Name: nf-&#954;b-dependent luciferase activation and quantification of gene expression in salmonella infected tissue culture cells
Uploaded: 2020-01-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NF-ÎºB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells at JoVE.com

Keestra-Gounder 实验室的研究由 NIH NIAID 提供编号为 R21AI122092 的资助，美国糖尿病协会获得第 1-18-JDF-035 奖的资助。

1. 细胞传种和播种
<ol><li>在含有10mL的Dulbeco改性鹰培养基（DMEM）的75cm2烧瓶中保持HeLa 57A细胞，在5%的CO2培养箱中，在37°C下辅以5%热灭活胎儿牛血清（FBS）。</li>
	<li>吸气细胞培养基，用1mL0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液洗涤。吸气胰蛋白酶，并替换为额外的1 mL。将烧瓶置于 37°C 培养箱中 4-5 分钟，让细胞从烧瓶中分离。</li>
	<li>加入9 mL的细胞培养基，轻轻清洗瓶底几次，使细胞脱落，形?...

<ol>
	<li>Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+signaling+in+inflammation.">NF-kappaB signaling in inflammation.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).</li><li>Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB:+a+stress-regulated+switch+for+cell+survival.">NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).</li><li>Lawrence, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+factor+NF-kappaB+pathway+in+inflammation.">The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).</li><li>Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+ICP27-dependent+activation+of+NF-kappaB.">Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB.</a> Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).</li><li>Zaragoza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+protease+cleavage+of+inhibitor+of+kappaBalpha+triggers+host+cell+apoptosis.">Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+effector+binding+to+ribosomal+protein+s3+subverts+NF-kappaB+function.">Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function.</a> PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).</li><li>Kravchenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gene+expression+via+disruption+of+NF-kappaB+signaling+by+a+bacterial+small+molecule.">Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule.</a> Science. 321 (5886), 259-263 (2008).</li><li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+to+NF-kappaB+by+Toll-like+receptors.">Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).</li><li>Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Targeting+by+Enteropathogenic+Bacteria+T3SS+Effectors.">Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors.</a> Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).</li><li>Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+NF-kappaB+is+activated:+the+role+of+the+IkappaB+kinase+(IKK)+complex.">How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex.</a> Oncogene. , (1999).</li><li>Berti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+RT-PCR+analysis+of+inflammatory+gene+expression+associated+with+ischemia-reperfusion+brain+injury.">Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Holden, N. S., Tacon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+problems+of+the+electrophoretic+mobility+shift+assay.">Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).</li><li>Renard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).</li><li>Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+NF-kappaB+Activation+in+TLR-Activated+Macrophages.">Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).</li><li>Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+retention+of+IkappaBalpha+protects+it+from+signal-induced+degradation+and+inhibits+nuclear+factor+kappaB+transcriptional+activation.">Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).</li><li>Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+endoplasmic+reticulum+stress+response+impacts+the+NOD1+signaling+pathway.">Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aromatic-Dependent+Salmonella-Typhimurium+Are+Non-Virulent+and+Effective+as+Live+Vaccines.">Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines.</a> Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).</li><li>Keestra, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+small+Rho+GTPases+is+a+pathogen-induced+process+detected+by+NOD1.">Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1.</a> Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).</li><li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+characterization+of+NF-kappaB+binding+uncovers+non-canonical+motifs+and+advances+the+interpretation+of+genetic+functional+traits.">Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits.</a> Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+mutants+as+sensors+of+proteome+stress.">Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress.</a> Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).</li><li>Cogswell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+regulates+IL-1+beta+transcription+through+a+consensus+NF-kappa+B+binding+site+and+a+nonconsensus+CRE-like+site.">NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site.</a> Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).</li><li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Heterodimeric+Cysteine+Protease+Is+Required+for+Interleukin-1-Beta+Processing+in+Monocytes.">A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li></ol>

所述协议的主要贡献是，它提供了一种快速和简单的方法来检测细胞中的NF-βB激活，从而能够对影响NF-βB活化的多种刺激条件或药物进行高通量分析。在这里，我们描述了在沙门氏菌感染的HeLa细胞中NF-βB激活的协议。这些细胞可用于感染其他病原体，以及研究细菌感染对NF-βB活化的影响。此外，在HeLa 57A细胞中NF-βB依赖性荧光酶活化可用于筛选信号通路的活化剂或抑制剂，导致NF-βB激活。?...

核因子-βB（NF-B）系列蛋白质是调节各种生物途径中基因表达的重要转录活化剂。NF-βB的激活诱导靶基因的转录，其中许多基因对免疫和炎症反应、细胞增殖、应激反应和癌症进展1、2都很重要。NF-βB在调解早期炎症结果以清除病原体方面起着不可或缺的作用。鉴于由NF-β-B激活调节的许多生物过程，其信号中断可能会对健康和疾病产生严重后果。NF-βB信号的功能突变的丧失与几种免疫缺陷表型有关，而功能突变的增益与几种癌症有关，包括B细胞淋巴瘤和乳腺癌3。此外，许多病原体已被证明通过表达毒性因子4、5、6、7直接调节NF-βB的激活状态。
NF-βB的激活被认为是许多可变刺激的结果，包括细菌产物，如脂多糖（LPS）、鞭霉蛋白和称为病原体相关分子模式（PAMPs）的肽类。这些PAMP由模式识别受体（PRRs）检测，如收费受体（TPR）和点头样受体（NLRs），导致NF-βB的激活和NF-βB依赖性炎症基因8的后续表达。除了PPP的PRR活化外，其他细菌产物，如细菌效应蛋白，可以诱导NF-βB的活化。有趣的是，细菌还表达有效蛋白，主动衰减NF-βB通路，增强其致病性，强调NF-βB作为免疫9的重要中介的重要性。
有五个不同的子单位，形成NF-βB二聚体;p50，p52，RelA（p65），RelB 和 crel。两个主要的NF-+B杂物是p50：RelA和p52：RelB二聚苯醚。激活的NF-βB二聚体结合各种目标基因的启动子和增强剂区域的DNA位点，称为βB位点。在正常的静息条件下，NF-βB与一系列称为I+B蛋白的抑制剂蛋白相互作用，保持不活性。在刺激时，I+B由I+B基纳斯（IKK）磷酸化，允许其被靶向成泛化，并随后降解。I+B 的降解通过揭示核定位信号激活 NF-+B。NF-βB然后转移到细胞核，在目标基因的启动位区域结合βB位点，促进转录10。因此，NF-βB的激活调节了NF-βB靶基因的mRNA表达，这种变化可以通过RNA定量测定，如RT-qPCR11。
存在几种方法，通常用于NF-βB活化的测量，包括电泳移动转移测定（EMSA）、核易位和基因报告器测定。EMSA用于检测核酸的蛋白质复合物。刺激细胞被分馏以分离核蛋白，包括转移的NF-βB，然后用含有NF-βB结合域的放射性标记核苷酸孵育。样品在凝胶上运行，并通过32个P标记核酸的自成像成像。如果NF-βB存在于蛋白质馏分中，它将结合核苷酸，核苷酸在凝胶中迁移较慢，并作为离散带出现。缺乏活性NF-βB（例如，未刺激控制细胞）的细胞的核部分不会产生带状，因为核苷酸会更快地迁移到凝胶的末端。此方法的一个主要缺点是，它在很大程度上是定量的二进制意义上的（即打开或关闭），并且不能充分捕获 NF-+B 绑定容量中有意义的差异。此外，这种方法不考虑对NF-βB靶基因12、13具有功能重要性的染色质结构。
与前一种方法类似，存在一种"非移位"测定法，其中多孔板涂有含有NF-βB结合序列的核苷酸。在对含有核蛋白质成分的细胞进行处理后，NF-βB将与结合在井上的核苷酸结合。然后加入抗NF-βB抗体，与结合的NF-βB相互作用，产生与NF-βB量成比例的色度信号，指示NF-βB的激活程度。这种方法优于EMSA，因为它不需要放射性标记的核酸，是定量的，相比之下。然而，这种方法的一个警告是，它再次不区分NF-βB靶基因14的染色质状态。
另一种可以检测NF-βB活化的方法是通过染色质免疫沉淀（ChIP），即DNA和相互作用的蛋白质与甲醛交联，免疫沉淀与特定的抗NF-β-B抗体。然后，通过PCR扩增或直接高通量测序，对特定的核苷酸片段进行纯化和识别。该方法产生的结果是NF-βB结合活性与靶基因的半定量结果。然而，结果高度依赖于每个步骤15的固定条件和纯化过程。
在核易位测定中，细胞被刺激诱导NF-βB激活，然后固定。抗p65抗体被添加到固定细胞。或者，p65 亚单位本身可以使用荧光肽（如绿色荧光绿色 （GFP））标记。在这两种情况下，免疫荧光将允许对p65的定位进行成像，以确定细胞分布。通过测量细胞和核局部蛋白的比例，研究者可以确定NF-βB的相对激活状态。这种方法的缺点是免疫荧光相对耗时，需要昂贵的抗体，并且需要相对更高的技术专长16。
报告基因是研究感兴趣的基因的调控和表达模式的常用工具。通常，报告基因是由一个感兴趣的基因的启动子序列构建的，该基因与一种易于检测的蛋白质的基因编码有关。具有酶活性、荧光或发光特性的蛋白质通常被选择用于测定和量化。因此，读出（例如，发光、荧光）作为检测基因表达的信号。然后，这些报告器构造可以引入到不同的细胞类型中，如上皮细胞或巨噬细胞。
该协议中描述的是使用克隆的HeLa细胞系（HeLa 57A），该细胞系通过含有免疫球蛋白β链促进器区域17的三个βB共识的荧光酶报告器进行稳稳的转染。荧光素酶的表达取决于NF-βB的激活，在细胞刺激后发生。使用荧光素酶测定试剂盒中提供的细胞乳液酶缓冲液，可轻松对刺激细胞进行分莱。然后，细胞莱沙的一部分与含有荧光素的荧光素酶测定缓冲液混合。路西法林是荧光素酶的基质，在荧光素酶存在的情况下生成光是必需的。将测定缓冲液与解液结合后，溶液将在称为发光的工艺中发出光。以流明表示的发光量与流沙中存在的荧光素酶量成正比，并用作 NF-βB 活化的量度。与未刺激的标准相比，对流明读数进行解释，以考虑基线 NF-+B 活性，信号本身稳定几分钟，以便进行可靠的测量。此外，HeLa 57A 细胞系通过 NF-βB 独立 β-乳糖酶报告器进行稳稳的转染。β-乳糖酶报告器是构成性的表达，β-乳糖酶活性可以测量，以控制细胞的存活性或细胞数17的变化。然后，可调整荧光酶值，以调整到β-乳糖酶值，并报告为在未刺激的控制细胞上增加的褶皱。
由于NF-βB是负责NF-βB依赖性靶基因表达增加的转录因子，因此控制NF-βB依赖性增加基因表达的后续实验是定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）。RT-qPCR是一种高度敏感的方法，通过这种方法，基因表达的变化可以量化在几个数量级。通过苯酚氯仿提取为RNA采集刺激和控制细胞。相分离后，RNA作为水层的主要成分被提取。然后，RNA被沉淀和洗涤，产生纯颗粒。然后，通过DNase处理，再重组并进一步清除污染物DNA。然后反向转录纯RNA，以创建互补DNA（cDNA）。然后，可以通过定量PCR技术分析该cDNA，其中对特定mRNA序列的丰度进行量化以确定基因表达。此技术不能阐明翻译控制、翻译后修饰、蛋白质丰度或蛋白质活性。然而，许多基因，尤其是那些参与亲炎过程的基因，通过NF-βB进行调控，其mRNA丰度表示其表达。
这里提出的方法采用一种快速、简单的方法，通过细胞莱沙的发光检测可以检测NF-βB的活化。NF-βB靶基因表达的RT-qPCR可用于量化特定基因的表达，以及验证NF-βB活化的功能活性。这种系统的主要优点是其简单性和速度，允许对调节 NF-+B 激活的一系列条件进行高吞吐量筛选。该协议适用于表达NF-βB：：乳酸酶报告器的其他细胞系，并已在稳稳转染RAW264.7细胞18中得到证明。处理样品所需的时间（从细胞溶解到产生发光信号）非常少，大约需要一个小时。NF-+B 的测量只需要基本的实验室设备，如不透明板、能够测量发光的板式读取器以及简单的数据分析软件（如电子表格程序）。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive film</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>60941-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11665092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse treatment kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa 57A cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP26181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>promega luciferase assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1501</td>
			<td>Cell lysis buffer &#38; luciferin substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time GAPDH forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CCAGGAAATGAGCTTGAC 
			AAAGT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time GAPDH reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5-&#39;CCCACTCCTCCACCT 
			TTGAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-23 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5-&#39;GAGCCTTCTCTGCTCCC 
			TGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-23 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-6 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GTAGCCGCCCCACACAGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-6 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CATGTCTCCTTTCTCAGG 
			GCTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4308228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL1344</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL1344 &#916;sipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL1344 &#916;sopE &#916;sipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4309155</td>
			<td>2x mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-reagent</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR 118</td>
			<td>guanidine thiocyanate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP248450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate for PCR</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89218-294</td>
			<td>384-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nf-&#954;b-dependent luciferase activation and quantification of gene expression in salmonella infected tissue culture cells

二分体转录因子NF-βB调节许多细胞反应途径，包括通过诱导各种细胞因子和化学因子的表达来引起炎症通路。NF-βB是组织表达的，通过B细胞抑制剂α（I+B+）中的卡帕光多肽基因增强剂的抑制蛋白核因子在细胞溶质中固存。NF-βB的激活需要I+B+的降解，然后它暴露NF-βB上的核定位信号，并促进其向核的贩运。一旦进入细胞核，NF-βB与NF-βB靶基因的介子基因（如白细胞介素6（IL-6）和IL-23）的介动区域结合，以促进其表达。
NF-βB 的激活独立于转录或翻译而发生。因此，NF-βB的激活状态必须通过在核中具体量化NF-βB，或者通过量化NF-βB靶基因的表达来测量。在此协议中，使用NF-βB：：乳酸酶报告器构造的细胞通过体外组织培养技术进行NF-βB激活。这些细胞感染了沙门氏菌，以激活NF-βB，它流到细胞核，并结合在荧光素酶的启动区βB位点，诱导其表达。细胞用荧光素酶测定系统进行分化和分析。细胞产生的荧光素酶量与发光信号的强度相关，发光信号由板读取器检测到。此过程生成的发光信号提供了一种快速且高度敏感的方法，用于评估 NF-+B 在一系列条件下的激活。该协议还利用定量逆转录PCR（RT-qPCR）来检测指示基因表达的相对mRNA水平。

此处描述的测定侧重于使用NF-βB依赖性荧光酶报告器激活转录因子NF-βB，该重感酶可稳稳地转染成HeLa细胞系。激活的NF-βB转位到细胞核，其中结合目标基因的βB结合位点，包括亲炎细胞因子IL6和IL23。图1描述了NF-+B激活的概述。本研究使用革兰氏阴性细菌肠杆菌血清分型，作为NF-βB的活化剂和随后表达IL6（?...

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NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

在这里，我们提出了一个协议，通过测量细胞裂解中的发光，快速、轻松地测量活性B细胞（NF-B）激活细胞系中激活的核因子kappa-光链增强剂：：快星酶报告器结构。此外，基因表达通过从感染沙门氏菌的细胞中分离的RT-qPCR确定。

在沙门氏菌感染组织培养细胞中，NF-βB依赖性路西酶的激活和基因表达的定量

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...

此协议可用于确定表示 NF-kappa-B 荧光酶处理机的单元格中 NF-kappa-B 激活的变化。此技术的主要优点是，它允许高吞吐量筛选导致 NF-kappa-B 激活变化的因素或条件。NF-kappa-B 是各种细胞过程的转录因子。NF-kappa-B 的一个众所周知的功能是诱导各种细胞因子和化疗素的表达来诱导炎症反应。我们的实验室对由病原体沙门氏菌引起的NF-kappa-B的诱导特别感兴趣。在这里，我们使用与NF-kappa-B荧光酶记者质粒稳定地转染的 HeLa 细胞系。其他细菌，甚至病毒或化合物，可用于此细胞系研究NF-kappa-B的激活。如果您可以在该细胞系中引入这样的 NF-kappa-B 荧光酶研究者质粒，也可以使用其他细胞系。首次这样做的人可能有问题，正确使用无菌技术，这是细胞培养和细菌工作所需的。细胞刺激前一天，去除 HeLa 57A 细胞的生长培养培养，这些培养培养已发展到约 75% 的汇合。用一毫升0.05%的三辛EDTA清洗细胞。用另一毫升的尝试性EDTA代替，将烧瓶转移到37摄氏度的培养箱中5分钟。细胞从烧瓶分离后，将它们悬浮在生长介质的10毫升中。将10微升的细胞悬浮液与10微升的 Trypan 蓝色，移液器上下混合，并将10微升转移到细胞计数器幻灯片。使用细胞计数器对悬浮细胞进行计数，并使用生长介质将细胞稀释至最终浓度为 2.5 倍，每毫升 50 毫升的 5 个细胞。将 250 微升的电池悬浮液转移到 48 井板的每个井中。定期封顶并转动锥形管，以确保均匀的细胞悬浮液。轻轻敲击一侧的板，确保电池在井中均匀分布。在5%的二氧化碳培养箱中将电池转移到37摄氏度，让细胞在一夜之间附着并生长。将沙门氏菌冷冻库存到 LB 阿加盘上， 以产生单一菌落。将板转移到37摄氏度的培养箱，并允许过夜生长。第二天，在无菌细菌培养管中加入三毫升LB，并在介质中加入适当的抗生素。使用无菌接种循环，从条纹细菌培养物中选取单个菌落，然后触摸环到 LB 介质。接种后盖住管子并丢弃回路。将管子放在37摄氏度和180 RPM的摇晃培养箱中，然后让细菌在一夜之间生长。早晨，从孵化器中检索隔夜细菌培养物。通过添加三毫升新鲜 LB 和抗生素，为亚栽培准备管子。将30微升的隔夜细菌培养剂转移到新鲜准备的介质中。将管子放在37摄氏度的摇晃培养箱中，放置3小时。经过三个小时的孵育，将一毫升无菌LB汤转移到塑料盒中，作为空白。将 900 微升 LB 转移到用于样品分析的其他铜质中。将 100 微升细菌亚培养剂转移到含有 900 微升 LB 的培养盒中，并上下移液器多次混合。对每次细菌悬浮重复。打开分光光度计，测量波长为 600 纳米的细菌培养物的光学密度。将空白放在分光光度计中。记下方向。合上盖子，按分光光度计上的空白按钮，获得背景吸收。将空白的 cuvette 替换为同一方向的样品 cuvette，然后按读。记录这些样本的 OD600 值。将值乘以 10 以考虑稀释系数。将悬浮液稀释 1 至 10 的 cuvette 并测量吸光度，该值应提供大约 0.1 的值，该值大致对应于每毫升 9 CFU 的 1 倍 10。在一个新的管子中，将稀释的亚栽培的适当体积添加到新鲜LB中，以达到每毫升8CFU的悬浮量1倍至8CFU，用作孵化剂。通过将 50 微升细菌悬浮液转移到含有 450 微升无菌 PBS 的管中，准备对阴离子的连续稀释，直到每毫升进行约 100 CFU 的最终稀释。将两个最低稀释液（每毫升100和1000 CFU）的100微升转移到两个LB加糖板，并用细胞扩散器将悬浮液与单菌落扩散开来。这些板转移到37摄氏度的孵化器，并在一夜之间孵育。第二天，计算菌落并计算初始孵化菌的细菌浓度，以确定实际的孵化浓度。在同一天，根据每个井的感染条件标记板盖，每个条件以三次三合一方式完成。将10微升的注射剂加入适当的油井，在未受感染的控制井中加入10微升的无菌LB。要同步感染时间，请将板放在桌面离心机中，并在 500 次 G 下旋转五分钟，确保板得到平衡。然后，将受感染的细胞转移到37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中一小时。将含有一个等同细胞培养培养素的15毫升圆锥管放在37摄氏度的水浴中，供下一步使用。感染一小时后，从水浴中取出含有细胞培养的15毫升圆锥管，然后用70%乙醇擦拭外部。将组织培养板从培养箱转移到生物安全柜。使用无菌提示从油井中吸气介质，并更换 250 微升新鲜、温暖的细胞培养介质。将板返回 5%二氧化碳培养箱，温度为 37 摄氏度，再多加热 4 小时。之后，从二氧化碳培养箱中取出板，从井中吸出介质。对于荧光素酶分析，向井中加入100微升1X细胞解液缓冲液。将板转移到负80摄氏度的冰柜中，孵育至少30分钟，以确保高效的细胞解解。然后，将含有冷冻细胞的板在长凳上解冻，并根据制造商的建议准备荧光素酶基板试剂。允许荧光素酶基板试剂与室温均衡。接下来，打开板读卡器并打开相应的读卡器程序。将机器设置为测量发光。将每个细胞的 10 微升来化样到不透明的 96 井板的井中。使用多通道移液器，将 50 微升的荧光素酶测定试剂添加到不透明板的每个井中。轻轻敲击侧面的板，以混合孔，并确保底部表面覆盖着液体。将板放在板读卡器中并启动读数。将发光值复制到电子表格程序中并绘制结果。该协议侧重于使用 NF-kappa-B 依赖性荧光酶报告器激活转录因子 NF-kappa-B，该报告器被稳定地转染到一行 HeLa 细胞中。此图显示了感染沙门氏菌病菌株的 HeLA 57A 细胞中 NF-kappa-B 依赖性荧光酶活化和 IL6 基因表达的代表性实验。感染野生型SL1344菌株诱导在RLU和IL6表达强烈的荧光素酶信号，这是减少在细胞感染的siPB sopE2三重突变体，并减少到控制水平与sipA sopB sopE2 sopE四重突变体。进行串行稀释和电镀时，请密切注意。这将确保您的菌株具有一致的疫苗。在确定导致NF-kappa-B活化和mRNA表达下游变化的因素后，西方印迹技术可用于识别蛋白质表达的变化。该协议使我们的实验室不仅能够评估沙门氏菌引起的NF-kappa-B活化，还能够评估与NF-kappa-B活化有关的其他化合物和蛋白质。沙门氏菌是一种人类病原体。处理这些细菌时，使用适当的 PPE。

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Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

区分功能基因表达的作用，通过骨髓移植免疫和非免疫细胞在小鼠结肠炎

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

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Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

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使用李斯特菌单细胞基因评估受感染小鼠培养和心脏殖民化中心脏细胞的细菌入侵

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

胞浆的定量与液泡<em&gt;沙门氏菌</em&gt;在原发性巨噬细胞差透

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

巨噬细胞中含有吞噬的鼠伤寒沙门氏菌的分离

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

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猕猴免疫缺陷病毒感染 CD4+ T 细胞单细胞定量的 mRNA 和表面蛋白的表达

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

实时定量聚合酶链反应检测感染细胞培养中的登革热病毒 rna

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

体外转录 rna 基荧光素酶记者法研究类病毒感染细胞的翻译规律

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

KSHV感染细胞中特定基因产物的定量原位荧光杂交（FISH）和免疫荧光（IF）

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

用于病毒感染活成像和定量的路西酶-荧光报告流感病毒

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

中性粒细胞中活性氧物种的实时定量 感染脑膜性 大肠杆菌

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...