Name: cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af en Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship til R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant nummer 100090/12/Z). Funder havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. Vi takker Ashok Venkitaraman og Paul French for kritisk rådgivning og vejledning om projektet. Vi takker Chiara Cossetti og Gabriela Grondys-Kotarba i Cambridge Institute for Medical Research flow cytometry facilitet for fremragende støtte. Vi takker Liam Cassiday, Thomas Miller og Gianmarco Contino for korrekturlæsning af manuskriptet.

1. differentialfluorescerende celle mærkning
<ol><li>Gentagging med CRISPR Cas9<ol>
<li>Brug crispr Cas9 genom redigering til at tagge rootletin (eller andre gener af interesse) med de fluorescerende proteiner megfp eller mscarlet-i i humane Cancer cellelinjer. Bemærk: Detaljerede protokoller for genomredigering er dækket andetsteds24,25,26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mærkning af fluorescerende farvestoffer...

<ol>
	<li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).</li><li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+fuse.">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Rao, P. N., Johnson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Cell+Fusion:+Studies+on+the+Regulation+of+DNA+Synthesis+and+Mitosis.">Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis.</a> Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instability+in+colorectal+cancers.">Genetic instability in colorectal cancers.</a> Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).</li><li>Fournier, R. E., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcell-mediated+transfer+of+murine+chromosomes+into+mouse,+Chinese+hamster,+and+human+somatic+cells.">Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).</li><li>Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+germ+cells+induce+epigenetic+reprogramming+of+somatic+nucleus+in+hybrid+cells.">Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells.</a> The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).</li><li>Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion.">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li><li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs.">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li><li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion.">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li><li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis.">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li><li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion.">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li><li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins.">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li><li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion.">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li><li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+glycol)+(PEG)-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers:+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release?.">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?.</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li><li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment.">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li><li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich's+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation.">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li><li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena.">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li><li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+cellular+fusion+using+optically+trapped+plasmonic+nano-heaters.">Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters.</a> Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).</li><li>Kao, K. N., Michayluk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-frequency+intergeneric+fusion+of+plant+protoplasts.">A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts.</a> Planta. 115 (4), 355-367 (1974).</li><li>Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+fusion.">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li><li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+centrosome+assembly.">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li><li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence.">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).</li><li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells.">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion.">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li><li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+(PEG)-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+(CAScT).">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li><li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies.">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).</li><li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines.">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li><li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons.">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li><li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin.">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li><li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells:+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor.">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li></ol>

Vi demonstrerer en facile og omkostningseffektiv protokol for at bruge celler og visualisere den efterfølgende arkitektur af celle hybrider med mikroskopi, idet det tager ca. to dage fra start til. Kritiske dele af denne protokol er berigelse af smeltet celler ved celle sortering (protokol afsnit 3), og omhyggelig validering af smeltet celler ved mikroskopi (protokol afsnit 4). Disse sektioner sikrer, at smeltet celler er let fremstillet og er bona fide heterokaryons. Koncentrationer og inkubationstider skal overholdes....

Homeostatisk vedligeholdelse af cellulære struktur er afgørende for livet. Celler har karakteristiske morfologier, sub-cellulære organelle tal, og intern biokemisk sammensætning. Forståelse af, hvordan disse grundlæggende egenskaber genereres, og hvordan de går skævt under sygdom kræver laboratorie værktøjer til at forstyrrer dem.
Cellefusion er en sammenlægning af to eller flere separate celler. Cellefusion kan have været afgørende for fremkomsten af eukaryote Life1. I den menneskelige krop, cellefusion er relativt sjælden, forekommende under begrænsede udviklingsmæssige omstændigheder og vævstyper, såsom under befrugtning eller dannelsen af muskler, knogler og placenta2. Denne protokol beskriver induktion af celle-cellefusion i vævskultur cellelinjer med differentielt fluorescently mærkede organeller, som et redskab til at forstå mekanismerne kontrollerende cellestruktur og funktion.
In vitro-induceret celle cellefusion er afgørende for produktionen af monoklonale antistoffer3, et vigtigt redskab til biologisk forskning og sygdomsbehandling. Cellefusion er også blevet brugt til at stille mange forskellige grundlæggende celle biologiske spørgsmål om celle cyklus dominans4, aneuploidi5,6, cellulære omprogrammering7,8, reparation af beskadigede neuroner9, viral proliferation10, apoptose11, tumor12, cytoskelet dynamik13, og membran fusion14,15. Laboratoriebaserede metoder til at inducere celle-cellefusion16,17,18,19 fremkalde lipid membran sammensmeltning gennem den fysiske fletning af to dobbeltlag i én. Cellefusion kan induceres af elektricitet18, virale baserede metoder17, termoplast opvarmning20, transgene udtryk19, og kemikalier, herunder polyethylenglycol (peg)16,21,22.
Centrosomes er mikrotubulus organisere centre kontrollerende cellulære form, motilitet, polarisering, og division23. Centrosomale rødder er fibrøse strukturer, der strækker sig fra centrosomer indeholdende proteinet rootletin24 (kodet af genet crocc). Vi har for nylig brugt celle-cellefusion til at forstå, hvordan centrosome position og antal varierer inden for heterokaryons i forhold til forældrenes celler24. Rationalet bag brugen af denne metode er at spore cellen af oprindelsen af rødder inden for en heterokaryon efter fusion af differentielt fluorescently mærkede forældre celler, og dermed til billedet organelle fusion og fission. De fluorescently mærkede proteiner rootletin-meGFP eller rootletin-mScarlet-I er skabt af genomredigering i separate cellelinjer, som derefter fusioneres af PEG-medierede cellefusion. Vi beskriver brugen af cellefarve stoffer (tabel over materialer) til at identificere smeltet celler ved flowcytometri og efterfølgende Fluorescens mikroskopi identifikation af centrosome celle oprindelse og morfologi (figur 1). Denne fremgangsmåde er en robust og unik metode til at studere, hvordan større ændringer i cellulær tilstand, herunder organelle nummer indvirke på celle homøostase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well imaging dishes</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gba-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Influx Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filters (70um)</td>
			<td>Biofil</td>
			<td>CSS010070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Far Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody</td>
			<td>NanoTag Biotechnologies</td>
			<td>N1302-At565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 CO2 independent imaging medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21063029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1 x PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP151</td>
			<td>nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP337</td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function

Livet er rumligt partitioneret inden for lipid membraner til at tillade isolerede dannelse af særskilte molekylære tilstande inde celler og organeller. Cellefusion er en fusion af to eller flere celler til dannelse af en enkelt celle. Her giver vi en protokol for cellefusion af to forskellige celletyper. Smeltet hybridceller beriges af strømnings cytometri-baseret sortering, efterfulgt af Fluorescens mikroskopi af hybrid cellens struktur og funktion. Fluorescently mærkede proteiner genereret af genomredigering er afbildet inde i smeltet celler, så cellulære strukturer kan identificeres baseret på fluorescens emission og refereres tilbage til celle typen af oprindelse. Denne robuste og generelle metode kan anvendes til forskellige celletyper eller organeller af interesse, at forstå cellulære struktur og funktion på tværs af en række grundlæggende biologiske spørgsmål.

Passende mærkede celler er synlige under strømnings cytometri ved fluorescens signal højere end ikke-mærkede kontrol celler (figur 2A). Gates er indstillet til sortering af dobbelte positive celler, berigende denne population direkte i Imaging retter til yderligere mikroskopiske analyser. Smeltet celler er detekterbare som særskilte dobbelt fluorescently positive celler og udgør omkring ~ 1% af befolkningen.
<p class="jove_content" ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function at JoVE.com

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Formålet med denne protokol er at smelte to forskellige celletyper for at oprette hybridceller. Fluorescens mikroskopi analyse af smeltet celler bruges til at spore cellen af oprindelsen af cellulære organeller. Denne analyse kan bruges til at undersøge, hvordan cellulær struktur og funktion reagerer på forstyrrelse ved cellefusion.

Celle celle fusion af Genomredigerede cellelinjer til Perturbation af cellulær struktur og funktion

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Denne metode gør det muligt at forstyrre cellestrukturen og funktionen gennem sammensmeltning af to forskellige celletyper for at løse spørgsmål som f.eks. Ved billeddannelse fluorescerende mærkede proteiner i sammensmeltede celler, cellulære strukturer kan refereres tilbage til deres celle type oprindelse til at studere mekanismerne i organelle homøostase og funktion. For fluorescerende farvestof mærkning, se den menneskelige kræftcelle populationer af interesse, således at hver kultur vil have udvidet til mindst seks gange 10 til den sjette celler på en 70 til 90% sammenløbet af den næste morgen.På mærkningsdagen vaskes rootletin eGFP- og rootletin-mScarlet-cellerne to gange med 10 milliliter PBS pr. vask. Fortyndet Violet celle farvestof til 500 nanomolar i PBS og Far Red celle farvestof til 200 nanomolar i PBS. Mærk rootletin eGFP-cellerne med det fortyndede violette cellefarvestof og rootletin-mScarlet-cellerne med det fortyndede far røde cellefarve i et minut ved stuetemperatur.Ved slutningen af inkubationerne stoppes reaktionerne med 10 milliliter DMEM i fem minutter. Vask både mærkede cellekulturer og en ikke-mærket forældrecellekultur med 10 milliliter frisk PBS, før alle kulturer inkuberes med en milliliter forvarmet trypsin. Ved inkubationens afslutning overføres de fritliggende celleopløsninger til de enkelte 15 milliliterkoniske rør til centrifugering, og farvestofmærket pellets opvarmes forsigtigt i en milliliter PBS og de umærkede celler i en milliliter DMEM.Vend derefter alle celleprøverne tilbage til cellekulturskuvøsen. Til cellefusionseksperiment blandes 500 mikroliter violette farvestofmærkede celler med 500 mikroliter af farrød farvestofmærkede celler i et nyt 15 milliliterrør og sedimentere de resterende ublandet mærkede celler ved centrifugering. Opsplitning af pillerne i en milliliter frisk DMEM og læg cellerne tilbage i inkubatoren.Opsaml de blandede celler ved centrifugering og tilsæt 700 mikroliter på 50%1450 PEG på en dråbemæssig måde til pellet over en periode på 30 sekunder. Efter 3,5 minutter ved stuetemperatur tilsættes 10 milliliter serumfri DMEM drop-wise over en periode på 30 sekunder, og rørene anbringes i inkubatoren i 10 minutter. Ved inkubationens afslutning sedimenteres de blandede celler ved centrifugering og forsigtigt resuspenderede pellet i en milliliter komplet medium.For at berige for den sammensmeltede cellepopulation ved FACS filtreres alle cellerne forsigtigt i individuelle FACS-rør gennem en 70 mikrometers si og skabe fremadspiskende versus sidespr. og doublet diskriminationsområder i cytometersoftwaren. Kør de umærkede celler for at registrere deres fluorescensintensitet og oprette porte for at identificere de sammensmeltede celler. Dernæst køre enkelt positive Violet farvestof mærket celler for at bekræfte, at der ikke er nogen spillover af Violet signal i Far Red kanal og den eneste positive Far Red farvestof mærket celler for at bekræfte, at der ikke er nogen Far Red signal i Violet kanal.Derefter køres fusionsprøven kort for at bekræfte, at de sammensmeltede celler er synlige med disse porte. Når sorteringsparametrene er indstillet, skal sorteringsstrømmen justeres centralt i en otte-brøndbilledskål, der indeholder 100 mikroliter vækstmedium, og sortere de dobbelte positive sammensmeltede celler direkte ind i skålen. Når alle cellerne er sorteret, skal skålen straks hældes i cellekulturinkubatoren i to til 16 timer.For immunfluorescerende farvning skal cellekultursupernatanten først erstattes med 200 mikroliter på 4% paraformaldehyd for en 15-minutters inkubation ved stuetemperatur. Ved afslutningen af fikseringen vaskes cellerne tre gange med 200 mikroliter PBS pr. vask, før cellerne permeabiliseres i 200 mikroliter på 0,1% ikke-ionisk overfladeaktivt stof i 10 minutter ved stuetemperatur. Dernæst blokeres den uspecifikke binding med 200 mikroliter på 3% kvæg serumalbumin i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af mærkning med de antistoffer, der er af interesse i 150 mikroliter af farvningsbuffer.Efter en time ved stuetemperatur vaskes cellerne to gange i 300 mikroliter PBS i fem minutter pr. vask. Efter den sidste vask udskiftes vasken med 200 mikroliter frisk PBS. For at erhverve billeder af de sammensmeltede celler, skal du bruge et passende fluorescensmikroskop, der kan billeddannelse i fire farver, og indsamle tredimensionelle billeder.Korrekt mærkede celler er synlige under flowcytometri ved fluorescerende signal på et højere niveau end ikke-mærkede kontrolceller. Portene kan indstilles til sortering for at berige for den dobbelte positive cellepopulation direkte i billedbehandlingsretter til yderligere mikroskopisk analyse. Fusion inducerer en større omlægning af den cellulære arkitektur gennem blanding af to celler i én.Hetotomer identificeres som celler, der indeholder både fluorescerende farvestofsignaler blandet inde i en enkelt celle uden at gribe ind i plasmamembraner. Derudover kan to kerner også være synlige i sammensmeltede celler ved Brightfield-billeddannelse. Cellestrukturen og -funktionen kan undersøges yderligere ved sammenlægning af celler, der indeholder meGFP og mScarlet-mærkede proteiner.Fusion resulterer i en fordobling af centrosome antallet inde heterokaryons synlige som mindst fire pericentriolar materiale foci når centrosome pericentriolar komponent NEDD1 er fluorescerende mærket. Sammensmeltning af celler med endogen fluorescerende mærket rootletin gør det muligt at identificere oprindelsescellen for hver centrosome i en heterokaryon. Denne protokol viser, hvordan man smelter differentieret mærkede cellelinjer, og hvordan man afbilder deres organeller for at forstå deres struktur og funktion.Denne robuste protokol er både relativt let og relativt billigt at udføre i forhold til lignende metoder. Denne teknik kan bruges til at stille en række spørgsmål, såsom hvordan er organelle fusion reguleret, og hvordan cellerne reagerer på ændringer i subcellulære organelle nummer.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Metode til at studere Palatal Fusion hjælp Statisk Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Etablering af Genome-redigerede human pluripotente stamcellelinjer: Fra Målretning til Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Mikroinjektion for Transgenese og Genome Redigering i Trepigget Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generation af Parabiotic zebrafisk embryoner ved Kirurgisk Fusion af Udvikling Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Cell Lineage Analyser og genfunktion undersøgelser under anvendelse af Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Struktur og funktion Studier i embryonale stamceller fra mus Brug rekombinase-medieret Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Afledning af stamcellelinjer fra mus præimplantations embryoner

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluering af skade-induceret gulne og In Vivo omprogrammering i den skeletmuskulatur

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle billeddannelse af kromosom Segregation under mitosen

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...