Name: dissection and lipid droplet staining of oenocytes in drosophila larvae
Uploaded: 2019-12-28T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31671422, 31529004 y 31601112), el Proyecto 111 (D18010), el Proyecto Local de Equipos de Innovación e Investigación del Programa de Talentos del Río Guangdong Perl (2017BT01S155), y el Fundación De Ciencia Postdoctoral de China (2018M640767).

1. Colocación de huevos
<ol><li>Prepare los alimentos estándar de harina de maíz para la puesta de huevos. NOTA: Para la receta y el procedimiento de cocción de los alimentos estándar de harina de maíz utilizados aquí, ver los detalles publicados anteriormente15.</li>
	<li>Preparar la pasta de levadura fresca añadiendo 6 ml de agua destilada a 4 g de levadura seca activa en un tubo centrífugo de 50 ml. Usa una espátula para mezclar y hacer una pasta.</li>
	<li>Haga ...

<ol>
	<li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+in+Drosophila:+development+and+disease.">Lipid metabolism in Drosophila: development and disease.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).</li><li>Cheng, Y., Chen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+fly+research+in+China.">Fruit fly research in China.</a> Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).</li><li>Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. 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V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+finally+get+a+little+R-E-S-P-E-C-T.">Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li><li>Murphy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+roles+of+intracellular+lipid+droplets:+from+archaea+to+mammals.">The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals.</a> Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Fowler, S. D., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Nile+red,+a+fluorescent+hydrophobic+probe,+for+the+detection+of+neutral+lipid+deposits+in+tissue+sections:+comparison+with+oil+red+O.">Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).</li><li>Gocze, P. M., Freeman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+underlying+the+variability+of+lipid+droplet+fluorescence+in+MA-10+Leydig+tumor+cells.">Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells.</a> Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).</li><li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets.">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials (Basel). 11 (9), (2018).</li><li>BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html</a> (2019)</li><li>Milon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+estrogens+regulate+lipid+status+in+testicular+steroidogenic+Leydig+cell?.">Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?.</a> Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).</li><li>Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+E4+alters+astrocyte+fatty+acid+metabolism+and+lipid+droplet+formation.">Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li></ol>

Entre los descritos anteriormente, hay varios pasos críticos en este protocolo, con el período de tiempo de puesta de huevos siendo uno de estos. Como tejido movilizador de lípidos, el enocito es altamente sensible al estado nutricional6,8. Los períodos prolongados de tiempo de puesta de huevos pueden dar lugar a larvas cantosas y a una mayor competencia alimentaria, lo que conduce a resultados inexactos. El período de tiempo de puesta de huevos de 1 h utili...

Los lípidos son esenciales para la supervivencia celular. Además de su papel tradicional como componentes integrales de los sistemas de membrana celular, los lípidos también desempeñan funciones cruciales en el suministro de energía y la transducción de señalización a lo largo de los ciclos de vida de los animales individuales1. Por lo tanto, el metabolismo de los lípidos debe ajustarse a estrictas regulaciones para mantener la hemostasis fisiológica en las células. Se sabe que la desregulación del metabolismo lipídico resulta en varias enfermedades, como la diabetes y el hígado graso. A pesar de la gran importancia del metabolismo lipídico en la salud animal, los mecanismos subyacentes a la regulación del metabolismo lipídico siguen siendo en gran parte desconocidos.
Drosophila se ha utilizado ampliamente durante años desde que el profesor Thomas H. Morgan comenzó a utilizarlos en estudios relacionados con la genética y otras preguntas biológicas básicas2. En las últimas décadas, la evidencia emergente ha demostrado que la drosophila es un excelente organismo modelo en el estudio de muchas enfermedades asociadas al metabolismo lipídico, como la obesidad1,3. En particular, Drosophila comparte genes metabólicos altamente conservados con los seres humanos y poseen tejidos/órganos relevantes similares y tipos celulares para el metabolismo de los lípidos.
Por ejemplo, el cuerpo gordo de Drosophila,que es responsable del almacenamiento de triacilglicéridos, funciones análogas al tejido adiposo humano. Recientemente, se ha demostrado que un grupo de células especializadas similares a los hepatocitos (es decir, los enocitos), que se ha informado que son un análogo funcional al hígado humano, están implicados en el metabolismo de ácidos grasos e hidrocarburos en moscas de la fruta4,5. Al igual que en los hígados de mamíferos, los enocitos responden a la inanición activando la formación de gotas lipídicas tanto en Drosophilalarval como en adulta, lo que resulta en la acumulación de gotas lipídicas en los enocitos4,6,7,8. Anatómicamente, los enocitos están estrechamente unidos a la superficie interna basal de la epidermis lateral en grupos de aproximadamente seis células por hemisegmento abdominal, lo que hace que sea impracticable aislar los racimos de oenocitos de la epidermis. Por lo tanto, los enocitos deben estar unidos a la epidermis durante la disección y la tinción.
Los lípidos se almacenan en forma de gotas de lípidos, que son orgánulos con membranas de una sola capa en las células9. Las gotas de lípidos existen en casi todos los tipos de células en diferentes especies10. La dinámica de las gotas de lípidos, incluyendo su tamaño y número, cambia en respuesta a los factores estresantes ambientales. Esto se considera como un reflejo del estado metabólico en respuesta al estrés, como el envejecimiento y el hambre7,8. Por lo tanto, es de gran importancia desarrollar un método factible y confiable para determinar cualitativamente la dinámica de las gotas lipídicas en los enocitos durante el desarrollo y en condiciones estresantes. En particular, en la tercera larva instar, los enocitos contienen pocas o ninguna gotita de lípidos detectables en condiciones de alimentación, pero contienen numerosas gotas de lípidos grandes después de la privación nutricional4. Para verificar la eficacia de este método, se sugiere realizar la tinción de gotas de lípidos en los enocitos en condiciones de hambre.
Actualmente, varios colorantes lipofílicos están disponibles para las manchas de gotas lipídicas, tales como los colorantes no fluorescentes Sudán Negro y Aceite Rojo O y los colores fluorescentes Nilo Rojo y BODIPY 493/50311. Sudán Negro y Aceite Rojo O se utilizan comúnmente para ésteres de colesteryl tejido y triacilgroles y pueden ser fácilmente detectados por microscopía de luz. Sin embargo, la tinción de fondo relativamente alta y una resolución relativamente baja son dos factores limitantes para sus aplicaciones en el análisis cualitativo de la dinámica de las gotas lipídicas. Para superar las limitaciones de los colorantes no fluorescentes, Nile Red y BODIPY 493/503 se utilizan como sustitutos ideales para la tinción de gotas de lípidos. Se ha informado que el rojo del Nilo también puede detectar algún colesterol no esterificado, lo que hace que BODIPY 493/503 sea un tinte más específico para las gotas de lípidos celulares, hasta cierto punto12,13,14.
Sobre todo, para satisfacer la necesidad de un análisis rápido y sensible de las gotas lipídicas en los enocitos, este protocolo presenta un método factible y altamente reproducible de tinción específica de gotas de lípidos a base de fijación utilizando BODIPY 493/503 como tinte de mancha. En este informe, los olores se diseccionan, y BODIPY 493/503 se utiliza para la tinción de gotas lipídicas en los enocitos, en los que las gotas lipídicas se detectan mediante microscopía confocal. La facilidad y asequibilidad de este procedimiento lo hacen ideal para su modificación y uso posterior en otras aplicaciones, como la citometría de flujo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>150326</td>
			<td>6 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For fly food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Protect smaple from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Lipid droplet staining dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TSC SP5</td>
			<td>Confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn syrup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For fly food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For fly food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>10212424C</td>
			<td>20 &#215; 20 mm, 0.13-0.17 thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pin</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection plate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Diameter: 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Jiangnan</td>
			<td>SPX-380</td>
			<td>For fly culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy slide</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>VECTASHIELDAntifade Mounting Medium</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>PanEra</td>
			<td>AAPR419</td>
			<td>Seal the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instruments</td>
			<td>WH-986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Smartdata Medical</td>
			<td>SR81</td>
			<td>Vannas spring scissor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy flour</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For fly food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cornmeal food</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica S6E</td>
			<td>For tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipe paper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For fly food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yw</td>
			<td>Kept as lab stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Drosophila</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and lipid droplet staining of oenocytes in drosophila larvae

Los lípidos son esenciales para el desarrollo animal y la homeostasis fisiológica. La desregulación del metabolismo lipídico da lugar a diversos defectos del desarrollo y enfermedades, como la obesidad y el hígado graso. Por lo general, los lípidos se almacenan en gotas de lípidos, que son los orgánulos multifuncionales de almacenamiento de lípidos en las células. Las gotas de lípidos varían en tamaño y número en diferentes tejidos y en diferentes condiciones. Se ha informado que las gotas de lípidos están estrechamente controladas a través de la regulación de su biogénesis y degradación. En Drosophila melanogaster, el enocito es un tejido importante para el metabolismo de los lípidos y se ha identificado recientemente como un análogo del hígado humano con respecto a la movilización de lípidos en respuesta al estrés. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la regulación del metabolismo de las gotas lipídicas en los enocitos siguen siendo esquivas. Para resolver este problema, es de suma importancia desarrollar un método fiable y sensible para visualizar directamente los cambios dinámicos de gotas lipídicas en los enocitos durante el desarrollo y en condiciones estresantes. Aprovechando el BODIPY 493/503 lipofílico, un tinte fluorescente específico de gotas lipídicas, descrito aquí es un protocolo detallado para la disección y posterior tinción de gotas lipídicas en los enocitos de larvas de Drosophila en respuesta a la inanición. Esto permite el análisis cualitativo de la dinámica de gotas lipídicas bajo diversas condiciones por microscopía confocal. Además, este método rápido y altamente reproducible también se puede utilizar en pantallas genéticas para identificar nuevos factores genéticos que implican el metabolismo de las gotas lipídicas en los enocitos y otros tejidos.

La ejecución exitosa de este procedimiento debe dar lugar a gotas de lípidos claras manchadas que revelan el número y el tamaño de gotas de lípidos en los enocitos. La Figura 1A,A',A'' muestra que hay pocas gotas de lípidos detectables (puntos verdes) en los enocitos de las larvas de alimentación normal durante diferentes etapas del desarrollo. La Figura 1B,B',B'' muestra el aumento de las...

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Aquí se presentan métodos detallados para la disección y la tinción de gotas lipídicas de los enocitos en larvas de Drosophila utilizando BODIPY 493/503, un tinte fluorescente específico de gotas de lípidos.

Disección y tinción de gotas de lípidos de los ovenocitos en larvas de Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Este método de una disección de ovenocito y la tinción de gotas lipídicas se puede utilizar para realizar la aparición de gotas lipídicas en el enocito de larvas de drosophila en condiciones normales y estresadas. Este método proporciona una herramienta útil para el estudio del metabolismo de los lípidos no sólo en insectos, sino también en mamíferos con sólo unas pocas modificaciones menores. Para inducir la puesta de huevos, coloque 150 moscas hembra vírgenes y 75 machos de los genotipos deseados en una botella de puesta de huevos y coloque la botella debajo de una caja a prueba de luz en una incubadora de 25 grados centígrados con 60% de humedad.Después de una hora, transfiera las moscas a una botella nueva y deje que las moscas pongan huevos en la botella nueva durante una hora antes de retirar a los adultos. Luego, permita que los huevos se conviertan en las larvas de la tercera estrella durante 84 horas a 25 grados Celcius con un ciclo de 12 horas de luz-oscuridad. Antes de iniciar el tratamiento de hambre, coloque un pedazo de papel de filtro de tamaño adecuado en una placa Petri de seis centímetros y agregue un mililitro de PBS en el papel para crear una cámara de hambre.Para hacer una cámara de tratamiento de control, coloque cinco mililitros de alimentos de harina de maíz estándar Bloomington en un plato Petri de seis centímetros. Cuando las cámaras estén listas, utilice un pequeño pincel de pintura para recoger larvas instar del mismo tamaño aproximado de la botella de puesta de huevos. Y 20 larvas al azar en cada inanición y la cámara de control.A continuación, coloque las cámaras en la incubadora durante 12, 24 o 36 horas de desarrollo y/o inanición. Al final del período de tratamiento, utilice fórceps para transferir suavemente larvas de cada cámara a una placa de disección que contenga PBS frío y coloque la placa bajo un microscopio estéreo. Orientar el primer lado ventral de la larva hacia arriba y utilizar fórceps para sostener suavemente la larva en su lugar.Coloque un alfiler a través de la faringe y otro alfiler a través del espiráculo para fijar la larva a la placa. Utilice las tijeras de resorte Vannas para realizar una incisión longitudinal a través de la epidermis desde el extremo anterior hasta el extremo posterior del animal. Utilice fórceps para extraer el tejido interno de la epidermis, teniendo cuidado de evitar daños a los oenocitos en la superficie interna de la epidermis.A continuación, utilice fórceps para recuperar los pines de disección y transferir la epidermis a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros de PBS sobre hielo. Para la tinción de gotas lipídicas, incubar la epidermis diseccionada en el tampón de fijación durante 30 minutos a temperatura ambiente en un rotador, seguido de una resuspensión rápida en un mililitror de PBS. A continuación, lave las muestras con tres lavados de cinco minutos en un mililitro de PBS por lavado para eliminar cualquier fijador residual.Después del último lavado, incubar las muestras epidérmicas con una sonda lipofílica apropiada durante 30 minutos a temperatura ambiente en un rotador. Durante la incubación, envuelva los tubos de muestra en papel de aluminio para proteger los tejidos de la luz y lave las muestras tres veces en un mililitro de PBS durante 10 minutos por lavado. Para imaginar los enocitos, transfiera cada muestra de epidermis a seis microlitros de medio de montaje en una diapositiva de microscopio limpia, ajuste la orientación del tejido, de modo que la superficie interna que contiene los oenocitos toque la parte inferior de la diapositiva.Coloque suavemente un cubreobjetos sobre la epidermis y selle los bordes con esmalte de uñas transparente. Cuando el esmalte se haya secado, imagine las muestras en un microscopio confocal, coloque un aumento de 63 X con las longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas. Hay algunas gotas de lípidos detectables dentro de los ovenocitos de larvas de alimentación normal en diferentes etapas del desarrollo.Sin embargo, como se observa en estas imágenes representativas, las gotas lipídicas aumentan en número dentro de los ovenocitos en respuesta a períodos de hambre de 12, 24 y 36 horas. Este método proporciona y proporciona un protocolo fácil y factible para que los investigadores en los campos de investigación relevantes investiguen si las manipulaciones genéticas o ambientales causan cambios en las gotas de lípidos en las células.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection of Drosophila Ovaries

Dissection of Drosophila Ovaries Video (Video) | JoVE

La disección de los ovarios Drosophila

Investigación

Biología

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster Video (Video) | JoVE

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae Video (Video) | JoVE

La disección de los discos imaginales de 3er estadio las larvas de Drosophila

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

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De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

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Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

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La disección en vivo de Drosophila Los embriones: métodos simplificados para la detección colecciones mutantes tinción con anticuerpos

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In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

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