Name: apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells at JoVE.com

Les auteurs souhaitent remercier le professeur Naiming Zhou de l'Université du Zhejiang pour ses conseils techniques et pour avoir mis à la disposition de l'équipement de son laboratoire une utilisation. Ce travail a été soutenu financièrement par la National Natural Science Foundation of China (numéros de subvention 41876154, 41606150 et 41406137) et les Fonds de recherche fondamentale pour les universités provinciales et les instituts de recherche du Zhejiang [numéro de subvention 2019JZ00007 ].

1. Préparation moyenne de culture cellulaire
<ol><li>
Préparation coelomic fluide
	<ol>
<li>
Collection de fluides coelomic : Dans des conditions stériles, disséquer un concombre de mer sain (poids humide de 85-105 g), recueillir du liquide coelomique et le stocker dans un flacon de verre stérile.</li>
		<li>
Enlèvement coelomic de cellules : Centrifuger le liquide coelomique dans des tubes de centrifugeuse de 50 ml à 1 700 x g pendant 5 min et transfé...

<ol>
	<li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone,+Haliotis+rufescens.">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li><li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins:+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers.">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).</li><li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis.">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718 (2016).</li><li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+(Lamarck,+1816).">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li><li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+(Crassostrea+gigas).">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li><li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance:+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction.">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration.">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li><li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li><li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka)+during+aestivation.">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li><li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus:+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses.">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li><li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database.">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li><li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+invertebrate+cell+culture:+a+decade+of+development.">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li><li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons.">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).</li><li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture:+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions.">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li><li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures.">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li><li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity.">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+proliferation,+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits.">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li><li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis.">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li><li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+long-term,+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes.">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li><li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+from+marine+invertebrates:+new+insights+for+capturing+endless+stemness.">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li><li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues.">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka).">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li></ol>

Des efforts de recherche approfondis ont été consacrés à l'établissement de lignées cellulaires au cours des dernières décennies, cependant, il est encore difficile de faire des progrès sur la culture à long terme des cellules des invertébrés marins14,22. Il a été rapporté que les cellules cultivées des tissus holothuriens régénérants étaient viables pendant une longue période de temps et l'activité élevée de la prolifération peut être d...

La culture des cellules dans des conditions artificiellement contrôlées, et non dans leur environnement naturel, fournit des matériaux expérimentaux uniformes pour les études biologiques, en particulier pour les espèces qui ne peuvent pas être facilement cultivées dans un environnement de laboratoire. Les invertébrés marins représentent plus de 30% de toutes les espèces animales1, et ils fournissent de nombreux matériaux biologiques pour entreprendre des recherches sur les mécanismes de régulation de processus biologiques spécifiques, tels que la régénération2,3, la réponse au stress4, et l'adaptation environnementale5,6.
Le concombre de mer, Apostichopus japonicus, est l'une des espèces d'échinodermes les plus étudiées qui habitent les eaux tempérées le long de la côte du Pacifique Nord. Il est bien connu comme une espèce commercialement importante et maricultured sur une grande échelle en Asie de l'Est, en particulier en Chine7. De nombreuses questions scientifiques concernant A. japonicus, y compris les mécanismes de régulation sous-jacents à la régénération intestinale après l'éviscération8 et la dégénérescence dans l'estivation9, le contrôle métabolique10,11, et la réponse immunitaire12,13 sous des contraintes thermiques ou pathogènes, ont attiré l'attention des chercheurs. Cependant, par rapport aux animaux modèles bien étudiés, la recherche fondamentale, en particulier au niveau cellulaire, est limitée par des goulots d'étranglement techniques, tels que l'absence de méthodes avancées de culture cellulaire.
Les chercheurs ont consacré beaucoup d'efforts à l'établissement de lignées cellulaires, mais ils ont également fait face à de nombreux défis et aucune lignée cellulaire d'aucun invertébré marin n'a été établie encore14. Cependant, les cultures cellulaires primaires des invertébrés marins ont progressé au cours des dernières décennies15,16, et ils ont fourni une occasion d'expérimentation au niveau cellulaire. Par exemple, l'intesine régénératrice de A. japonicus a été utilisée comme source de cellules pour les cultures cellulaires à long terme qui ont fourni une méthode pratique pour la culture cellulaire primaire des invertébrés marins17. Ce protocole a combiné et optimisé les approches de culture cellulaire des invertébrés et a mis au point une méthode de culture primaire largement appropriée pour le concombre de mer ou d'autres invertébrés marins.
L'apoptose est un programme intrinsèque de suicide cellulaire déclenché par divers stimuli exogènes et endogènes. L'apoptose coordonnée est cruciale pour de nombreux systèmes biologiques18,19, et il a été impliqué dans la régression intestinale du concombre de mer lors de l'aestivation9. Pour étudier le processus apoptotique dans les organismes d'intérêt, une série de méthodes, y compris la coloration Hoechst et des essais de microscopie, ont été établis et appliqués avec succès20. Ici, nous avons effectué l'induction et la détection d'apoptose dans les cellules intestinales cultivées primaires du concombre de mer pour évaluer la facilité d'utilisation des cellules primaires dans les études biologiques des invertébrés marins. Dexamethasone, l'un des glucocorticostéroïdes synthétiques couramment utilisés21, a été utilisé pour induire l'apoptose dans les cellules intestinales cultivées de concombre de mer, et le signal significatif Hoechst 33258 a été détecté avec succès dans les cellules tachées par microscopie fluorescente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 cm dishes</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>CS016-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80096618</td>
			<td>in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuges</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-30R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeyoClick EdU-488 kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0071S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10005817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Lucky Riptile</td>
			<td>HN-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW00500221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric thermostatic water bath</td>
			<td>senxin17</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80176961</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(FGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica DMI3000B</td>
			<td>DMI3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garamycin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW14054101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33258 Staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW1106168001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin like Growth Factor(IGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM41300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100 mg/mL)</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM-21051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW77863031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Bante</td>
			<td>A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>185791</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells

Les cellules cultivées primaires sont utilisées dans une variété de disciplines scientifiques comme outils exceptionnellement importants pour l'évaluation fonctionnelle des substances biologiques ou la caractérisation d'activités biologiques spécifiques. Cependant, en raison de l'absence de médias et de protocoles de culture cellulaire universellement applicables, les méthodes de culture cellulaire bien décrites pour les organismes marins sont encore limitées. Pendant ce temps, la contamination microbienne et les propriétés polytropes des cellules d'invertébrés marins entravent davantage l'établissement d'une stratégie efficace de culture cellulaire pour les invertébrés marins. Ici, nous décrivons une méthode facile à manipuler pour cultiver les cellules intestinales du concombre de mer Apostichopus japonicus; en outre, nous fournissons un exemple d'induction et de détection in vitro d'apoptose dans les cellules intestinales cultivées primaires. En outre, cette expérience fournit des détails sur le milieu de culture approprié et la méthode de collecte cellulaire. Le protocole décrit est compatible avec une variété d'échantillons de tissus largement disponibles provenant d'organismes marins, y compris Echinodermata, Mollusca et Crustacea, et il peut fournir des cellules suffisantes pour de multiples applications expérimentales in vitro. Cette technique permettrait aux chercheurs de manipuler efficacement les cultures cellulaires primaires des invertébrés marins et de faciliter l'évaluation fonctionnelle des matériaux biologiques ciblés sur les cellules.

Ici, nous avons établi la culture intestinale primaire de cellules de A. japonicus et avons passages les cellules. La figure 1 montre les cellules rondes à différents stades de la culture. Et les tests de coloration EdU fournissent des preuves directes pour révéler l'activité proliférante de ces cellules rondes à un stade ultérieur (Figure 2). Nous avons également légèrement ajusté le protocole, crepandant des blocs de tissu hachés au lieu...

Watch this Scientific Journal Video about Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells at JoVE.com

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Ce protocole fournit une méthode facile à manipuler pour la culture des cellules intestinales du concombre de mer Apostichopus japonicus et est compatible avec une variété d'échantillons de tissus largement disponibles provenant d'organismes marins, y compris Echinodermata, Mollusca et Crustacea.

Induction et détection d'apoptosis dans une culture primaire des cellules intestinales de concombre de mer

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Le protocole fournit une méthode de culture cellulaire primaire facile à manipuler et largement compatible pour les invertébrés marins. Cette technique donne aux chercheurs un moyen de culturer les cellules invertébrées marines pendant relativement longtemps. Une culture des cellules devrait être fournie avec le fond génétique cohérent pour différentes autres applications expérimentales biologiques dans la recherche marine de biologie.Pour la nouvelle recherche dans ce domaine, nous croyons que le protocole simplifié indiqué devrait être le bon choix à exercer. Après l’anesthésie, disséquer et recueillir les intestins antérieurs, puis sectionner les échantillons de tissu verticalement et enlever le contenu intérieur. Lavez les échantillons de tissus en PBS deux fois et désinfectez-les par immersion dans une solution à 75 % d’éthanol pendant au plus deux secondes.Ensuite, lavez les échantillons de tissu dans PBS trois fois pour enlever l’éthanol, et transférer environ 100 milligrammes d’échantillon de tissu dans un tube stérile de micro centrifugeuse de deux millilitres. Ajouter 1,5 millilitres de milieu de culture pré-optimisé au bloc de tissu intestinal du concombre de mer et hacher le bloc avec des ciseaux chirurgicaux stérilisés jusqu’à ce que la solution soit trouble. Ajouter 400 microlitres de trypsine de 0,25%.Mélanger la solution par inversion et l’incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Filtrez ensuite la solution à l’aide d’une passoire cellulaire de 100 microns et recueillez le filtrate dans un nouveau tube stérile de micro centrifugeuse de deux millilitres. Pour un protocole simplifié facultatif, les blocs tissulaires coupés dans des supports cultivés peuvent être directement transférés dans la vaisselle et ensuite incubés.Centrifuger le tube à 1700xG pendant trois minutes, jeter le supernatant, puis re-suspendre la pastille dans le milieu de la culture avec des antibiotiques, et le laver avec le milieu de la culture deux fois. Prédécez l’incubateur pour la culture cellulaire, et exécutez-le à l’avance pendant au moins 24 heures avec la température de 18 degrés Celsius et l’humidité saturée. Puis re-suspendre les cellules à l’aide de 200 microlitres de milieu indiqué, et les transférer dans des plats de quatre centimètres.Culture des cellules dans un incubateur. Après six heures, sortez-les de l’incubateur et ajoutez deux millilitres de milieu indiqué aux plats de culture cellulaire. Toutes les 12 heures, changer la moitié du milieu.Après cinq à sept jours, les cellules commencent à se diviser. Réduire de moitié les effets néfastes des antibiotiques en réduisant de moitié la concentration d’antibiotiques indiqués, de pénicilline, de streptomycine et de gentamicine dans le milieu de la culture. Tous les deux à trois jours, remplacer le milieu de culture cellulaire.Lorsque la densité cellulaire primaire atteint 60%, conduire le passage cellulaire. Tout d’abord, laver les cellules de culture deux fois en utilisant PBS à température ambiante. Ajouter 200 microlitres de solution trypsine de 0,25% à chaque plat, et agiter manuellement la vaisselle, en veillant à ce que tout le fond soit couvert.Jetez la solution de trypsine et incubez les cellules pendant cinq minutes à température ambiante. Lavez les cellules avec un millilitre de milieu de culture frais en pipetage et en suspendant à nouveau les cellules. Transférer 0,5 millilitres de suspension cellulaire dans un nouveau plat.Ajouter 1,5 millilitres de milieu frais et incuber les cellules à 18 degrés Celsius. Après 12 heures, changer le milieu, et observer les cellules sous un microscope pour évaluer les conditions. Préparez trois groupes expérimentaux, dont un contrôle, et deux groupes de solutions, avec un micromolaire et 100 micromolaires deximethazone.Après incubation avec ou sans deximethazone pendant zéro, 24 ou 48 heures, lavez les cellules trois fois avec PBS. Après avoir éteint la lumière, ajouter 300 microlitres de hoechst 33258 solution par puits à une plaque de 12 puits, et agiter doucement la plaque pour couvrir toutes les cellules, assurant leur coloration. Incuber à 18 degrés Celsius pendant 30 minutes.Retirez ensuite la solution de coloration hoechst et fixez les cellules en ajoutant 300 microlitres de solution de paraformaldéhyde de quatre pour cent dans PBS à chaque puits. Agiter doucement pendant 15 minutes. Après cela, laver les cellules fixes trois fois dans PBS.Gardez le PBS après le dernier lavage pour garder les cellules couvertes. Allumez le matériel du microscope fluorescent, y compris la puissance de la lampe au mercure, la puissance de la lumière fluorescente et le PC. Connectez-vous au compte du système d’exploitation, lancez le logiciel et vérifiez sa configuration. Placez la plaque préparée au microscope.Placez l’échantillon au-dessus de la lentille objective à l’aide du contrôleur de scène. Trouvez les cellules d’intérêt sous le microscope à lumière. Passez à la microscopie fluorescente et ajustez les paramètres de l’excitation et de l’émission à environ 352 et 461 nanomètres, respectivement, pour l’observation de l’ADN des noyaux.Capturez les images. Dans cette étude, la culture intestinale primaire de cellules du concombre de mer a été établie et passage. Les cellules rondes à différents stades de la culture sont montrées ici.Voici les cellules attachées au fond des plats le troisième jour, après avoir été ensemencées. Voici la prolifération cellulaire le septième jour. Voici les cellules attachées au fond de la vaisselle après la passaging.Et les cellules qui ont perdu l’activité et mouraient après 10 passages. Les analyses indiquant eDU fournissent des preuves directes pour révéler l’activité proliférative de ces cellules rondes dans les étapes ultérieures. La stimulation avec un deximethazone micromolaire a augmenté le taux de cellules apoptotiques le plus rapidement, par rapport à la commande et la stimulation de 100 micromolaires deximethazone.Les cellules de culture ont été traitées avec deximethazone pendant différentes périodes de temps, suivies de la coloration hoechst 33258 pour la détection de cellules apoptotiques. Les traitements cellulaires avant l’incubation sont essentiels pour le contrôle à long terme. C’est un rappel d’essayer le protocole simplifié facultatif lorsque la cellule ne se développe pas bien.Le paraformaldéhyde est modérément toxique par contact avec la peau ou par inhalation, et il est documenté comme étant probablement cancérogène pour l’homme.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Culture primaire et l&#39;électroporation plasmidique de l&#39;Organe de Corti murin.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Recherche

Biologie

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Induction et les essais de l&#39;hypoxie en culture cellulaire

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Un protocole de vidéo infections rétrovirales dans intestinale primaire Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Un modèle de Culture tissulaire d’oestrogène-production primaire Bovine Granulosa cellules

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...