile ilgili olarak, mitokondriyal uzunluk, alan ve en boy oranı ImageJ kullanılarak elde edilir. Özetle, bu protokol nörodejeneratif hastalıkların çalışmalarını kolaylaştırmak için akson boyunca mitokondriyal ticaretin karakterizasyonuve morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.

Burada insan iPSC'leri telensefalik glutamaterjik nöronlar olarak farklılaştırılmış, bunlar Tbr1 ve βIII tubulin belirteçleri ile immünboyama ile karakterizedir (Şekil 1A). Mitokondrinin aksonal naklini incelemek için bu hücreler kırmızı floresan boya ile boyandı ve zaman atlamalı görüntüleme yapıldı. ImageJ kolayca kullanılabilir ve elde edilmesi daha kolay olduğundan, mitokondriyal taşıma daha fazla "MultiKymograph" ve "Makrolar" ImageJ eklentile...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia at JoVE.com

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Bozulmuş mitokondriyal taşıma ve morfolojisi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda rol oynamaktadır. Sunulan protokol, kalıtsal spastik paraplejide mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı ön beyin nöronlarını kullanır. Bu protokol, aksonların boyunca mitokondriyal ticaretinin karakterizasyonuna ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesini kolaylaştıracak morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.

Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Mitokondriyal disfonksiyon birçok nörodejeneratif hastalığın altında yatan. Protokolümüz aksonlarda mitokondriyal dinamiklerin incelenmesinde, aksonal dejenerasyoniçeren nörolojik hastalıkların incelenmesini kolaylaştıran önemli bir araç tır. Mitokondriyal etiketleme, canlı hücre görüntüleme ve indüklenen pluripotent kök hücre teknolojisini birleştirerek protokolümüz insan aksonlarındaki mitokondriyal ticareti karakterize etmek ve morfolojilerini analiz etmek için kullanılabilir.Kök hücre kültürlerinde ve bu hastalıkların tedavisinde potansiyel tedavi hedefleri sağlayan nörodejeneratif hastalıkların hayvan modellerinde bozulmuş mitokondriyal taşıma ve morfoloji görülebilir. Kültürün otuz beş gün sonra, 37 santigrat derece iki dakika hücre ayırma çözeltisi 1 mg / ml ile küçük kümeler halinde insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden farklı nörosferler ayrıştırın. Kuluçka sonunda santrifüj ile hücre kümeleri toplamak ve NDM bir mililitre pelet resuspend.Poliornit ve laktoz dehidrogenaz yükselterek virüssüz azaltılmış büyüme faktörü bazal membran matris kaplamalı 35 milimetre cam alt tabakları orta yüz mikrolitre hücre yaklaşık beş kümeleri. Sonra B27 ile desteklenen NDM bir mililitre ekleyin, siklik adenozin monofosfat, insülin benzeri büyüme faktörü, insan beyin kaynaklı nörotrofik faktör ve glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör her kültüre. Ön beyin nöronların aksonları boyunca mitokondriyi görselleştirmek için ilk olarak NDM'de 50 nanomolar kırmızı floresan boya ile nöronları 37 derece santigrat derecede üç dakika boyunca sıcak NDM'de iki yıkıntı ile lekeleyin.Daha sonra, bir floresan mikroskobun sahnesine kültür yerleştirin ve 40X hedefi seçin. Faz-alan altında morfolojik özelliklerine göre akson ları tanımlar. Aksonları boyunca mitokondriyal hareketin yönünü ayırt etmek için açıkça nöronların hücre organları belirlemek.Hücre gövdesi ve akson ayırt ettikten sonra maruz kalma süresi ve akson mitokondri odak ayarlamak ve akson içinde mitokondriyal taşıma her beş saniyede toplam beş dakika boyunca yakalamak. ImageJ açık Fiji mitokondriyal taşıma analiz etmek ve Bio-Formats eklentisi seçin. Tiff serisinin hızlandırılmış görüntülerini almak ve standart ImageJ'i seçmek ve tüm serileri açmak için Bio-Formats içe aktarıcısını kullanın.Otomatik ölçeklendirme kanalları işaretleyin ve pikseldeki görüntülerin kare numarasını ve boyutunu not etmeye özen göstermek için Tamam'ı tıklatın. Tüm 60 kare için parlaklık ve kontrast ayarlandıktan sonra hücre gövdesinden terminal akson bir çizgi çizmek için parçalı çizgi kullanın. Kymograph oluşturmak için birden fazla Kymograph eklentisi seçin ve çizgi genişliğini seçin.Hareketli mitokondri açık tsp050607 için mesafe, zaman değerleri ve hızı ölçmek için. makro eklentisinde txt. Ve mitokondriyal hareketin iz üzerinde alt bölgeden üstün bir çizgi çizin.Çizgiye karşılık gelen parçalı hızları okumak için makrolar eklentisinde tsp okuma hızları açık çizgi çizdikten sonra. Daha sonra özgün görüntüyü açın ve ölçek çubuğu boyunca bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın. Çizginin uzunluğunu ölçmek ve dx'i şimdi ve piksellerden mikrometrelere uzaklığı dönüştürmek için analiz et'i seçin.Ardından pikselden saniyeye kadar olan süreyi değiştirin. ImageJ'de aksoniçindeki mitokondriyal uzunluk ve alanı analiz etmek için nokta JAR eklentisinin düzleştirmesini yapın ve ilgi çekici akson görüntüsünü açın. 32 bit görüntüyü sekiz bit'e dönüştürün ve akson'u izlemek için parçalı çizgi aracını kullanın.Jar eklentisini düzeltin ve filament geniş çizginin genişliğini 50 piksele ayarlayın. Düzleştirilmiş bir akson oluşturmak ve görüntü eşiğini ayarlamak için akson'u tekrar izleyin. Ölçümü ayarlamak için ölçümleri ayarla çevre uygun elips ve şekil tanımlayıcılarını analiz et ve çizgi işlevini kullanarak orijinal görüntüdeki ölçek çubuğunu gösterildiği gibi ölçün.Analiz altında ve ölçek ayarlamak için piksel bilinen mesafe ve ölçek ayarlamak için uzunluk birimi mesafe girin. Ardından, ölçek ayarını tüm görüntülere ayarlamak için genel olarak seçin. Son olarak alanı belirlemek için parçacıkları analiz et ve analiz et ve elde edilen ölçümü görüntülemek için ekran sonuçlarını seçin.Telensefalik glutamaterjik nöronlar içine farklılaşma sonra hücreleri onların T-B-R bir ve beta üç tubulin marker ekspresyonu ile karakterize edilebilir. Kırmızı floresan boya ve zaman atlamalı görüntüleme ile boyama mitokondri aksonal taşıma değerlendirilmesi sağlar. Tek bir mitokondri statik kalabilir veya bir akson içinde anterograd veya retrograd yönde hareket edebilir.Akson boyunca mitokondriyal hareketin hızı gösterildiği gibi ölçülebilir. Örneğin ticari olarak mevcut analiz yazılımı kullanılarak, s-p-g-3-A nöronlarında yabani tip nöronlara göre hareketli mitokondri yüzdesi önemli ölçüde azalmıştır. Mitokondriyal alan uzunluğu ve en boy oranı aksonanaliz etmek için görüntü analizi yazılımı düzleştirilmiş ve eşik ayarlayarak seçilebilir.Mitokondriyal alan çevre uzunluğu genişliği ve en boy oranı daha sonra düzleştirilmiş akson elde edilebilir. Örneğin hem mitokondriyal uzunluk hem de en boy oranı S-P-G 15 nöron aksonlarda, kontrol yabani tip aksonlar ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalır. Hücreleri nazikçe yıkamak ve hücrelerin görüntülemeden önce yirmi dakika boyunca stabilize olmasını sağlamak için orta ve mikroskop inkübatörünü ısıtmak önemlidir.Canlı hücre görüntülemeden sonra kültürler sabit lenebilir ve diğer ilgi proteinlerinin ekspresyonunu incelemek için immünoleme tabi tutulabilir. Canlı insan sinirlerinde mitokondriyal dinamikleri incelemek zordur. Bu teknik nörolojik hastalıklarda mitokondriyal dinamikler ve sinir dejenerasyonu çalışmaları için benzersiz bir araç sağlar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Sütunlar ve Katmanlar dendritik Morfoloji Analizi

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Kök hücre kullanarak gelişmekte olan insan beyni Vitro Zika virüs enfeksiyonu modelleme serebral Organoids türetilmiş

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Ön montajlı plastik mikrofluidik cips içinde ınsan kök hücresi türeyen neurons compartmentalization

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...