Name: nf-&#954;b-dependent luciferase activation and quantification of gene expression in salmonella infected tissue culture cells
Uploaded: 2020-01-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NF-ÎºB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells at JoVE.com

Keestra-Gounder 실험실에 있는 연구는 수상 번호 R21AI122092의 밑에 NIH의 NIAID및 상 번호 1-18-JDF-035의 밑에 미국 당뇨병 협회에서 교부금에 의해 지원됩니다.

1. 세포 통과 및 파종
<ol><li>5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 5% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 덜베코의 변형된 독수리 매체(DMEM)의 10 mL를 함유하는 75 cm2 플라스크에서 HeLa 57A 세포를 유지합니다.</li>
	<li>흡기 세포 배양 배지및 0.05% 트립신-EDTA 용액의 1 mL로 세척한다. 트립신을 흡인하고 추가로 1 mL로 교체하십시오. 플라스크를 37°C 인큐베이터에 4-5분 동안 놓고 세포가 플?...

<ol>
	<li>Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+signaling+in+inflammation.">NF-kappaB signaling in inflammation.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).</li><li>Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB:+a+stress-regulated+switch+for+cell+survival.">NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).</li><li>Lawrence, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+factor+NF-kappaB+pathway+in+inflammation.">The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).</li><li>Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+ICP27-dependent+activation+of+NF-kappaB.">Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB.</a> Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).</li><li>Zaragoza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+protease+cleavage+of+inhibitor+of+kappaBalpha+triggers+host+cell+apoptosis.">Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+effector+binding+to+ribosomal+protein+s3+subverts+NF-kappaB+function.">Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function.</a> PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).</li><li>Kravchenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gene+expression+via+disruption+of+NF-kappaB+signaling+by+a+bacterial+small+molecule.">Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule.</a> Science. 321 (5886), 259-263 (2008).</li><li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+to+NF-kappaB+by+Toll-like+receptors.">Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).</li><li>Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Targeting+by+Enteropathogenic+Bacteria+T3SS+Effectors.">Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors.</a> Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).</li><li>Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+NF-kappaB+is+activated:+the+role+of+the+IkappaB+kinase+(IKK)+complex.">How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex.</a> Oncogene. , (1999).</li><li>Berti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+RT-PCR+analysis+of+inflammatory+gene+expression+associated+with+ischemia-reperfusion+brain+injury.">Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Holden, N. S., Tacon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+problems+of+the+electrophoretic+mobility+shift+assay.">Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).</li><li>Renard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).</li><li>Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+NF-kappaB+Activation+in+TLR-Activated+Macrophages.">Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).</li><li>Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+retention+of+IkappaBalpha+protects+it+from+signal-induced+degradation+and+inhibits+nuclear+factor+kappaB+transcriptional+activation.">Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).</li><li>Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+endoplasmic+reticulum+stress+response+impacts+the+NOD1+signaling+pathway.">Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aromatic-Dependent+Salmonella-Typhimurium+Are+Non-Virulent+and+Effective+as+Live+Vaccines.">Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines.</a> Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).</li><li>Keestra, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+small+Rho+GTPases+is+a+pathogen-induced+process+detected+by+NOD1.">Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1.</a> Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).</li><li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+characterization+of+NF-kappaB+binding+uncovers+non-canonical+motifs+and+advances+the+interpretation+of+genetic+functional+traits.">Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits.</a> Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+mutants+as+sensors+of+proteome+stress.">Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress.</a> Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).</li><li>Cogswell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+regulates+IL-1+beta+transcription+through+a+consensus+NF-kappa+B+binding+site+and+a+nonconsensus+CRE-like+site.">NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site.</a> Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).</li><li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Heterodimeric+Cysteine+Protease+Is+Required+for+Interleukin-1-Beta+Processing+in+Monocytes.">A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li></ol>

설명된 프로토콜의 주요 기여는 세포에서 NF-θB 활성화를 검출하는 빠르고 쉬운 방법을 제공하며, 이는 NF-θB 활성화에 영향을 미치는 다중 자극 조건 또는 약물의 높은 처리량 분석을 허용한다는 것입니다. 여기서, 우리는 살모넬라-감염된HeLa 세포에서 NF-θB 활성화를 위한 프로토콜을 기술한다. 이 세포는 NF-θB 활성화에 세균성 감염의 충격을 공부하기 위하여 뿐만 아니라 그밖 병원체를 가...

단백질의 핵 인자-θB (NF-θB) 가족은 다양한 생물학적 경로에서 유전자 발현을 조절하는 중요한 전사 활성제이다. NF-θB의 활성화는 표적 유전자의 전사를 유도하며, 그 중 많은 것이 면역 및 염증 반응, 세포 증식, 스트레스 반응 및 암진행에중요하다1,2. NF-θB는 병원체 클리어런스를 위한 초기 염증 결과를 중재하는 데 필수적인 역할을 합니다. NF-θB 활성화에 의해 매개되는 많은 생물학적 과정을 감안할 때, 신호의 중단은 건강과 질병에 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. NF-θB 신호에 있는 기능 돌연변이의 손실은 몇몇 면역 결핍 표현형에서 연관되는 반면, 기능 돌연변이의 이득은 B 세포 림프종 및 유방암을 포함하여 암의 몇몇 모형과 연관됩니다3. 부가적으로, 많은 병원체는독성 인자4,5,6,7의발현을 통해 NF-θ의 활성화 상태를 직접 조절하는 것으로 나타났다.
NF-θB의 활성화는 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs)으로 알려진 리포폴리사카라이드(LPS), 플래그엘린 및 펩티도글리칸과 같은 세균성 제품을 포함한 많은 가변 자극의 결과인 것으로 알려져 있다. 이러한 PAMPs는 NF-θB의 활성화및 NF-θB 의존성 염증 유전자의 어레이의 후속 발현을 유도하는 톨-유사 수용체(TL) 및 Nod-like 수용체(LRS)와 같은 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 검출된다8. PAMPs에 의한 PRR 활성화 이외에, 세균 효과 단백질과 같은 다른 세균성 제품은, NF-θB의 활성화를 유도할 수 있다. 흥미롭게도, 박테리아는 또한 NF-θ 통로를 능동적으로 감쇠시키고 그들의 병원성을 향상시키는 이펙터 단백질을 발현하며, 면역의 필수적인 중재자로서 NF-θB의 중요성을강조한다 9.
NF-θB 이dim을 형성하는 5개의 다른 하위 단위가 있습니다; p50, p52, RelA (p65), RelB 및 cRel. 두 가지 주요 NF-θB 헤테로디머는 p50:RelA 및 p52:RelB 이형제입니다. 활성화된 NF-θB 디이머는 다양한 표적 유전자의 프로모터 및 인핸서 영역에서 σB 부위로 알려진 DNA 부위에 결합한다. 정상적인 동압 조건하에서, NF-θB는 IθB 단백질로 알려진 억제제 단백질의 가족과 상호 작용하여 비활성 상태를 유지합니다. 자극시, IθB는 IθB 키나아제(IKK)에 의해 인산화되어 유비퀴틴화를 표적으로 하고, 이어서 분해할 수 있게 한다. IθB의 분해는 핵 국소화 신호를 밝혀 NF-θB를 활성화한다. NF-θB는 그 후 핵으로 옮겨, 여기서 표적 유전자의 프로모터 영역에서 σB 부위를 결합시키고 전사10을촉진한다. 따라서, NF-θB의 활성화는 NF-θB 표적 유전자의 mRNA 발현을 상향 조절하며, 이러한 변화는 RT-qPCR11과같은 RNA 정량화 분석제를 통해 측정될 수 있다.
몇몇 방법은 존재하고 일반적으로 전기 영동 이동성 이동 분석법 (EMSA), 핵 전좌 및 유전자 리포터 분석법을 포함하여 NF-θB 활성화의 측정을 위해 이용됩니다. EMSA는 핵산이 있는 단백질 복합체를 검출하는 데 사용됩니다. 자극된 세포는 전좌된 NF-θ를 포함하는 핵 단백질을 분리하기 위해 분획되고, 이어서 NF-θB 결합 도메인을 포함하는 방사성 표지된 뉴클레오티드로 배양된다. 견본은 젤에 실행되고 32P 표지한 핵산의 자기 방사선 촬영에 의해 심상됩니다. NF-θB가 단백질 분획에 존재하는 경우, 뉴클레오티드를 결합시킬 것이며, 이는 겔을 통해 느리게 이동하고 이산 밴드로서 존재할 것이다. 활성 NF-θB(예를 들어, 비자극된 대조군 세포)가 결여된 세포의 핵 분획은 뉴클레오티드가 겔의 끝으로 더 빨리 이동함에 따라 아무밴드도 생성되지 않을 것이다. 이 방법의 주요 단점은 이진 의미에서 크게 정량적이며 NF-θB 결합 용량에서 의미 있는 차이를 적절히 포착하지 못한다는 것입니다. 부가적으로, 이 방법은 NF-θB 표적 유전자12,13에대해 기능적으로 중요한 염색질 구조를 고려하지 않는다.
이전 방법과 유사하게, 다중 웰 플레이트가 NF-θB 결합 서열을 함유하는 뉴클레오티드로 코팅되는 "비시프트" 분석법이 있다. 단백질의 핵 분획으로 세포의 처리 후, NF-θB는 웰에 결합된 뉴클레오티드에 결합할 것이다. 항-NF-θB 항체가 추가되고, 이는 결합된 NF-θB와 상호 작용하고 NF-θB의 양에 비례하는 색색 신호를 생성하며, 이는 NF-θB 활성화의 정도를 나타낸다. 이 방법은 방사성 표지된 핵산을 필요로 하지 않으며 정량적이라는 점에서 EMSA에 비해 유리하다. 그러나, 이 방법의 주의사항은 NF-θB 표적 유전자14의염색질 상태를 다시 분화하지 않는다는 것이다.
NF-θB 활성화가 검출될 수 있는 또 다른 방법은 크로마틴 면역침전(ChIP)에 의해, DNA 및 상호 작용 단백질이 포름알데히드와 가교되고 특정 항-NF-θB 항체와 면역침전된다. 특정 뉴클레오티드 단편은 PCR 증폭 또는 직접 높은 처리량 시퀀싱을 통해 정제되고 식별됩니다. 이 방법으로부터 생성된 결과는 표적 유전자와 NF-θB 결합 활성의 반정량적 결과를 제공한다. 그러나, 결과는 각단계(15)에서고정 조건 및 정제 공정에 크게 의존한다.
핵 전좌 검역 실험에서, 세포는 NF-θB 활성화를 유도하기 위하여 자극되고 그 후 고정됩니다. 항-p65 항체는 고정 된 세포에 추가됩니다. 대안적으로, p65 소단위 자체는 녹색 형광녹색(GFP)과 같은 형광 펩티드로 태그될 수 있다. 두 경우 모두, 면역형광은 p65의 국소화영상을 허용하여 세포 분포를 결정할 것이다. 세포질 및 핵 국소화 단백질의 비율을 측정함으로써, 조사자들은 NF-θB의 상대적 활성화 상태를 결정할 수 있다. 이 방법의 단점은 면역형광이 비교적 시간이 많이 걸리고, 고가의 항체가 필요하며, 상대적으로 더 큰 기술적 전문지식이 필요하다는 것이다16.
리포터 유전자는 관심 있는 유전자의 조절 및 발현 패턴을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 도구입니다. 전형적으로, 리포터 유전자는 쉽게 검출 가능한 단백질을 코딩하는 유전자에 융합된 관심 있는 유전자의 프로모터 서열로부터 구성된다. 효소 활동, 형광 또는 발광 특성을 가진 단백질은 일반적으로 분석 및 정량화될 수 있는 그들의 능력을 위해 선택됩니다. 따라서, 판독(예를 들어, 발광, 형광)은 유전자 발현의 검출을 위한 신호로서 역할을 한다. 이러한 리포터 구조는 상피 세포 또는 대식세포와 같은 상체 세포 유형으로 도입될 수 있다.
본 프로토콜에 기재된 클론된 HeLa 세포주(HeLa 57A)는 면역글로불린 σ-chain 프로모터영역(17)의3개의 θB 컨센서스의 3개의 사본을 포함하는 루시퍼라제 리포터로 안정적으로 형질이 나는 것을 사용한다. 루시퍼라아제의 발현은 세포 자극 다음에 발생하는 NF-θB의 활성화에 의존한다. 자극된 세포는 루시퍼라아제 분석 키트에 제공된 세포 용해 완충제를 사용하여 용이하게 용해된다. 세포 포액의 부분은 루시페린을 포함하는 루시페라아제 분석 버퍼와 혼합됩니다. 루시펠린은 루시퍼라아제의 기질이며 루시퍼라아제의 존재 시 빛의 생성에 필요합니다. 분석 버퍼와 용해액을 결합한 후, 용액은 발광으로 알려진 공정에서 빛을 방출합니다. 루멘으로 생성되는 빛의 양은 용해액에 존재하는 루시퍼라아제의 양에 비례하며 NF-θB 활성화의 척도로서 작용한다. 루멘 판독값은 기준선 NF-θB 활성을 고려하기 위해 비자극표준과 비교하여 해석되며, 신호 자체는 신뢰할 수 있는 측정을 위해 몇 분 동안 안정되어 있다. 또한, HeLa 57A 세포주들은 NF-ΘB-독립적인 β-갈락토시다아제 리포터로 안정적으로 형질감염된다. β-갈락토시다아제 리포터는 구성적으로 발현되고, β-갈락토시다아제 활성은 세포 생존성 또는 세포 수의 변이를 조절하기 위해 측정될 수 있다17. 루시퍼라제 값은 β-갈락토시다아제 값으로 조정될 수 있고 자극되지 않은 대조군 세포에 비해 배 증가가 보고될 수 있다.
NF-θB는 NF-θB-의존성 표적 유전자의 증가된 발현을 담당하는 전사 인자이기 때문에, NF-θB-의존성 증가유전자 발현을 조절하기 위한 후속 실험은 정량적 역전사 중합체 연쇄 반응( RT-qPCR)을 참조하십시오. RT-qPCR은 유전자 발현의 변화가 여러 계급의 크기에 걸쳐 정량화될 수 있는 매우 민감한 방법이다. 자극 및 제어 세포는 페놀 클로로포름 추출을 통해 RNA를 위해 수확됩니다. 상 분리 후, RNA는 수성 층의 주요 성분으로서 추출된다. RNA는 순수한 펠릿을 생성하기 위해 침전되고 세척됩니다. 이 펠릿은 DNase 치료를 통해 오염 DNA를 재구성하고 추가로 청소합니다. 순수한 RNA는 그 때 상보적인 DNA (cDNA)를 만들기 위하여 역으로 전사됩니다. 이 cDNA는 그 때 특정 mRNA 순서의 풍부가 유전자 발현을 결정하기 위하여 정량화되는 양적 PCR 기술을 통해 분석될 수 있습니다. 이 기술은 번역 제어, 사후 번역 수정, 단백질 풍부 또는 단백질 활성을 설명하지 않습니다. 그러나, 많은 유전자, 특히 프로 염증 과정에 관여하는 유전자는 NF-θB를 통해 조절되고 그들의 mRNA 풍부는 그들의 발현을 나타냅니다.
여기서 제안된 방법은 세포 용해물의 발광 검술을 통해 NF-θB 활성화가 검출될 수 있는 빠르고 간단한 방법을 이용한다. NF-θB 표적 유전자 발현의 RT-qPCR은 특정 유전자의 발현을 정량화하고, NF-θB 활성화의 기능적 활성을 검증하는데 사용될 수 있다. 이러한 시스템의 주요 장점은 NF-θB 활성화를 조절하는 다양한 조건의 높은 처리량 스크리닝을 허용하는 단순성과 속도입니다. 이 프로토콜은 NF-θB::luciferase 리포터를 발현하는 다른 세포주에 적합하며, 안정적으로 형질감염된 RAW264.7세포(18)에서입증되었다. 세포 용해에서 발광 신호 생성에 이르기까지 샘플을 처리하는 데 필요한 시간은 최소화되고 약 1 시간의 기간이 소요됩니다. NF-θB의 측정에는 불투명 플레이트, 발광을 측정할 수 있는 플레이트 리더, 스프레드시트 프로그램과 같은 간단한 데이터 분석 소프트웨어와 같은 기본적인 실험실 장비만 필요합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive film</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>60941-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11665092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse treatment kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa 57A cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP26181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>promega luciferase assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1501</td>
			<td>Cell lysis buffer &#38; luciferin substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time GAPDH forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CCAGGAAATGAGCTTGAC 
			AAAGT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time GAPDH reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5-&#39;CCCACTCCTCCACCT 
			TTGAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-23 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5-&#39;GAGCCTTCTCTGCTCCC 
			TGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-23 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-6 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GTAGCCGCCCCACACAGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-6 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CATGTCTCCTTTCTCAGG 
			GCTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4308228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL1344</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL1344 &#916;sipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL1344 &#916;sopE &#916;sipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4309155</td>
			<td>2x mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-reagent</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR 118</td>
			<td>guanidine thiocyanate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP248450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate for PCR</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89218-294</td>
			<td>384-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nf-&#954;b-dependent luciferase activation and quantification of gene expression in salmonella infected tissue culture cells

dimeric 전사 인자 NF-θB는 다양한 사이토카인 및 케모카인의 발현을 유도함으로써 염증 경로를 포함한 많은 세포 반응 경로를 조절한다. NF-θB는 B 세포 억제제, 알파(IθBα)에서 카파광 폴리펩티드 유전자 인핸서의 억제 단백질 핵 인자에 의해 세포졸에서 세포적으로 발현되고 격리된다. NF-θB의 활성화는 IθBα의 분해를 요구하며, 이는 NF-θB에 핵 국소화 신호를 노출시키고 핵으로의 인신매매를 촉진한다. 일단 핵에서, NF-θB는 그들의 발현을 촉진하기 위해 인터류키핀 6(IL-6) 및 IL-23과 같은 NF-θB 표적 유전자의 운동 영역에 결합한다.
NF-θB의 활성화는 전사 또는 번역과 독립적으로 발생합니다. 따라서, NF-θB의 활성화 상태는 핵에서 특별히 NF-θθ를 정량화하거나, NF-θB 표적 유전자의 발현을 정량화함으로써 측정되어야 한다. 이 프로토콜에서, NF-θB로 안정적으로 형질감염된 세포는 시험관내 조직 배양 기술을 사용하여 NF-θB 활성화를 위해 분석된다. 이 세포는 NF-θB를 활성화하기 위하여 살모넬라 티피무륨에 감염되고, 이는 핵으로 트래픽및 루시퍼라아제라아제의 프로모터 지구에 있는 θB 사이트에 결합하여, 그것의 발현을 유도합니다. 세포는 루시퍼라아제 분석 시스템으로 분석하고 분석한다. 세포에 의해 생성된 루시퍼라아제의 양은 플레이트 리더에 의해 검출되는 발광 신호의 강도와 상관관계가 있습니다. 이 절차에 의해 생성된 발광 신호는 다양한 조건 하에서 NF-θB 활성화를 평가하는 빠르고 매우 민감한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 유전자 발현을 나타내는 상대적인 mRNA 수준을 검출하기 위해 정량적 역전사 PCR(RT-qPCR)을 이용한다.

여기서 설명된 분석은 HeLa 세포의 라인으로 안정적으로 형질이 되는 NF-θB 의존성 루시퍼라제 리포터를 사용하여 전사 인자 NF-θB의 활성화에 초점을 맞추고 있다. 활성화된 NF-θB는 단백질 염증성 사이토카인 IL6 및 IL23을포함하는 표적 유전자의 σB 결합 부위를 결합하는 핵으로 전이한다. NF-θB 활성화에 대한 일반적인 개요는 그림 1에설?...

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NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

여기서, 우리는 NF-θB를 발현하는 세포주에서 활성화된 B 세포(NF-θB)의 핵 인자 카파-라이트 체인 인핸서를 빠르고 쉽게 측정하는 프로토콜을 제시한다:루시퍼라아제 리포터 구성, 세포 용해물 내 발광의 측정을 통해. 추가적으로, 유전자 발현은 살모넬라 티피무리움에 감염된 세포로부터 분리된 RT-qPCR을 통해 결정된다.

살모넬라 감염 조직 배양 세포에서 유전자 발현의 NF-θB 의존성 루시퍼라아제 활성화 및 정량화

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...

이 프로토콜은 NF-kappa-B 루시파 리포터를 표현하는 세포에서 NF-kappa-B 활성화의 변화를 결정하는 데 유용합니다. 이 기술의 주요 장점은 NF-kappa-B 활성화의 변화로 이어지는 요인 이나 조건의 높은 처리량 화면을 허용한다는 것입니다. NF-kappa-B는 다양한 세포 공정을 위한 전사 인자이다.NF-kappa-B의 잘 알려진 기능은 다양한 사이토카인과 케모킨의 발현을 유도하여 염증 반응의 유도에 있다. 우리의 실험실은 병원체 살모넬라 타이피무륨에 의해 유도된 NF-kappa-B의 유도에 특히 관심이 있습니다. 여기서는 NF-kappa-B 루시프라아제 리포터 플라스미드와 안정적으로 전염되는 HeLa 세포주입니다.다른 박테리아, 또는 심지어 바이러스 또는 화학 화합물, NF-kappa-B의 활성화를 연구 하기 위해이 세포주에서 사용할 수 있습니다. 다른 세포주도 이러한 NF-kappa-B 루시파라제 기자 플라스미드를 그 세포주에서 소개할 수 있는 경우에도 사용할 수 있다. 처음으로 이 일을 하는 누군가는 세포 배양 및 세균 작용에 필요한 멸균 기술을 제대로 활용하는 문제가 있을 수 있습니다.세포 자극 의 하루 전에, 약 75%의 합류로 성장한 HeLa 57A 세포의 성장 매체를 제거합니다. 0.05%의 트립신 EDTA의 1 밀리리터로 셀을 세척합니다. 또 다른 트립신 EDTA로 교체하고 플라스크를 섭씨 37도인큐베이터로 5분간 옮키십시오.세포가 플라스크에서 분리 된 후, 성장 미디어의 10 밀리리터에서 그들을 중단. 셀 서스펜션 10마이크로리터와 Trypan 블루 10마이크로리터, 파이펫 위아래로 섞고 10마이크로리터를 셀 카운터 슬라이드로 옮겨 넣습니다. 세포 카운터를 이용하여 현탁액에서 세포를 카운트하고, 50 밀리리터 원모튜브에서 밀리리터당 5개의 세포에 2.5배 10배의 최종 농도로 세포를 희석시키기 위해 성장 매체를 사용한다.세포 현탁액의 250 마이크로리터를 48웰 플레이트의 각 웰에 옮기. 주기적으로 상질세포 현탁액을 보장하기 위해 원물 튜브를 덮습니다. 측면에 있는 접시를 부드럽게 탭하여 세포가 우물에서 균일하게 분포되도록 합니다.5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도로 옮기고 세포가 하룻밤 사이에 부착하고 성장할 수 있도록 합니다. 단일 식민지를 생산하기 위해 LB 한천 판에 살모넬라의 냉동 주식을 줄입니다. 플레이트를 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터로 옮기고 하룻밤 동안 성장할 수 있습니다.다음 날, 세균 배양 튜브를 멸균하기 위해 LB의 3 밀리리터를 추가하고 미디어에 적절한 항생제를 추가합니다. 멸균 접종 루프를 사용하여 줄무늬 세균 배양에서 단일 식민지를 선택하고 LB 미디어에 루프를 터치합니다. 튜브를 접종한 후 튜브를 캡핑하고 루프를 폐기합니다.37섭씨와 180RPM으로 설정된 흔들리는 인큐베이터에 튜브를 놓은 다음 박테리아가 하룻밤 사이에 자랄 수 있도록 합니다. 아침에, 인큐베이터에서 하룻밤 세균 문화를 검색합니다. 신선한 LB와 항생제의 3 밀리리터를 추가하여 서브컬쳐튜브를 준비합니다.하룻밤 사이에 세균 배양30마이크로리터를 갓 제조된 배지로 옮기. 3시간 동안 섭씨 37도에 설정된 흔들리는 인큐베이터에 튜브를 놓습니다. 3 시간 인큐베이션 후, 멸균 LB 국물의 1 밀리리터를 플라스틱 큐벳으로 옮기면 빈 칸역할을 합니다.샘플 분석에 사용할 다른 큐벳으로 LB의 900 마이크로리터를 전송합니다. 세균 서브컬쳐 100마이크로리터를 LB 900 마이크로리터를 함유한 큐벳으로 옮기고, 파이펫을 여러 번 위아래로 섞어 넣습니다. 각 세균 현탁액에 대해 이것을 반복하십시오.분광계를 켜서 600 나노미터의 파장에서 세균 배양의 광학 밀도를 측정합니다. 빈 칸을 분광광계에 놓습니다. 방향을 기록합니다.뚜껑을 닫고 분광계의 빈 버튼을 눌러 배경 흡광도를 얻습니다. 빈 큐벳을 동일한 방향으로 샘플 큐벳으로 교체하고 읽기를 누릅니다. 이러한 샘플의 OD600 값을 기록합니다.값을 10으로 곱하여 희석 계수를 고려합니다. 액수에서 1대 10까지 서스펜션을 희석하고 흡수도를 측정하며, 이는 밀리리터당 9CFU에 10회 10에 해당하는 약 0.1의 값을 제공해야 한다. 새로운 튜브에서, 희석 된 서브 컬쳐의 적절한 볼륨을 신선한 LB에 추가하여 밀리리터 당 8 CFU에 1회 10 의 현탁액을 달성하여 접종으로 사용된다.밀리리터당 약 100CFU의 최종 희석이 이루어질 때까지 멸균 PBS의 450 마이크로리터를 포함하는 튜브로 세균 현탁액 50 마이크로리터를 전송하여 접종의 직렬 희석을 준비합니다. 밀리리터당 100및 1000 CFU의 100마이크로리터를 밀리리터당 100및 1000 CFU를 2개의 LB 한천 판으로 옮기고, 단일 콜로니를 얻기 위해 세포 스프레더로 서스펜션을 확산시한다. 이 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮기고 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, 식민지를 계산하고 실제 접종 농도를 결정하기 위해 초기 접종의 세균 농도를 계산합니다. 같은 날에, 각 우물에 대해 사용될 감염 조건에 따라 플레이트의 뚜껑을 라벨, 각 조건은 triplicate에서 수행되는. 접종소 10마이크로리터를 적절한 우물에 추가하고 감염되지 않은 제어 우물에 멸균 LB 10 마이크로리터를 추가합니다.감염 시간을 동기화하려면 플레이트를 탁상 원심분리기에 놓고 5분 동안 500회 G로 회전하여 플레이트의 균형을 맞췄습니다. 그런 다음 감염된 세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 5%의 이산화탄소 인큐베이터로 이송합니다. 다음 단계에서 사용하기 위해 세포 배양 매체의 알리쿼트가 들어있는 15 밀리리터 원컬 튜브를 섭씨 37도의 수조에 놓습니다.감염 후 1시간 후, 수조에서 세포 배양 배지를 함유한 15밀리리터 원뿔관을 제거하고 70%에탄올로 외부를 닦아냅니다. 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 조직 배양 판을 옮길 수 있습니다. 멸균 팁을 사용하여 우물에서 미디어를 흡인하고 신선하고 따뜻한 세포 배양 매체의 250 마이크로 리터로 대체하십시오.플레이트를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터로 4시간 더 되돌려 보냅니다. 그 후, 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 우물에서 미디어를 흡인. 루시파아제 분석을 위해 1X 셀 리시스 버퍼의 100마이크로리터를 우물에 추가합니다.플레이트를 음의 섭씨 80도로 옮기고 효율적인 세포 용액을 보장하기 위해 적어도 30분 동안 배양합니다. 그런 다음, 냉동 셀 리세이트가 들어 있는 플레이트를 벤치에 놓고 제조업체 권장 사항에 따라 루시파라기 기질 시약을 준비한다. 루시파라제 기질 시약이 실온에 평형화되도록 허용합니다.다음으로 플레이트 판독기를 켜고 해당 판독기 프로그램을 엽니다. 발광을 측정하도록 기계를 설정합니다. 불투명 한 96 웰 플레이트의 우물에 각 셀 용액의 10 마이크로 리터를 전송합니다.멀티채널 파이펫을 사용하여 불투명 플레이트의 각 웰에 루시파라래아세 분석 시약 50마이크로리터를 추가합니다. 측면에 있는 접시를 부드럽게 탭하여 우물을 섞고 바닥 표면이 액체로 덮여 있는지 확인합니다. 접시 를 접시 리더에 놓고 읽기를 시작합니다.발광 값을 스프레드시트 프로그램에 복사하고 결과를 플롯합니다. 이 프로토콜은 안정적으로 HeLa 세포의 선으로 전염되는 NF-kappa-B 의존 루시파 리포터를 사용하여 전사 인자 NF-kappa-B의 활성화에 초점을 맞추고 있습니다. 이 수치는 살모넬라 타이피무륨 균주에 감염된 HeLA 57A 세포에서 NF-kappa-B 의존루시파-B 의존루시파 활성화 및 IL6 유전자 발현의 대표적인 실험을 나타낸다.야생형 SL1344 균주를 통한 감염은 RLU 및 IL6 발현 모두에서 강력한 루시파래아제 신호를 유도하여 sipA sopB sopE2 삼중 돌연변이체에 감염된 세포에서 감소하고 sipA sopB sopE2 sopE2 sopE2 sopE 사중 돌연변이를 사용하여 대조 수준으로 감소하였다. 직렬 희석및 도금을 할 때주의를 기울이십시오. 이렇게 하면 균주 전체에 일관된 비수뇨가 있을 수 있습니다.MRNA 발현의 NF-kappa-B 활성화 및 다운스트림 변화에 기여하는 요인을 확인한 후, 서양 블롯 기술을 사용하여 단백질 발현의 변화를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜은 우리의 실험실이 살모넬라에 의해 유도된 NF-kappa-B 활성화를 평가하는 것을 허용했습니다 그러나 NF-kappa-B 활성화에 연루된 그밖 화합물 및 단백질. 살모넬라 티피무륨은 인간 병원체입니다.이러한 박테리아와 함께 작업 할 때 적절 한 PPE를 사용 하 고 있습니다.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Immunology and Infection

Unit 2

Cell Signaling Pathways

SCIENTISTS IN ACTION

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

연구

면역학 및 감염병학

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

리스테리아 단세포 유전자를 사용하여 감염된 마우스에 있는 문화와 심혼 식민지에 있는 심장 세포의 세균성 침략 평가

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

공포 성 대 세포질의 정량화<em&gt; 살모넬라</em&gt; 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 뎅 그 열 바이러스 RNA를 측정

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

수막 대장균에 감염된 호중구의 반응성 산소 종의 실시간 정량화

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...