Name: nf-&#954;b-dependent luciferase activation and quantification of gene expression in salmonella infected tissue culture cells
Uploaded: 2020-01-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NF-ÎºB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells at JoVE.com

La investigación en el laboratorio Keestra-Gounder está respaldada por subvenciones del NIAID del NIH bajo el número de premio R21AI122092 y de la Asociación Americana de la Diabetes bajo el Premio Número 1-18-JDF-035.

1. Passaging y Sembrado celular
<ol><li>Mantener las células HeLa 57A en un matraz de 75 cm2 que contenga 10 ml de medios Eagle 's modificados de Dulbecco (DMEM) complementados con un 5% de suero bovino fetal activado por calor (FBS) a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%.</li>
	<li>Aspirar los medios de cultivo celular y lavar con 1 ml de solución de trippsina-EDTA al 0,05%. Aspirar trippsina y reemplazar con 1 mL adicional. Colocar el matraz en una incubadora de 37oC durante 4-5 min para permi...

<ol>
	<li>Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+signaling+in+inflammation.">NF-kappaB signaling in inflammation.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).</li><li>Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB:+a+stress-regulated+switch+for+cell+survival.">NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).</li><li>Lawrence, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+factor+NF-kappaB+pathway+in+inflammation.">The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).</li><li>Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+ICP27-dependent+activation+of+NF-kappaB.">Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB.</a> Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).</li><li>Zaragoza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+protease+cleavage+of+inhibitor+of+kappaBalpha+triggers+host+cell+apoptosis.">Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+effector+binding+to+ribosomal+protein+s3+subverts+NF-kappaB+function.">Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function.</a> PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).</li><li>Kravchenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gene+expression+via+disruption+of+NF-kappaB+signaling+by+a+bacterial+small+molecule.">Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule.</a> Science. 321 (5886), 259-263 (2008).</li><li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+to+NF-kappaB+by+Toll-like+receptors.">Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).</li><li>Pinaud, L., Sansonetti, P. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Holden, N. S., Tacon, C. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).</li><li>Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+NF-kappaB+Activation+in+TLR-Activated+Macrophages.">Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).</li><li>Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+small+Rho+GTPases+is+a+pathogen-induced+process+detected+by+NOD1.">Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1.</a> Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).</li><li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+characterization+of+NF-kappaB+binding+uncovers+non-canonical+motifs+and+advances+the+interpretation+of+genetic+functional+traits.">Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits.</a> Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+mutants+as+sensors+of+proteome+stress.">Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress.</a> Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).</li><li>Cogswell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+regulates+IL-1+beta+transcription+through+a+consensus+NF-kappa+B+binding+site+and+a+nonconsensus+CRE-like+site.">NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site.</a> Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).</li><li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Heterodimeric+Cysteine+Protease+Is+Required+for+Interleukin-1-Beta+Processing+in+Monocytes.">A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li></ol>

La contribución principal del protocolo descrito es que proporciona un método rápido y fácil para detectar la activación NF-B en las células, lo que permite un análisis de alto rendimiento de múltiples condiciones estimulantes o fármacos que afectan a la activación NF-B. Aquí, describimos un protocolo para la activación NF-B en las células HeLa infectadas por Salmonella. Estas células se pueden utilizar para la infección con otros patógenos, así como para estudiar el impacto de la infección bac...

La familia de proteínas del factor nuclear B (NF-B) son importantes activadores de transcripción que regulan la expresión génica en varias vías biológicas. La activación de NF-B induce la transcripción de genes diana, muchos de los cuales son importantes para las respuestas inmunitarias e inflamatorias, la proliferación celular, las respuestas al estrés y la progresión del cáncer1,2. Nf--B desempeña un papel integral en la mediación de los primeros resultados inflamatorios para el aclaramiento de patógenos. Dados los muchos procesos biológicos mediados por la activación nf-B, las interrupciones en su señalización pueden tener graves consecuencias para la salud y la enfermedad. La pérdida de mutaciones de la función en la señalización NF-B se asocia en varios fenotipos de deficiencia inmune, mientras que la ganancia de mutaciones de función se asocia con varios tipos de cáncer, incluyendo linfomas de células B y cánceres de mama3. Además, se ha demostrado que muchos patógenos modulan directamente el estado de activación de NF-B a través de la expresión de factores de virulencia4,5,6,7.
Se sabe que la activación de NF--B es una consecuencia de muchos estímulos variables, incluidos productos bacterianos como lipopolisacáridos (LPS), flagelina y peptidoglicanos conocidos como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). Estos MTP son detectados por receptores de reconocimiento de patrones (PRR) tales como los receptores similares a los peajes (TIR) y los receptores similares a Nod (NRM) que conducen a la activación de NF-B y la posterior expresión de una matriz de genes inflamatorios dependientes de NF-B8. Además de la activación de PRR por Los PamP, otros productos bacterianos, como las proteínas efectoras bacterianas, pueden inducir la activación de NF-B. Curiosamente, las bacterias también expresan proteínas efectoras que atenúan activamente la vía NF-B y mejoran su patogenicidad, subrayando la importancia de NF-B como mediador esencial de la inmunidad9.
Hay cinco subunidades diferentes que forman los dimers NF-B; p50, p52, RelA (p65), RelB y cRel. Los dos heterodímeros principales NF-B son los dimers p50:RelA y p52:RelB. Los dimers NF-B activados se unen a sitios de ADN, conocidos como sitios B, en las regiones promotoras y potenciadoras de varios genes diana. En condiciones homeostáticas normales, NF-B interactúa con una familia de proteínas inhibidoras conocidas como proteínas I-B para permanecer inactivas. Tras la estimulación, el I-B es fosforilado por la Kinasa (IKK, por sus cuales) es blanco de la ubiquitinación y, posteriormente, de la degradación. La degradación de I-B activa NF-B al revelar una señal de localización nuclear. A continuación, NF--B se traslada al núcleo, donde se une a los sitios B en la región promotora de los genes diana y promueve la transcripción10. Por lo tanto, la activación de NF--B regula la expresión de ARNm de los genes diana NF-B, y este cambio se puede medir a través de ensayos de cuantificación de ARN como RT-qPCR11.
Existen varios métodos que se utilizan comúnmente para la medición de la activación NF-B, incluyendo ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA), translocación nuclear y ensayos de reporteros genéticos. EMSA se utiliza para detectar complejos proteicos con ácidos nucleicos. Las células estimuladas se fraccionan para aislar las proteínas nucleares, incluyendo la NF-B transubicada, que luego se incuba con nucleótidos radiomarcados que contienen el dominio de unión NF-B. Las muestras se ejecutan en un gel e imágenes por autoradiografía de ácido nucleico etiquetado 32P. Si la NF-B está presente en la fracción proteica, unirá los nucleótidos, que migrarán más lentamente a través del gel y se presentarán como bandas discretas. Las fracciones nucleares que carecen de NF-B activado (por ejemplo, células de control no estimuladas) no producirán bandas a medida que los nucleótidos migran más rápido hasta el final del gel. Un inconveniente importante de este método es que es en gran medida cuantitativo en el sentido binario (es decir, encendido o desactivado) y no captura adecuadamente diferencias significativas en la capacidad de enlace NF-B. Además, este método no tiene en cuenta las estructuras de cromatina que son funcionalmente importantes para los genes diana NF-B12,13.
Al igual que el método anterior, hay un ensayo "sin desplazamiento" en el que las placas multipozo están recubiertas con nucleótidos que contienen la secuencia de unión NF-B. Después del tratamiento de las células con fracciones nucleares de proteína, NF-B se unirá a los nucleótidos unidos al pozo. A continuación, se añaden anticuerpos anti-NF-B, que interactuarán con el NF-B enlazado y producirán una señal colorimétrica proporcional a la cantidad de NF-B, indicando el grado de activación NF-B. Este método es ventajoso sobre la EMSA en el que no requiere ácidos nucleicos radiomarcados y es cuantitativo, en comparación. Sin embargo, una advertencia de este método es que de nuevo no diferencia entre los estados de cromatina de los genes diana NF-B14.
Otro método por el cual se puede detectar la activación NF-B es mediante la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), mediante el cual el ADN y las proteínas que interactúan se reticulan con el formaldehído y se inmunoprecipitan con anticuerpos específicos anti-NF-B. Los fragmentos de nucleótidos específicos se purifican e identifican a través de la amplificación de PCR o la secuenciación directa de alto rendimiento. Los resultados generados a partir de este método proporcionan resultados semicuantitativos de la actividad de unión NF-B con genes diana. Sin embargo, los resultados dependen en gran medida de las condiciones de fijación y los procesos de purificación en cada paso15.
En los ensayos de translocación nuclear, las células se estimulan para inducir la activación NF-B y luego se fijan. Los anticuerpos anti-p65 se añaden a las células fijas. Alternativamente, la subunidad p65 en sí se puede etiquetar con un péptido fluorescente como verde fluorescente verde (GFP). En cualquier caso, la inmunofluorescencia permitirá la localización de la localización de p65 para determinar la distribución celular. Mediante la medición de la proporción de proteína termosólica y nuclear localizada, los investigadores pueden determinar el estado de activación relativa de NF-B. Un inconveniente de este método es que la inmunofluorescencia es comparativamente lenta, requiere anticuerpos caros, y necesita una experiencia técnica relativamente mayor16.
Los genes reporteros son herramientas comúnmente utilizadas para estudiar los patrones regulatorios y de expresión de un gen de interés. Por lo general, los genes reporteros se construyen a partir de la secuencia promotora de un gen de interés fusionado con un gen que codifica para obtener una proteína fácilmente detectable. Las proteínas con actividades enzimáticas, fluorescencia o propiedades luminiscencias se eligen comúnmente por su capacidad de ensayo y cuantificación. Por lo tanto, la lectura (por ejemplo, luminiscencia, fluorescencia) sirve como una señal para la detección de la expresión génica. Estas construcciones de reportero se pueden introducir en diferentes tipos de células, como células epiteliales o macrófagos.
En el protocolo se describe el uso de una línea celular Clonada HeLa (HeLa 57A) que está establemente transfectó con un reportero de luciferasa que contiene tres copias del consenso b de la región promotora de la cadena de inmunoglobulina17. La expresión de la luciferasa depende de la activación de NF-B, que se produce después de la estimulación celular. Las células estimuladas se lysed fácilmente utilizando tampón de lisis celular proporcionado en el kit de ensayo luciferasa. Una porción del lisado celular se mezcla con el tampones de ensayo de luciferasa que contiene luciferina. Luciferin a is the substrate of luciferase and is required for the generation of light in the presence of luciferase. Después de combinar el tampón de ensayo con el isla, la solución emitirá luz en un proceso conocido como luminiscencia. La cantidad de luz producida, dada en lúmenes, es proporcional a la cantidad de luciferasa presente en el lisado y sirve como una medida de activación NF-B. Las lecturas de lumen se interpretan en comparación con un estándar no estimulado para tener en cuenta la actividad de referencia NF-B y la señal en sí es estable durante varios minutos para permitir una medición confiable. Además, la línea celular HeLa 57A está establemente transtrinfectada con un reportero de nf--B-independiente de la galactosidasa. El reportero de galactosidasa se expresa constitutivamente, y la actividad de la galactosidasa se puede medir para controlar la viabilidad celular o la variación en los números de celda17. Los valores de luciferasa se pueden ajustar a los valores de la galactosidasa y notificarse como aumento del pliegue sobre las células de control no estimuladas.
Dado que NF--B es un factor de transcripción responsable del aumento de la expresión de los genes diana dependientes de NF-B, un experimento de seguimiento para controlar el aumento de la expresión génica dependiente de NF-B es la reacción en cadena cuantitativa de la transcripción inversa de la polimerasa ( RT-qPCR). RT-qPCR es un método altamente sensible por el cual los cambios en la expresión génica se pueden cuantificar en varios órdenes de magnitud. Las células estimuladas y de control se cosechan para el ARN a través de la extracción de fenol-cloroformo. Después de la separación de fase, el ARN se extrae como el componente principal de la capa acuosa. El ARN se precipita y se lava para producir un pellet puro. Este pellet se reconstituye y limpia aún más el ADN contaminante a través del tratamiento con DNase. El ARN puro se transcribe a la inversa para crear ADN complementario (ADNc). Este ADNc puede ser analizado a través de técnicas cuantitativas de PCR, donde la abundancia de una secuencia de ARNm específica se cuantifica para determinar la expresión génica. Esta técnica no dilucida el control traslacional, la modificación post traslacional, la abundancia de proteínas o la actividad proteica. Sin embargo, muchos genes, particularmente los involucrados en procesos pro-inflamatorios, están regulados a través de NF-B y su abundancia de ARNm es indicativa de su expresión.
El método propuesto aquí utiliza una forma rápida y sencilla por la cual la activación NF-B se puede detectar a través de ensayos de luminiscencia de lisato celular. RT-qPCR de la expresión génica diana NF-B se puede utilizar para cuantificar la expresión de genes particulares, así como para validar la actividad funcional de la activación NF-B. Las principales ventajas de un sistema de este tipo son su simplicidad y velocidad, lo que permite el cribado de alto rendimiento de una gama de condiciones que modulan la activación NF-B. Este protocolo es adecuado para otras líneas celulares que expresan un reportero NF-B::luciferase, y se ha demostrado en células RAW264.7 transotrófilos estables18. La cantidad de tiempo necesario para manejar las muestras, desde la lisis celular hasta la generación de una señal de luminiscencia, es mínima y ocupa aproximadamente una hora. La medición de NF-B requiere sólo equipos básicos de laboratorio como placas opacas, un lector de placas capaz de medir la luminiscencia y un software de análisis de datos simple, como un programa de hoja de cálculo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive film</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>60941-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11665092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse treatment kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa 57A cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP26181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>promega luciferase assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1501</td>
			<td>Cell lysis buffer &#38; luciferin substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time GAPDH forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CCAGGAAATGAGCTTGAC 
			AAAGT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time GAPDH reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5-&#39;CCCACTCCTCCACCT 
			TTGAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-23 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5-&#39;GAGCCTTCTCTGCTCCC 
			TGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-23 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-6 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GTAGCCGCCCCACACAGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-6 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CATGTCTCCTTTCTCAGG 
			GCTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4308228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL1344</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL1344 &#916;sipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL1344 &#916;sopE &#916;sipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4309155</td>
			<td>2x mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-reagent</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR 118</td>
			<td>guanidine thiocyanate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP248450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate for PCR</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89218-294</td>
			<td>384-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nf-&#954;b-dependent luciferase activation and quantification of gene expression in salmonella infected tissue culture cells

El factor de transcripción dimerica NF--B regula muchas vías de respuesta celular, incluyendo vías inflamatorias induciendo la expresión de varias citoquinas y quimioquinas. NF--B se expresa constitutivamente y es secuestrado en el citosol por el factor nuclear de proteína inhibitoria del potenciador del gen de polipéptido ligero kappa en el inhibidor de las células B, alfa (I-B). La activación de NF--B requiere la degradación de I-B, que luego expone una señal de localización nuclear en NF-B y promueve su tráfico al núcleo. Una vez en el núcleo, NF-B se une a la región promotora de los genes diana NF-B, como la interleucina 6 (IL-6) y la IL-23, para promover su expresión.
La activación de NF-B se produce independientemente de la transcripción o la traducción. Por lo tanto, el estado de activación de NF-B debe medirse mediante la cuantificación de NF-B específicamente en el núcleo, o mediante la cuantificación de la expresión de los genes diana NF-B. En este protocolo, las células transfectó de forma estable con una construcción de reportero NF-B::luciferase para la activación de NF-B utilizando técnicas de cultivo de tejido in vitro. Estas células están infectadas con Salmonella Typhimurium para activar NF-B, que se trafica con el núcleo y se une a los sitios B en la región promotora de la luciferasa, induciendo su expresión. Las células se lysed y analizan con el sistema de ensayo luciferase. La cantidad de luciferasa producida por las células se correlaciona con la intensidad de la señal de luminiscencia, que es detectada por un lector de placas. La señal de luminiscencia generada por este procedimiento proporciona un método rápido y altamente sensible para evaluar la activación NF-B bajo una serie de condiciones. Este protocolo también utiliza PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR) para detectar niveles relativos de ARNm que son indicativos de expresión génica.

El ensayo descrito aquí se centra en la activación del factor de transcripción NF-B utilizando un reportero de luciferasa dependiente de NF-B que está establemente transctado en una línea de células de HeLa. La NF-B activada se traslada al núcleo donde se une a los sitios de unión B de los genes diana, incluidas las citoquinas proinflamatorias IL6 e IL23. En la Figura 1se muestra una descripción general de la activación NF-B. La ba...

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NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

Aquí, presentamos un protocolo para medir rápida y fácilmente el factor nuclear kappa-light-chain-enhancer de la activación de células B activadas (NF--B) en líneas celulares que expresan las construcciones de reporteronf-B::luciferase, a través de mediciones de luminiscencia en el lisado celular. Además, la expresión génica se determina a través de RT-qPCR aislado de células infectadas con Salmonella Typhimurium.

Activación y cuantificación de la expresión génica dependiente de NF--B en células de cultivo de tejido infectado por Salmonella

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...

Este protocolo es útil para determinar los cambios en la activación de NF-kappa-B en las células que expresan un reportero de luciferasa NF-kappa-B. La principal ventaja de esta técnica es que permite una pantalla de alto rendimiento de factores o condiciones que conducen a cambios en la activación NF-kappa-B. NF-kappa-B es un factor de transcripción para una amplia variedad de procesos celulares.Una función bien conocida de NF-kappa-B es en la inducción de respuestas inflamatorias mediante la inducción de la expresión de varias citoquinas y quimioquinas. Nuestro laboratorio está particularmente interesado en la inducción de NF-kappa-B inducida por el patógeno Salmonella typhimurium. Aquí, usamos la línea celular HeLa que se transfecta establemente con un plásmido reportero de NF-kappa-B luciferase.Otras bacterias, o incluso virus o compuestos químicos, se pueden utilizar en esta línea celular para estudiar la activación de NF-kappa-B. También se pueden utilizar otras líneas celulares si puede introducir un plásmido reportero de NF-kappa-B luciferase en esa línea celular. Alguien que hace esto por primera vez puede tener problemas correctamente utilizando la técnica estéril que se requiere para el cultivo celular y el trabajo bacteriano.Un día antes de la estimulación celular, eliminar los medios de crecimiento de las células de HeLa 57A que se han cultivado a aproximadamente 75%confluencia. Lavar las células con un mililitro de 0,05% de trippsina EDTA. Reemplace con otro mililitro de trippsina EDTA y transfiera el matraz a una incubadora de 37 grados Celsius durante cinco minutos.Después de que las células se hayan separado del matraz, suspendalas en 10 mililitros de medios de crecimiento. Combine 10 microlitros de suspensión celular con 10 microlitros de color azul Trypan, pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar y transfiera 10 microlitros a un portaobjetos de celda. Recuento de células en suspensión utilizando un contador celular, y utilice medios de crecimiento para diluir las células a una concentración final de 2,5 veces 10 a las cinco células por mililitro en un tubo cónico de 50 mililitros.Transfiera 250 microlitros de la suspensión celular a cada pozo de una placa de 48 pozos. Tapar y girar periódicamente el tubo cónico para asegurar una suspensión celular homogénea. Toque suavemente la placa en el lateral para asegurarse de que las células se distribuyen uniformemente en los pozos.Transfiera la placa a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono del 5% y permita que las células se adhieran y crezcan durante la noche. Raya las existencias congeladas de Salmonella sobre los platos de agar LB para producir colonias individuales. Transfiera las placas a una incubadora de 37 grados centígrados y permita el crecimiento durante la noche.Al día siguiente, añadir tres mililitros de LB a tubos de cultivo bacterianos estériles, y añadir antibióticos apropiados a los medios. Usando un bucle de inoculación estéril, elija una sola colonia de los cultivos bacterianos rayados y toque el lazo a los medios LB. Tapa los tubos después de inocular y deseche el lazo.Coloque los tubos en una incubadora de temblores en 37 grados Celsius y 180 RPM, luego permita que las bacterias crezcan durante la noche. Por la mañana, recuperar cultivos bacterianos durante la noche de la incubadora. Preparar tubos para la subcultura mediante la adición de tres mililitros de LB fresco y antibióticos.Transfiera 30 microlitros del cultivo bacteriano nocturno a los medios recién preparados. Coloque los tubos en una incubadora de temblores a 37 grados centígrados durante tres horas. Después de las tres horas de incubación, transfiera un mililitro de caldo LB estéril a una cubeta de plástico para servir como blanco.Transfiera 900 microlitros de LB a las otras cubetas que se utilizarán para el análisis de la muestra. Transfiera 100 microlitros de subcultura bacteriana a una cubeta que contenga 900 microlitros de LB, y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar. Repita esto para cada suspensión bacteriana.Encienda el espectrofotómetro para medir la densidad óptica de los cultivos bacterianos a una longitud de onda de 600 nanómetros. Coloque el espacio en blanco en el espectrofotómetro. Tome nota de la orientación.Cierre la tapa y pulse el botón en blanco del espectrofotómetro para obtener la absorción de fondo. Sustituya la cubeta en blanco por una cubeta de muestra en la misma orientación y pulse leer. Registre los valores OD600 de estos ejemplos.Multiplique el valor por 10 para tener en cuenta el factor de dilución. Diluir la suspensión de uno a 10 en una cubeta y medir la absorbancia, lo que debe dar un valor de aproximadamente 0,1 que corresponde aproximadamente a uno por 10 a la nueve UFC por mililitro. En un tubo nuevo, añadir un volumen adecuado de la subcultura diluida a LB fresco para lograr una suspensión de uno por 10 a las ocho UFC por mililitro que se utilizará como inóculo.Preparar diluciones en serie del inóculo transfiriendo 50 microlitros de suspensión bacteriana a un tubo que contiene 450 microlitros de PBS estéril hasta que se realice una dilución final de aproximadamente 100 UFC por mililitro. Transfiera 100 microlitros de las dos diluciones más bajas, 100 y 1000 UFC por mililitro, a dos placas de agar LB, y esparza la suspensión con un esparcidor celular para obtener colonias individuales. Transfiera estas placas a una incubadora de 37 grados Celsius e incubar durante la noche.Al día siguiente, contar las colonias y calcular la concentración bacteriana del inóculo inicial para determinar la concentración real de inóculo. El mismo día, etiquetar la tapa de la placa de acuerdo con las condiciones de infección que se utilizarán para cada pozo, con cada condición se realiza en triplicado. Agregue 10 microlitros del inóculo a los pozos apropiados, y agregue 10 microlitros de LB estériles a los pozos de control no infectados.Para sincronizar la hora de la infección, coloque la placa en una centrífuga de mesa y gire a 500 veces G durante cinco minutos, asegurándose de que la placa esté contrarrestada. Luego, transfiera las células infectadas a una incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados durante una hora. Coloque un tubo cónico de 15 mililitros que contenga una alícuota de medios de cultivo celular en un baño de agua de 37 grados Celsius para su uso en el siguiente paso.Una hora después del momento de la infección, retire el tubo cónico de 15 mililitros que contiene medios de cultivo celular del baño de agua y limpie el exterior con 70% de etanol. Transfiera las placas de cultivo de tejido de la incubadora a un gabinete de bioseguridad. Utilice puntas estériles para aspirar medios de los pozos y reemplazarlos con 250 microlitros de medios de cultivo celular frescos y cálidos.Devuelva las placas a la incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados durante cuatro horas adicionales. Después de eso, retire las placas de la incubadora de dióxido de carbono y aspire los medios de los pozos. Para el análisis de la lucifera, agregue 100 microlitros de tampón de lisis de 1X celular a los pozos.Transfiera la placa a un congelador negativo de 80 grados Celsius e incubar durante al menos 30 minutos para garantizar una lelisis celular eficiente. A continuación, coloque la placa que contiene el lisolato de celda congelada en un banco para descongelar, y prepare los reactivos de sustrato de luciferasa de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Permita que los reactivos de sustrato de luciferasa se equilibren a temperatura ambiente.A continuación, encienda el lector de placas y abra el programa de lectura correspondiente. Ajuste la máquina para medir la luminiscencia. Transfiera 10 microlitros de cada celda de lito a un pozo de una placa opaca de 96 pozos.Con una pipeta multicanal, añada 50 microlitros del reactivo de ensayo de luciferasa a cada pozo de la placa opaca. Toque suavemente la placa en el lado para mezclar los pozos, y asegúrese de que la superficie inferior esté cubierta de líquido. Coloque la placa en un lector de placas e inicie la lectura.Copie los valores de luminiscencia en un programa de hoja de cálculo y trace los resultados. Este protocolo se centra en la activación del factor de transcripción NF-kappa-B utilizando un reportero luciferasa dependiente de NF-kappa-B que se transfecta establemente en una línea de células HeLa. Esta figura muestra un experimento representativo de activación de luciferasa dependiente de NF-kappa-B y expresión génica IL6 en células HeLA 57A infectadas con las cepas de Salmonella typhimurium.La infección con la cepa wild type SL1344 indujo una fuerte señal de luciferasa tanto en la expresión RLU como en la EXPRESión IL6, que disminuyó en las células infectadas con el mutante triple sipA sopB sopE2 y se redujo a niveles de control con el mutante cuádruple sopE sopE2 de sipA sopB. Preste mucha atención al hacer sus diluciones en serie y chapado. Esto asegurará que usted tenga un inóculo consistente en todas sus cepas.Después de identificar los factores que contribuyen a la activación de NF-kappa-B y los cambios posteriores en la expresión de ARNm, la técnica de manchas occidentales se puede utilizar para identificar cambios en la expresión de proteínas. Este protocolo ha permitido a nuestro laboratorio no sólo evaluar la activación NF-kappa-B inducida por Salmonella, sino también otros compuestos y proteínas implicados en la activación de NF-kappa-B. Salmonella typhimurium es un patógeno humano.Emplear EPP adecuado cuando se trabaja con estas bacterias.

Research

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Immunology and Infection

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Cell Signaling Pathways

SCIENTISTS IN ACTION

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigación

Inmunología e Infección

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Sola célula cuantificación del mRNA y la expresión de la proteína de superficie de CD4 infectados por el Virus de la inmunodeficiencia de los simios+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Medición de ARN del Virus del Dengue en el sobrenadante de cultivo de las células infectadas por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo en tiempo real

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Ensayo in vitro transcrito luciferase Reporter basado en ARN para estudiar el Reglamento de traducción en las células infectadas por el poxvirus

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Fluorescencia cuantitativa en hibridación situ (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos genéticos específicos en células infectadas por KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Un virus de la gripe Reportero fluorescente de Luciferase para imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Cuantificación en tiempo real de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos infectados con escherichia coli meningítica

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...