Name: apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells at JoVE.com

ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا البروفيسور ناصوب تشو من جامعه تشجيانغ علي مشورته التقنية وعلي جعل معدات مختبره متاحه للاستعمال. وقد دعم هذا العمل ماليا المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 41876154 ، 41606150 ، 41406137) وصناديق البحوث الاساسيه للجامعات ومعاهد البحوث في مقاطعه تشجيانغ [منح عدد 2019JZ00007 ].

1. خليه ثقافة الاعداد المتوسطة
<ol><li>
اعداد السائل كوميوميك
	<ol>
<li>
جمع السوائل كوميوميك: في ظل ظروف معقمه ، تشريح خيار البحر صحية (الوزن الرطب من 85-105 غرام) ، وجمع السائل كوميوميك ، وتخزينها في قارورة زجاجيه معقمه.</li>
		<li>
أزاله الخلايا كوميوميك: الطرد المركزي السائل...

<ol>
	<li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone,+Haliotis+rufescens.">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li><li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins:+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers.">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).</li><li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis.">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718 (2016).</li><li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+(Lamarck,+1816).">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li><li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+(Crassostrea+gigas).">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li><li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance:+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction.">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration.">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li><li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li><li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka)+during+aestivation.">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li><li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus:+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses.">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li><li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database.">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li><li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+invertebrate+cell+culture:+a+decade+of+development.">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li><li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons.">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).</li><li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture:+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions.">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li><li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures.">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li><li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity.">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+proliferation,+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits.">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li><li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis.">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li><li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+long-term,+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes.">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li><li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+from+marine+invertebrates:+new+insights+for+capturing+endless+stemness.">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li><li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues.">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka).">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li></ol>

وقد كرست جهود بحثيه مكثفه لإنشاء خطوط خلوية في العقود الاخيره ، ومع ذلك ، لا يزال من الصعب احراز تقدم بشان الثقافة الطويلة الأجل للخلايا من لافقاريات البحرية14،22. وقد أفيد بان الخلايا المستزرعة من تجديد انسجه هولوثوريان كانت قابله للحياة لفتره طويلة من الزم...

وتوفر الخلايا المزروعة تحت ظروف خاضعه للسيطرة المصطنعة ، وليس في بيئتها الطبيعية ، مواد تجريبية موحده للدراسات البيولوجية ، وخاصه بالنسبة للأنواع التي لا يمكن زراعتها بسهوله في بيئة مختبريه. تمثل لافقاريات البحرية أكثر من 30% من جميع أنواع الماشية1، وتوفر العديد من المواد البيولوجية لاجراء البحوث حول أليات التنظيمية لعمليات بيولوجية محدده ، مثل التجديد2،3، الاستجابة للإجهاد4، والتكيف البيئي5،6.
خيار البحر ، Apostichopus japonغاريكوس، هو واحد من الأنواع اشوديرم الأكثر دراسة التي تسكن المياه المعتدلة علي طول ساحل شمال المحيط الهادي. ومن المعروف جيدا باسم الأنواع الهامه تجاريا والمراسي علي نطاق واسع في شرق اسيا ، وخاصه في الصين7. العديد من الاسئله العلمية المتعلقة ب. japonغاريكوس، بما في ذلك أليات التنظيمية الكامنة وراء التجدد المعوي بعد أحشاء8 وانحطاط في استيميل9، والسيطرة الايضيه10،11، واستجابه المناعي12،13 تحت الضغوط الحرارية أو المسببة للامراض ، ومع ذلك ، بالمقارنة مع الحيوانية نموذج مدروسه جيدا ، والبحوث الاساسيه ، وخاصه علي المستوي الخلوي ، محدوده بالاختناقات التقنية ، مثل عدم وجود أساليب متقدمة ثقافة الخلية.
وقد كرس الباحثون الكثير من الجهد لإنشاء خطوط خلوية ، ولكنهم واجهوا أيضا العديد من التحديات ولم يتم إنشاء اي خط خلوي من اي لافقاريات بحري حتى الآن14. ومع ذلك ، فقد تقدمت ثقافات الخلايا الاوليه من لافقاريات البحرية في العقود الاخيره15،16، وانها أتاحت فرصه لتجريب علي المستوي الخلوي. فعلي سبيل المثال ، استخدمت الخلايا المتجددة من ا. japonغاريكوس كمصدر للخلايا لثقافات الخلايا طويلة الأجل التي وفرت طريقه عمليه لثقافة الخلايا الاوليه لافقاريات البحرية17. ويجمع هذا البروتوكول والأمثل بين ثقافة الخلية لافقارياته ويطور أسلوبا للثقافة الاوليه مناسبا علي نطاق واسع لخيار البحر أو لافقاريات البحرية الأخرى.
المبرمج هو برنامج انتحار الخلية المتاصله التي تسببها مختلف المحفزات الخارجية والمحلية. تنسيق المبرمج هو أمر حاسم بالنسبة للعديد من النظم البيولوجية18,19, وقد تورطت في الانحدار المعوي من خيار البحر اثناء الاستيميل9. للتحقيق في عمليه ابوتوتيك في الكائنات الحية من الفائدة ، وقد تم إنشاء سلسله من الطرق ، بما في ذلك تلطيخ Hoechst واختبارات المجهر ، وتطبيقها بنجاح20. هنا ، أجرينا الحث المبرمج والكشف في الخلايا المعوية المستزرعة الاوليه من خيار البحر لتقييم قابليه استخدام الخلايا الاوليه في الدراسات البيولوجية لافقاريات البحرية. وقد استخدم ديكساميثازون ، واحده من كورتيزون الاصطناعية الشائعة الاستخدام21، للحث علي المبرمج في الخلايا المعوية مثقف من خيار البحر ، وتم الكشف عن اشاره Hoechst 33258 كبيره بنجاح في الخلايا الملونة عن طريق المجهر الفلورسنت.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 cm dishes</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>CS016-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80096618</td>
			<td>in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuges</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-30R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeyoClick EdU-488 kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0071S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10005817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Lucky Riptile</td>
			<td>HN-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW00500221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric thermostatic water bath</td>
			<td>senxin17</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80176961</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(FGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica DMI3000B</td>
			<td>DMI3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garamycin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW14054101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33258 Staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW1106168001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin like Growth Factor(IGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM41300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100 mg/mL)</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM-21051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW77863031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Bante</td>
			<td>A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>185791</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells

وتستخدم الخلايا المستزرعة الاوليه في مجموعه متنوعة من التخصصات العلمية كاداات هامه للغاية للتقييم الوظيفي للمواد البيولوجية أو توصيف الانشطه البيولوجية المحددة. ومع ذلك ، ونظرا لعدم وجود وسائل الاعلام الثقافة الخلية المطبقة عالميا والبروتوكولات ، وصفا جيدا أساليب ثقافة الخلية للكائنات البحرية لا تزال محدوده. وفي الوقت نفسه ، فان التلوث الجرثومي والخواص المتعددة المدارات للخلايا لافقاريات البحرية التي تحدث بشكل شائع تعيق إنشاء استراتيجية فعاله لاستزراع الخلايا في لافقاريات البحرية. هنا ، ونحن وصف طريقه سهله التعامل لزراعه الخلايا المعوية من الخيار البحر ابوستيشووس جابونوكوس. بالاضافه إلى ذلك ، ونحن نقدم مثالا علي الحث في المختبر المبرمج والكشف في الخلايا المعوية المستزرعة الاوليه. وعلاوة علي ذلك ، توفر هذه التجربة تفاصيل حول أسلوب الثقافة المناسبة ومجموعه الخلايا. البروتوكول الموصوف متوافق مع مجموعه متنوعة من عينات الانسجه المتاحة علي نطاق واسع من الكائنات البحرية بما في ذلك الجلد الشحمي ، الرخويات ، قشريات ، ويمكن ان توفر خلايا كافيه للعديد من التطبيقات التجريبية في المختبر. ومن شان هذه التقنية ان تمكن الباحثين من التلاعب بكفاءة بثقافات الخلايا الاوليه من لافقاريات البحرية وتيسير التقييم الوظيفي للمواد البيولوجية المستهدفة علي الخلايا.

هنا ، انشانا ثقافة الخلايا المعوية الاساسيه من ا. japonغاريكوس وعبور الخلايا. يظهر الشكل 1 الخلايا المستديرة في مراحل مختلفه من الخياطة. واختبارات تلطيخ ايدو توفر أدله مباشره للكشف عن النشاط التكاثري لهذه الخلايا المستديرة في مرحله لاحقه (الشكل 2). نحن أي?...

Watch this Scientific Journal Video about Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells at JoVE.com

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

هذا البروتوكول يوفر طريقه سهله للتعامل مع الثقافة الخلايا المعوية من خيار البحر ابوستيتشوكوس japonغاريس ومتوافق مع مجموعه متنوعة من العينات الانسجه المتاحة علي نطاق واسع من الكائنات البحرية بما في ذلك اشوداء الجلد ، الرخويات ، قشريات.

الحث المبرمج والكشف في الثقافة الاساسيه للخلايا المعوية الخيار البحر

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

ويوفر البروتوكول طريقة سهلة المقبض ومتوافقة على نطاق واسع لأسلوب ثقافة الخلية الأولية لللافقاريات البحرية. هذه التقنية تعطي الباحثين وسيلة لثقافة الخلايا اللافقارية البحرية لفترة طويلة نسبيا. وينبغي تزويد ثقافة الخلايا بخلفية جينية متسقة من أجل استخدام تطبيقات تجريبية بيولوجية أخرى مختلفة في مجال بحوث البيولوجيا البحرية.ونعتقد أن البروتوكول المبسط المشار إليه ينبغي أن يكون الخيار الجيد لممارسة البحث الجديد في هذا المجال. بعد التخدير، تشريح وجمع الأمعاء الأمامية، ثم قسم عينات الأنسجة عموديا وإزالة المحتويات الداخلية. غسل عينات الأنسجة في برنامج تلفزيوني مرتين وتطهيرها عن طريق الغمر في محلول الإيثانول 75٪ لمدة لا تزيد عن ثانيتين.ثم غسل عينات الأنسجة في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لإزالة الإيثانول، ونقل حوالي 100 ملليغرام من عينة الأنسجة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير معقم ملليلتر. إضافة 1.5 ملليلتر من ثقافة ما قبل الأمثل المتوسطة إلى كتلة النسيج المعوي خيار البحر و mince كتلة مع مقص الجراحية المعقمة حتى الحل غائم. إضافة 400 ميكرولترات من 0.25٪ التربسين.اخلطي الحل عن طريق الانعكاس وحضنيها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم تصفية الحل باستخدام مصفاة الخلية 100 ميكرون وجمع الترشيح في أنبوب جديد معقم اثنين ملليلتر أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. بالنسبة للبروتوكول الاختياري المبسط، يمكن نقل كتل الأنسجة المقطوعة في الوسائط المستزرعة مباشرة إلى أطباق ثم احتضانها.الطرد المركزي الأنبوب في 1700xG لمدة ثلاث دقائق، والتخلص من الفائق، ثم إعادة تعليق بيليه في ثقافة المتوسطة مع المضادات الحيوية، وغسلها مع المتوسطة الثقافة مرتين. تعيين قبل الحاضنة لثقافة الخلية، وتشغيله مقدما لمدة 24 ساعة على الأقل مع درجة حرارة 18 درجة مئوية والرطوبة المشبعة. ثم إعادة تعليق الخلايا باستخدام 200 ميكرولتر من المتوسطة المشار إليها، ونقلها إلى أطباق أربعة سنتيمترات.ثقافة الخلايا في الحاضنة. بعد ست ساعات، إخراجهم من الحاضنة وإضافة ملليلترين من الأطباق المتوسطة المشار إليها إلى أطباق زراعة الخلايا. كل 12 ساعة، تغيير نصف الوسط.بعد خمسة إلى سبعة أيام، تبدأ الخلايا في الانقسام. الحد من الآثار السلبية للمضادات الحيوية عن طريق تقليل تركيز المضادات الحيوية المشار إليها، البنسلين، الستريبتومايسين، وgentamicin في الوسط ثقافة إلى النصف. كل يومين إلى ثلاثة أيام، استبدال متوسطة ثقافة الخلية.عندما تصل كثافة الخلية الأساسية إلى 60٪ إجراء تمرير الخلية. أولاً، اغسل الخلايا المستزرعة مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة. إضافة 200 ميكرولترات من 0.25٪ تريبسين الحل إلى كل طبق، وتهيج يدويا الأطباق، وضمان تغطية القاع كله.تخلص من محلول التربسين، وحضن الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع ملليلتر واحد من ثقافة جديدة المتوسطة عن طريق الأنابيب وإعادة تعليق الخلايا. نقل 0.5 ملليلتر من تعليق الخلية إلى طبق جديد.إضافة 1.5 ملليلتر من المتوسطة الطازجة، واحتضان الخلايا في 18 درجة مئوية. بعد 12 ساعة، قم بتغيير الوسط، ومراقبة الخلايا تحت المجهر لتقييم الظروف. إعداد ثلاث مجموعات تجريبية، بما في ذلك عنصر تحكم، ومجموعتين من الحلول، مع 1 ميكرومولار و 100 ميكرومولار deximethazone.بعد الحضانة مع أو بدون deximethazone لمدة صفر، 24، أو 48 ساعة، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. بعد إيقاف الضوء، إضافة 300 ميكرولترات من حل hoechst 33258 في بئر إلى لوحة 12 جيدا، وتهيج بلطف لوحة لتغطية جميع الخلايا، وضمان تلطيخ بهم. احتضان في 18 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.ثم إزالة حل تلطيخ hoechst وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 300 ميكرولترات من الحل أربعة في المئة شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لكل بئر. يُثار بلطف لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني.الحفاظ على برنامج تلفزيوني بعد الغسيل الماضي للحفاظ على الخلايا المشمولة. قم بتشغيل أجهزة المجهر الفلورسنت، بما في ذلك طاقة مصباح الزئبق، وقوة الضوء الفلورية، والكمبيوتر الشخصي. قم بتسجيل الدخول إلى حساب نظام التشغيل، واطلّق البرنامج، وتحقق من تكوينه. ضع اللوحة المعدة على مرحلة المجهر.ضع العينة فوق العدسة الهدف باستخدام وحدة تحكم المرحلة. العثور على الخلايا ذات الاهتمام تحت المجهر الخفيفة. قم بالتبديل المجهري الفلوري وضبط معلمات الإثارة والانبعاثات إلى حوالي 352 و461 نانومتر، على التوالي، لمراقبة الحمض النووي.التقاط الصور. في هذه الدراسة، تم تأسيس ثقافة الخلايا المعوية الأولية من خيار البحر والمرور. تظهر خلايا مستديرة في مراحل مختلفة من الاستزراع هنا.هنا الخلايا تعلق على الجزء السفلي من الأطباق في اليوم الثالث، بعد أن بذر. هنا انتشار الخلايا في اليوم السابع. وهنا الخلايا تعلق على الجزء السفلي من الأطباق بعد passaging.والخلايا التي فقدت النشاط وكانت تموت بعد 10 ممرات. تقدم الأقوال التي تقدمها EDU أدلة مباشرة للكشف عن النشاط التكاثري لهذه الخلايا المستديرة في مراحل لاحقة. التحفيز مع واحد deximethazone micromolar زيادة معدل الخلايا المبرمج أسرع، مقارنة مع السيطرة و 100 ميكرومولار deximethazone التحفيز.تم التعامل مع الخلايا المستزرعة مع deximethazone لفترات زمنية مختلفة ، تليها هويشست 33258 تلطيخ للكشف عن الخلايا المبرمج. علاجات الخلايا قبل احتضان أمر بالغ الأهمية للسيطرة على المدى الطويل. وهو تذكير لمحاولة البروتوكول الاختياري المبسط عندما لا تنمو الخلية بشكل جيد.Paraformaldehyde هو معتدل السامة عن طريق ملامسة الجلد أو الاستنشاق، ويتم توثيقه على أنه ربما مسرطنة الإنسان.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

بروتوكول الفيديو من عدوى فيروسات الرجعية في الابتدائية المعوية عضي الثقافة

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

نموذج زراعة الأنسجة Granulosa البقري الأولية المنتجة للاستروجين خلايا

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...