Name: apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells at JoVE.com

Författarna vill tacka prof. Naiming Zhou från Zhejiang universitet för hans tekniska råd och för att göra utrustningen av hans laboratorium tillgängliga för användning. Detta arbete stöddes ekonomiskt av National Natural Science Foundation i Kina (Grant nummer 41876154, 41606150 och 41406137) och de grundläggande forskningsfonderna för Zhejiang provinsiella universitet och forskningsinstitut [Grant Number 2019JZ00007 ].

1. cell odling medelstor beredning
<ol><li>
Coelomic vätska förberedelse
	<ol>
<li>
Coelomic Fluid insamling: Under sterila förhållanden, dissekera en frisk sjögurka (våtvikt av 85-105 g), samla coelomic vätska, och förvara den i en steril glaskolv.</li>
		<li>
Coelomic cell borttagning: Centrifugera den coelomic vätskan i 50 mL centrifugrör på 1 700 x g i 5 min och överföra supernatanten till en ny steril glaskolv; därefter samla in den cell fri...

<ol>
	<li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone,+Haliotis+rufescens.">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li><li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins:+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers.">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).</li><li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis.">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718 (2016).</li><li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+(Lamarck,+1816).">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li><li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+(Crassostrea+gigas).">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li><li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance:+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction.">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration.">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li><li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li><li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka)+during+aestivation.">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li><li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus:+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses.">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li><li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database.">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li><li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+invertebrate+cell+culture:+a+decade+of+development.">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li><li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons.">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).</li><li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture:+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions.">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li><li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures.">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li><li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity.">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+proliferation,+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits.">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li><li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis.">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li><li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+long-term,+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes.">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li><li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+from+marine+invertebrates:+new+insights+for+capturing+endless+stemness.">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li><li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues.">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka).">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li></ol>

Omfattande forskningsinsatser har ägnats åt att etablera cellinjer under de senaste decennierna, men det är fortfarande svårt att göra framsteg på långsiktig kultur av celler från Marina ryggradslösa djur14,22. Det har rapporterats att odlade celler från regenererande holothurian vävnader var livskraftiga under en lång tidsperiod och hög aktivitet av proliferation kan upptäckas i specifika celler17,<sup class="xref...

Odling av celler under artificiellt kontrollerade betingelser, och inte i deras naturliga miljö, ger enhetliga experimentella material för biologiska studier, särskilt för arter som inte lätt kan odlas i laboratoriemiljö. Marina ryggradslösa djur står för mer än 30% av alla djurarter1, och de tillhandahåller många biologiska material för att bedriva forskning om regleringsmekanismerna för specifika biologiska processer, såsom Regeneration2,3, stress svar4och miljöanpassning5,6.
Sjögurka, apostichopus japonicus, är en av de mest studerade artikel om arter som lever tempererade vatten längs Norra Stillahavskusten. Det är välkänt som en kommersiellt viktig art och mariculodlade i stor skala i Östasien, särskilt i Kina7. Många vetenskapliga frågor om A. japonicus, inklusive de reglerande mekanismerna bakom intestinal förnyelse efter urtagning8 och degeneration i aestivation9, metabolisk kontroll10,11, och immunsvar12,13 under termiska eller patogena spänningar, har uppmärksammats av forskare. Men jämfört med väl studerade modell djur, grundforskning, särskilt på cellnivå, begränsas av tekniska flaskhalsar, såsom avsaknaden av avancerade metoder cellodling.
Forskare har ägnat mycket arbete åt att etablera cellinjer, men de har också stått inför många utmaningar och ingen cellinjer från några Marina ryggradslösa djur har etablerats ännu14. Men primära cellkulturer från Marina ryggradslösa djur har avancerat i senaste decennierna15,16, och de har gett en möjlighet för experiment på cellnivå. Till exempel, den regenererande intesine från A. japonicus har utnyttjats som en källa till celler för långsiktiga cellkulturer som gav en praktisk metod för primär cellkultur av Marina ryggradslösa djur17. Detta protokoll kombinerade och optimerade strategier för ryggradslösa cellkulturer och utvecklade en allmänt lämplig primär kultur metod för sjögurka eller andra ryggradslösa marina djur.
Apoptos är en inneboende cell självmord program som utlöses av olika exogena och endogena stimuli. Koordinerad apoptos är avgörande för många biologiska system18,19, och det har varit inblandad i intestinal regression av sjögurka under aestivation9. För att undersöka den apoptotiska processen i organismer av intresse, en rad metoder, inklusive Hoechst färgning och mikroskopi analyser, har upprättats och framgångsrikt tillämpas20. Här genomförde vi apoptos induktion och detektion i primära odlade tarmceller av sjögurka för att bedöma användbarheten av primära celler i biologiska studier av Marina ryggradslösa djur. Dexametason, en av de vanligaste syntetiska glukokortikosteroiderna21, användes för att inducera apoptos i odlade tarmceller från sjögurka, och betydande Hoechst 33258 signal framgångsrikt upptäcktes i de färgade cellerna av fluorescerande mikroskopi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 cm dishes</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>CS016-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80096618</td>
			<td>in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuges</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-30R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeyoClick EdU-488 kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0071S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10005817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Lucky Riptile</td>
			<td>HN-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW00500221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric thermostatic water bath</td>
			<td>senxin17</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80176961</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(FGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica DMI3000B</td>
			<td>DMI3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garamycin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW14054101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33258 Staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW1106168001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin like Growth Factor(IGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM41300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100 mg/mL)</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM-21051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW77863031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Bante</td>
			<td>A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>185791</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells

Primära odlade celler används i en mängd olika vetenskapliga discipliner som exceptionellt viktiga verktyg för funktionell utvärdering av biologiska substanser eller karakterisering av specifika biologiska aktiviteter. Men på grund av bristen på universellt tillämpliga cellkultur medier och protokoll, väl beskrivna cell odlingsmetoder för marina organismer är fortfarande begränsade. Under tiden hämmar den vanligast förekommande mikrobiella föroreningen och de polytropiska egenskaperna hos Marina ryggradslösa celler ytterligare inrättandet av en effektiv cellkultur strategi för Marina ryggradslösa djur. Här beskriver vi en lätt att hantera metod för odling av tarmceller från sjögurka Apostichopus japonicus; Dessutom, vi ger ett exempel på in vitro-apoptos induktion och detektion i primära odlade tarmceller. Dessutom ger detta experiment information om lämplig odlingsmedium och cellinsamlingsmetod. Det beskrivna protokollet är förenligt med en mängd allmänt tillgängliga vävnadsprover från marina organismer, inklusive ECHINODERMATA, Mollusca och Crustacea, och det kan ge tillräckliga celler för flera in vitro-experimentella tillämpningar. Denna teknik skulle göra det möjligt för forskare att effektivt manipulera primär cellkulturer från Marina ryggradslösa djur och att underlätta funktionell utvärdering av riktade biologiska material på celler.

Här etablerade vi primär intestinal cellkultur av A. japonicus och passerade cellerna. Figur 1 visar runda celler i olika stadier av odling. Och EdU färgning analyser ger direkta bevis för att avslöja den proliferativa aktiviteten av dessa runda celler i senare skede (figur 2). Vi justerade också något protokollet, odling av malet vävnad block i stället för filtrerat celler; Dessutom kan en spindel celltyp odlas framgångsrikt. Denna celltyp i...

Watch this Scientific Journal Video about Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells at JoVE.com

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Detta protokoll ger en lätt att hantera metod för att odla tarmcellerna från sjögurka Apostichopus japonicus och är kompatibel med en mängd olika allmänt tillgängliga vävnadsprover från marina organismer, inklusive ECHINODERMATA, Mollusca, och Crustacea.

Apoptos induktion och detektion i en primär kultur av hav gurka tarmceller

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Protokollet ger en lätthanterlig och allmänt kompatibel primär cellodlingsmetod för marina ryggradslösa djur. Denna teknik ger forskarna ett sätt att odla de marina ryggradslösa cellerna under jämförelsevis lång tid. En kultur av celler bör förses med konsekvent genetisk bakgrund för olika ytterligare biologiska experimentella tillämpningar inom marinbiologisk forskning.Till den nya forskningen till detta område, anser vi att det angivna förenklade protokollet bör vara det goda valet att utöva. Efter anestetisering, dissekera och samla in de främre tarmarna, sedan sektioner vävnadsproverna vertikalt och ta bort det inre innehållet. Tvätta vävnadsproverna i PBS två gånger och desinficera dem genom nedsänkning i en 75%etanollösning under högst två sekunder.Sedan tvätta vävnadsprover i PBS tre gånger för att ta bort etanol, och överföra cirka 100 milligram vävnadsprov i en två milliliter steril mikro centrifug röret. Tillsätt 1,5 milliliter av föroptimerat odlingsmedium till sjögurkans tarmvävnadsblock och finhacka blocket med steriliserad kirurgisk sax tills lösningen är grumlig. Lägg till 400 mikroliter av 0,25%trypsin.Blanda lösningen genom inversion och inkubera den i fem minuter i rumstemperatur. Filtrera sedan lösningen med hjälp av en 100 mikron cell sil och samla filtratet i en ny steril två milliliter mikro centrifugrör. För valfritt förenklat protokoll kan vävnadsblock som skärs i odlade medier direkt överföras till rätter och därefter inkuberas.Centrifugera röret på 1700xG i tre minuter, kasta supernatanten, sedan åter upphäva pelleten i odlingsmedium med antibiotika, och tvätta den med odlingsmedium två gånger. Förinställda inkubatorn för cellodling, och kör den i förväg i minst 24 timmar med temperaturen 18 grader Celsius och mättad luftfuktighet. Sedan åter avbryta cellerna med 200 mikroliter av indikerade medium, och överföra dem i fyra centimeter rätter.Odla cellerna i en inkubator. Efter sex timmar, ta dem ur inkubatorn och tillsätt två milliliter av indikerat medium till cellen odlingsrätter. Var 12:e timme, byt hälften av mediet.Efter fem till sju dagar börjar cellerna att dela sig. Minska de negativa effekterna av antibiotika genom att minska koncentrationen av indikerade antibiotika, penicillin, streptomycin, och gentamicin i odlingsmediet med hälften. Varannan till var tredje dag, byt ut cellodlingsmediet.När den primära celltätheten når 60%genomför cellpassning. Tvätta först de odlade cellerna två gånger med PBS i rumstemperatur. Lägg till 200 mikroliter av 0,25%trypsin lösning till varje maträtt, och manuellt agitera disken, se till att hela botten är täckt.Kassera trypsinlösningen och inkubera cellerna i fem minuter i rumstemperatur. Tvätta cellerna med en milliliter färskt odlingsmedium genom pipettering och återupphängning av cellerna. Överför 0,5 milliliter cellupphängning till en ny rätt.Tillsätt 1,5 milliliter färskt medium och inkubera cellerna i 18 grader Celsius. Efter 12 timmar, ändra mediet, och observera cellerna under ett mikroskop för att utvärdera villkoren. Förbered tre experimentella grupper, inklusive en kontroll, och två grupper av lösningar, med en mikromolar och 100 mikromolar deximethazone.Efter inkubation med eller utan deximethazon för noll, 24 eller 48 timmar, tvätta cellerna tre gånger med PBS. Efter att stänga av ljuset, tillsätt 300 mikroliter hoechst 33258 lösning per brunn till en 12 väl platta, och försiktigt agitera plattan för att täcka alla celler, säkerställa deras färgning. Inkubera vid 18 grader Celsius i 30 minuter.Ta sedan bort hoechst färgningslösningen och fixera cellerna genom att lägga till 300 mikroliter av fyra procent paraformaldehydlösning i PBS till varje brunn. Agitera försiktigt i 15 minuter. Därefter tvättar du de fasta cellerna tre gånger i PBS.Håll PBS efter den sista tvätten för att hålla cellerna täckta. Slå på lysrörsmikroskop hårdvara, inklusive kvicksilverlampan makt, fluorescerande ljus makt, och PC. Logga in på operativsystemets konto, starta programvaran och kontrollera dess konfiguration. Placera den förberedda plattan på mikroskopstadiet.Placera provet över objektivet objektivet med hjälp av scenen styrenheten. Hitta de celler av intresse under ljusmikroskopet. Byt till fluorescerande mikroskopi och justera parametrarna för excitering och utsläpp till cirka 352 respektive 461 nanometer för DNA-observation.Ta bilderna. I denna studie, primära intestinal cell kultur av sjögurka fastställdes och passaged. Runda celler i olika stadier av odling visas här.Här är celler knutna till botten av rätter på den tredje dagen, efter att ha sådd. Här är cellproliferation på den sjunde dagen. Här är celler som är fästa på diskens botten efter passaging.Och celler som förlorade aktivitet och var döende efter 10 passager. EDU anger analyser ger direkta bevis för att avslöja proliferative aktiviteten av dessa runda celler i senare skeden. Stimuleringen med en mikromolar deximethazone ökade den apoptotiska cellfrekvensen mest snabbt, jämfört med kontrollen och 100 mikromolar deximethazone stimulering.De odlade cellerna behandlades med deximethazone för olika tidsperioder, följt av hoechst 33258 färgning för apoptotiska cell upptäckt. Cellbehandlingar före inkubering är kritiskt för långsiktig kontroll. Det är en påminnelse om att prova det valfria förenklade protokollet när cellen inte växer bra.Paraformaldehyd är måttligt giftigt genom hudkontakt eller inandning, och det är dokumenterat som en förmodligen cancerframkallande för människor.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primär Kultur och Plasmid elektroporation av Murine organ Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Induktion och testning av Hypoxi i cellodling

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

En video-protokollet av retroviral infektion i Primär Intestinal organoid kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Bedömning av Selektiv mRNA Översättning i däggdjursceller vid polysom ​​Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En vävnadskultur modell av östrogen-producerande primära nötkreatur Granulosa celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...