Name: perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology
Uploaded: 2020-08-06T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology at JoVE.com

מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום תחת מספר הפרס UL1TR003096 (MDE), מלגת הלב, הריאות והמכון הלאומי למחלות ריאה 5T32HL134640 (MLD).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת אלבמה בברמינגהם.
1. פרוטוקול ניסיוני
<ol><li>הקרב את העכבר באמצעות שיטת IACUC מאושרת. כאן, השתמשנו נקע צוואר הרחם של עכבר הרדמה עם 5% isoflurane. השתמש בעכבר מתאים למחקר; כאן, אנו משתמשים בעכבר...

<ol>
	<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li><li>Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+murine+lung+preparation+for+detailed+structural+evaluation+via+micro-computed+tomography.">Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).</li><li>Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+fixation+for+the+preservation+of+air+spaces.">Lung fixation for the preservation of air spaces.</a> Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).</li><li>Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+dehydration+fixes+elastin+and+preserves+lung+air-space+dimensions.">Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions.</a> Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).</li><li>Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema.">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li><li>Renne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+of+optimal+method+for+formalin+fixation+of+rodent+lungs+in+routine+toxicology+studies.">Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies.</a> Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).</li><li>Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instillation+and+Fixation+Methods+Useful+in+Mouse+Lung+Cancer+Research.">Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.+A+comparison+of+eleven+laboratory+species.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species.</a> American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).</li><li>Edmonds, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-31+initiates+lung+tumorigenesis+and+promotes+mutant+KRAS-driven+lung+cancer.">MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wogonin+suppresses+melanoma+cell+B16-F10+invasion+and+migration+by+inhibiting+Ras-medicated+pathways.">Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways.</a> PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).</li></ol>

ההליך המתואר לעיל עבור זלוף, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר הוא אידיאלי עבור הכנה מהירה ויעילה של ריאות העכבר עבור היסטולוגיה גידול ריאות וניתוח פתולוגיה. ההליך אינו דורש כל ציוד מיוחד והוא יכול להתבצע בתוך פחות מ 6 דקות לכל עכבר. ההליך אינו דורש נפח קבוע לאינפלציה או לחץ נוזלים מתמיד. מכיו?...

קיימים מגוון דגמי עכברים של אונקוגנזה ריאה וגרורות סרטן לריאה, החל מ- GEMMs מורכבים ועד דגמים הנגרמים על ידי מסרטן ועד מודלים סינגניים ושנאת זרים, שבהם מוזרקים תאים סרטניים באמצעות אינטרקרדיאק, תוך-עורית, וריד הזנב או שיטות אחרות לביסוס גידולים בריאה. כל המודלים האלה חולקים את הצורך המשותף להערכה היסטולוגית של היסטולוגיה של ריאות ופתולוגיה. לכן, יש צורך בשיטה חזקה אך מהירה לבצע necropsies של עכברים תוך זלוף הריאות כדי להסיר דם עודף, ניפוח ותיקון הריאות כדי לדמיין בבירור את ארכיטקטורת הריאות. מהירות היא מרכיב קריטי של הליך זה כפי שייתכן שיהיה צורך לאסוף את הריאות מעשרות עכברים בנקודת זמן אחת. ניתן לבצע הליך זה בפחות מ- 6 דקות לכל עכבר.
בעוד הליך זה הוא יותר ממספיק להערכת היסטולוגיה הגידול, זה לא מומלץ עבור אלה המעוניינים לבצע מדידות סטריאולוגיה או morphometric של הריאות. מדידות כאלה דורשות אינפלציית ריאות להיות סטנדרטית, כמו גם את החישוב של שטח הפנים המוחלט של הריאה, נפח מוחלט, וגודל מכתשי ומספר1. שיטה זו גם אינה אופטימלית עבור גישות הדמיה מסוימות. לדוגמה, הדמיה של הריאות באמצעות μCT לניתוח מורפומטרי אקס ויוו דורשת שהריאות יישארו מלאות באוויר2. כאשר שימור המרחבים והממדים האוויריים הם הדאגה העיקרית, מומלץ לתקן את הריאות על ידי טכניקות התייבשות זלוף3,4. אחד החששות הגדולים ביותר של מודל זה הוא הפוטנציאל לקרע של קירות מכתשים, להפחית את השימוש בו במחקרים של נפחת; עם זאת, ההליך המומלץ לקיבעון הריאות לחקר אמפיזמה עדיין דומה למדי, שכן מומלץ לתקן את הריאות או על ידי החדרה תוך-טרה-סחית של 10% פורמלין (בדומה לפרוטוקול המתואר כאן) תחת לחץ נוזלים מתמיד או על ידי קיבוע5.
היתרון של ההליך המתואר כאן הוא שזה לא דורש לחץ נוזלים מתמיד, במקום לנפח את הריאות עד שהם התרחבו באופן מלא, ובכך להקטין את הזמן הדרוש להליך. ההליך המתואר כאן דומה מאוד לשיטות המומלצות על ידי חימוש של האגודה לפתולוגיה טוקסיקולוגית, שם הוקמה ועדת משנה להמליץ על השיטות הטובות ביותר של קיבוע ריאות למחקרי רעלים. רוב המדענים בתוך ועדת משנה זו המליצו לתקן את הריאות על ידי החדרה תוך-סטריאלית עם מזרק, אם כי היו המלצות שונות בזמן שהריאה הושארה בקיבעון6. לכן, בעוד מגוון שיטות של אינפלציה ריאות קיבעון קיים, השיטה המתוארת בזאת מוצע להיות השיטה האופטימלית במהירות לנפח ולתקן את הריאות להערכה היסטולוגית גידול במורד הזרם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% buffered formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-245685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Decon</td>
			<td>2405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology

היכולת להעריך היסטולוגיה של ריאות היא קריטית לתחומי חקר סרטן ריאות וגרורות סרטן. חשוב באותה מידה לבצע necropsies במהירות וביעילות ממחקרים מבלי להקריב את איכות הרקמות שנרכשו. מטרת פרוטוקול זה היא להציג שיטה להחדיר במהירות, לנפח ולתקן ריאות עכבר לניתוח היסטולוגי במורד הזרם. שיטה זו אינה מתקן את אינפלציית הריאות; לכן, זה לא דורש כל נהלים מיוחדים או ציוד ובמקום זאת פשוט מחדיר קיבוע ישירות דרך קנה הנשימה בעקבות זלוף דרך הלב. זה מאפשר הערכה מספקת של גודל הגידול, היסטולוגיה, וניקוד. זה גם מאפשר איסוף של רקמה קפואה לפני קיבוע רקמת הריאה. שיטה זו מוגבלת בכך שהיא אינה מאפשרת כימות מורפומטרי מאוחר יותר של הריאה; עם זאת, זה יותר ממספיק לניתוח גידול ריאות ממודלים עכבר מהונדסים גנטית (GEMMs), מודלים סינגניים, כמו גם גידול קסנוגרפט ומחקרי גרורות.

הפרוטוקול לעיל מאפשר זלוף מהיר, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר. הנתונים המוצגים להלן מייצגים את החשיבות של כל שלב. איור 1 מתאר ריאות מוכתמות H&E שהודבקו ל-PBS ולריאות שבהן דילגו על שלב הזלוף או שהריאות לא הצליחו לחלחל כראוי. כפי שמוצג, עודף דם בריאות perfused גרוע יוצר פחות היסטולוג...

Watch this Scientific Journal Video about Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology at JoVE.com

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

מטרת שיטה זו היא להציג שיטה פשוטה ויעילה עבור זלוף, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר לבדיקת פתולוגיה גידול ריאות והערכת גרורות לריאה.

זלוף ואינפלציה של ריאת העכבר עבור היסטולוגיה גידול

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

Demonstrating the procedure will be Mackenzie Davenport, a graduate student from the Edmonds Laboratory. After euthanizing the mouse, use surgical scissors to make a 3.5 to five millimeter horizontal incision in the middle of the lower abdomen. Next, insert surgical scissors into the incision and cut vertically up the center midline to just below the neck of the mouse.Pull the skin back with fingers and inspect the axillary lymph nodes. Use surgical scissors to make a 3.5 millimeter lateral incision to open the abdominal cavity. Then cut in the interior direction up to the bottom of the thorax.Inspect the organs in the abdominal cavity such as the liver, spleen, and kidneys. With the flat of the surgical scissors move the liver to expose the diaphragm. Inspect the diaphragm for tumor growth or metastases, then gently snip the diaphragm on the operator's right side, allowing it to expand.Cut the diaphragm from right to left to expose the thoracic cavity and lungs, taking care not to cut the lungs. Cut up through the lateral extreme of the left rib cage to inspect the left lobe of the lungs. Gently move the right lobes of the lung out of the way.Then cut up the lateral extreme of the right rib cage and remove the rib cage. If fresh or frozen lung tissue is required, use hemostat forceps to clamp the bronchus of the left lobe and resect the left lung with surgical scissors prior to perfusion. Use the forceps to lift the tissue covering the trachea and cut away any excess tissue, then gently cut the thin tissue lining the trachea to expose the airway.Cut through the renal artery with surgical scissors. To perfuse the lungs, use a three milliliter syringe with a 22 gauge needle to inject PBS with 10 units per milliliter heparin into the right ventricle of the heart. Slowly profuse the lungs at approximately 300 microliters per second causing the lungs to turn white.For lung inflation, use a three milliliter syringe with a 22 gauge needle and hold it parallel to the trachea. Insert the needle into the trachea and inject 10%formalin with a flow rate no greater than 200 microliters per second until the lungs have fully inflated. Once the lungs are inflated, formalin will backflow out of the trachea.Hold the needle in place for a few more seconds and then withdraw. Use forceps to lift the heart, insert surgical scissors directly behind the lungs and cut the connective tissue to resect to the lungs. Then cut the to remove it from the lungs.Place the lungs in a cassette labeled with the mouse ID or study ID, then place the cassette in 10%buffered formalin for 24 to 48 hours. Lungs can be left in fixative for over a year if desired. When finished, transfer the cassette containing the lungs to 70%ethanol and proceed with histology.This protocol allows for quick perfusion, inflation, and fixation of mouse lungs. Tumor histology in lungs which have been perfused and inflated using this technique is demonstrated here. When the profusion step is skipped, or the lungs fail to perfuse correctly, excess blood in the lungs creates less than ideal histology and can make it challenging to fully observe lung architecture.Inflation is an important step in this protocol. It is more difficult to identify areas of hyperplasia in uninflated lungs due to the compression and close proximity of the alveoli. However, in overinflated lungs, many of the alveolar walls have been broken which could be mistaken for emphysema.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

ריאות הגידול תא גיוס Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

קולון-26 קרצינומה גידול נושאות עכבר כמודל לחקר סרטן תשישות

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

18F-FDG PET/CT הדמיה וחומר היסטולוגיה כמותית למדוד שינויים דינמיים במטבוליזם הגלוקוז במודלים של העכבר של סרטן ריאות

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

זיהוי של התקדמות הגידול ריאה בעכברים על ידי הדמיה אולטרסאונד

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...