Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من خلال منحة من المؤسسة الوطنية للعلوم (MCB 1818310) إلى سلاح الجو الملكي البريطاني. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المرفق الأساسي للبيولوجيا الكيميائية / وحدة علم البلورات البروتينية في مركز H. Lee Moffitt للسرطان (NIH / NCI: P30-CA076292).

1. إعداد المواد
<ol><li>تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): 137 mM NaCl ، 2.5 mM KCl ، 10 mM NaH2PO4 ، و 2 mM KH2PO4 ، الرقم الهيدروجيني 7.41.</li>
	<li>تحضير صبغة NTA-Atto 647 N. قم بتخفيف صبغة NTA-Atto 647 N إلى 100 نانومتر من محلول DMSO بنسبة 100٪ إلى PBS بدون Tween.</li>
	<li>Express Vam7-His8 – البروتين كبروتين اندم...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

وفر تحديد Vam7-His8binding إلى DiC8-PA KD مناسبا قويا للتفاعل المعطى ، وهو تقارب أقل قليلا من KD المقاس من Vam7-His8 إلى الجسيمات الشحمية PA (غير المنشورة). ويرجع هذا الاختلاف على الأرجح إلى عدم وجود غشاء، مما يؤدي عموما إلى انخفاض التقارب مع تفاعلات ربط الدهون الخاصة بالغشاء، ...

الرحلان الحراري المجهري هو تقنية جديدة نسبيا في تحديد ثوابت فك الارتباط (KD) وكذلك ثوابت التثبيط (IC50) بين الأربطة ذات الصلة كيميائيا حيويا. تقدم شركة التجزئة التجارية الرائدة في مجال MST (على سبيل المثال ، NanoTemper) تقنيتين شائعتين من تقنيات MST: 1) MST خالية من الملصقات تتطلب علامة فلورسنت ، و 2) الرحلان الحراري المسمى باستخدام التألق المتأصل للبروتينات التي تعتمد على عدد المخلفات العطرية الموجودة في كل بروتين 1. من عيوب الرحلان الحراري الخالي من الملصقات أنه في معظم الحالات ، لا يسمح بقياس تفاعلات البروتين والبروتين. ومع ذلك ، قد يكون من الممكن هندسة البروتينات بدون أحماض أمينية عطرية مثل التربتوفان لاستخدامها في الرحلان الحراري الخالي من الملصقات 2.
يقيس MST حركة الجسيمات استجابة لتحريض حقول درجة الحرارة المجهرية التي بدأها ليزر الأشعة تحت الحمراء في التقنيات المتاحة حاليا1. يمكن استخدام MST لقياس التفاعلات بين البروتين والبروتين ، والتفاعلات بين البروتين والدهون ، وجزيء البروتين الصغير ، وتجارب المنافسة ، وحتى التفاعلات بين الجزيئات الصغيرة طالما يمكن للمرء أن ينتج ما يكفي من فصل الإشارة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح MST بقياس التفاعلات القائمة على البروتين الغشائي المضمنة في الجسيمات الشحمية أو الأقراص النانوية. يستفيد الرحلان الحراري المسمى من استخدام العلامات الموسومة بالفلورسنت مما يسمح بفصل الإشارة الذي يمكن التحكم فيه كيميائيا بين الرباط والتحليل. يمكن الحصول على قيم KD باستخدام الرحلان الحراري للتفاعلات التي تنطوي على ربط البروتين بتركيزات نانومولية منخفضة ، والتي تكون في معظم الحالات تركيزا أقل بكثير من البروتين مما هو مطلوب لقياس السعرات الحرارية المتساوية الحرارة (ITC)3. بالإضافة إلى ذلك ، ليس لدى MST متطلبات تخزين مؤقت صارمة كما هو مطلوب لرنين البلازمون السطحي (SPR)4 ويمكن حتى استخدام الرحلان الحراري المسمى لقياس ثوابت ربط البروتينات ذات الأهمية من محاليل البروتين غير النقية بالكامل 5 مع علامات الفلورسنت المدرجة وراثيا 6. عيب MST هو أنه لا يمكن الحصول على المعلمات الحركية بسهولة ل MST كما هو الحال في SPR2.
تعتمد قياسات الرحلان الحراري على اختلاف درجة الحرارة المحلية للمحلول. يمكن توليد هذه الحرارة من ليزر الأشعة تحت الحمراء. يحتوي جهاز MST على كاشف تألق مقترن بشعاع الأشعة تحت الحمراء (IR) ويمكنه التقاط التغيرات في التألق من تغيرات التركيز المحلي لجزيئات الفلورسنت عند النقطة التي يتم فيها استهداف ليزر الأشعة تحت الحمراء. يستخدم جهاز MST ليزر مستهدف بالأشعة تحت الحمراء مقترنا مباشرة بكاشف التألق الذي يركز على نفس النقطة التي يتم فيها توليد الحرارة في المحلول. وهذا يسمح بالكشف القوي عن التغيرات في درجة الحرارة المقابلة لنضوب الجزيئات عند نقطة الحرارة الناتجة عن ليزر الأشعة تحت الحمراء. يتناقص التألق المقاس بشكل عام بالقرب من ليزر الأشعة تحت الحمراء استجابة لزيادة درجة الحرارة. يمكن أن تكون الاختلافات التي تم قياسها نتيجة لذلك بسبب عوامل متعددة بما في ذلك الشحنة أو الحجم أو إنتروبيا الحل. يتم قياس هذه الاختلافات على أنها تغيرات في التألق استجابة لتحريض الحرارة أو حركة الجزيئات من الأجزاء الساخنة إلى الباردة من الشعيرات الدموية.
عند تحميل الشعيرات الدموية بمحلول معين ، من المهم ترك الهواء في أي من طرفي الشعيرات الدموية وعدم تحميل الشعيرات الدموية بالكامل بالكامل. الشعيرات الدموية التجارية تحمل حوالي 10 ميكرولتر من المحلول. يمكن للمرء تحقيق قياسات دقيقة باستخدام 5 ميكرولتر من المحلول طالما يتم التلاعب بالمحلول إلى مركز الشعيرات الدموية ، ولا توجد فقاعات هواء (يحتمل أن تكون degas قبل تحميل الشعيرات الدموية) ، والمرء حريص على تحميل الرف لعدم تزاحم المحلول من مركز الشعيرات الدموية ، حيث يتم استهداف ليزر الأشعة تحت الحمراء. إذا لم يتلامس الليزر بشكل كامل مع المحلول ، فمن المرجح أن تكون النتيجة واحدة من ثلاثة مخرجات غير قابلة للاستخدام لهذا التركيز: 1) عدم وجود أو اكتشاف تألق منخفض ، 2) اكتشاف تألق أعلى (يحتمل أن يكون مع ذروة خشنة) ، أو 3) اكتشاف التألق ضمن قيم أخرى من المعايرة بالتحليل الحجمي ، ولكن مع ذروة خشنة وغير مستديرة.
بالنسبة للرحلان الحراري المسمى ، من الأفضل أن يكون لديك إشارة تألق أعلى من 200 وحدة تألق وأقل من 2000 وحدة تألق7. يستخدم جهاز MST مجموعة من كثافات LED من 0 إلى 100 ، والتي يمكن اختيارها لتحقيق إشارة أعلى من 200 أو أقل من 2000. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام تركيزات مختلفة من الليغاند المسمى لتعديل إشارة التألق إلى المستوى الأمثل. من المهم إجراء فحص للغطاء باستخدام قياس MST معين كمرجع عند تحليل البيانات ، حيث يمكن أن يؤدي فحص الغطاء الضعيف في كثير من الأحيان إلى نقطة قد يتم تحديدها لاحقا على أنها شاذة. يجب أن يستغرق كل تشغيل حوالي 30 دقيقة إذا تم قياس طاقة MST واحدة باستخدام فحص الغطاء. تسمح الأجهزة التجارية بإجراء تغييرات في طاقة MST. في إصدارات البرامج القديمة ، يمكن تعيين هذا من 0 إلى 100 ؛ وفي الإصدارات الأحدث ، يمكن للمرء تحديد MST منخفض أو متوسط أو مرتفع. لتحقيق آثار قوية ، قد يحتاج الباحث إلى تجربة كل من هذه وتحديد إعداد MST الذي ينتج عنه أقوى البيانات لتفاعل معين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

تعد القدرة على تحديد التقارب المرتبط للدهون بالبروتينات جزءا أساسيا من فهم التفاعلات بين البروتين والدهون في الاتجار بالأغشية ونقل الإشارات وإعادة تشكيل الهيكل الخلوي. وتشمل الأدوات الكلاسيكية لقياس هذه التفاعلات رنين البلازمون السطحي (SPR) وقياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC). في حين أن هذه الأساليب قوية ، إلا أنها تنطوي على انتكاسات. يتطلب مركز التجارة الدولية كميات كبيرة من البروتين النقي وكذلك الدهون ، والتي يمكن أن تكون مكلفة ويصعب إنتاجها. وعلاوة على ذلك، فإن مركز التجارة الدولية وكذلك SPR يستهلكان وقتا طويلا جدا، مما قد يضيف بشكل كبير إلى تكلفة إجراء هذه التجارب. إحدى الطرق لتجاوز هذه القيود هي استخدام تقنية جديدة نسبيا للرحلان الحراري المجهري (MST). MST سريع وفعال من حيث التكلفة باستخدام كميات صغيرة من العينة للحصول على منحنى تشبع لحدث ربط معين. يوجد حاليا نوعان من أنظمة MST المتاحة. يتطلب نوع واحد من MST وضع العلامات باستخدام الفلوروفور في الطيف الأزرق أو الأحمر. يعتمد النظام الثاني على التألق الجوهري للأحماض الأمينية العطرية في نطاق الأشعة فوق البنفسجية. يكتشف كلا النظامين حركة الجزيئات استجابة للتحريض الموضعي للحرارة من ليزر الأشعة تحت الحمراء. كل نهج له مزاياه وعيوبه. يمكن أن يستخدم MST الخالي من الملصقات بروتينات أصلية غير موسومة ؛ ومع ذلك ، فإن العديد من التحليلات ، بما في ذلك المستحضرات الصيدلانية ، الفلوريس في نطاق الأشعة فوق البنفسجية ، والتي يمكن أن تتداخل مع تحديد قيم KD الدقيقة. وبالمقارنة، يسمح MST المسمى بتنوع أكبر في التفاعلات الزوجية القابلة للقياس باستخدام مجسات تحمل علامات فلورسنت متصلة بالأربطة ذات الامتصاص القابل للقياس في النطاق المرئي بدلا من الأشعة فوق البنفسجية، مما يحد من إمكانية تداخل الإشارات من التحليلات.

هذا هو إخراج عينة باستخدام تحليل التقارب. تم استخدام MST المسمى لتحديد ثابت ربط Vam7-His8 إلى ثنائي الأوكتانويل القابل للذوبان (DiC8) PA لإحدى ركائزه الطبيعية9. يعرض الشكل 1 الآثار الحرارية من تجربة واحدة لمعايرة 1: 1 من DiC8 PA بدءا من 500 ميكرومتر مقابل 50 نانومتر من Vam7-His8. يتم...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

يحصل الرحلان الحراري المجهري على ثوابت ربط بسرعة بتكلفة مادية منخفضة. إما الرحلان الحراري المجهري المسمى أو الخالي من التسمية متاح تجاريا. ومع ذلك ، فإن الرحلان الحراري الخالي من الملصقات غير قادر على تنوع قياسات التفاعل التي يمكن إجراؤها باستخدام ملصقات الفلورسنت. نحن نقدم بروتوكولا لقياسات الرحلان الحراري الموسومة.

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

يحصل الرحلان الحراري المجهري المسمى على ثوابت الانفصال ، أو KDs ، من التفاعلات الكيميائية الحيوية المتنوعة بكفاءة. يعطي هذا البروتوكول والفيديو المصاحب التقارب التقريبي ل Vam7 ، وهو بروتين SNARE الوحيد القابل للذوبان في الخميرة ، إلى حمض الفوسفاتيديك. هذه هي الطريقة التي يرتبط بها Vam7 بغشاءين قبل التفاعل مع البروتينات الأخرى.تحصل هذه الطريقة على KDs بسرعة للتفاعلات الكيميائية الحيوية المتنوعة بتكلفة منخفضة ، مع قابلية عالية للتكرار وبأقل تكلفة للبروتين. هذه التقنية مناسبة للمرحلة الأولى من التطوير الصيدلاني ، مما يسمح بالحصول على KDs بسهولة لتحديد مركبات الرصاص المحتملة. قبل البدء في التحليل ، قم بتشغيل مفتاح الطاقة الموجود في الجزء الخلفي من جهاز MST وافتح برنامج التحكم.تأكد من توصيل الكمبيوتر بالجهاز وفي حالة الاتصال وقم بتعيين MST قبل 3 ثوان ، و MST إلى 30 ثانية ، و Fluorescence Recovery إلى بعد 1 ثانية. لكل أنبوب شعري، أدخل اسم الرباط المستهدف، واسم تحليل الليكاند، وتركيز الهدف، وأعلى تركيز معايرة بالتحليل الحجمي باستخدام نسبة المعايرة بالتحليل الحجمي للتعبئة التلقائية. حدد نطاقا من قوى MST وأدخل قيما لكل طاقة لاختبار أقوى ملاءمة للربط.لإعداد عينات MST المصنفة ، قم بتخفيف محلول Vam7-octahistidine إلى تركيز 200 نانومولار وصبغة NTA-Atto 647 إلى تركيز 100 نانومولار ، كلاهما في PBS. امزج Vam7-octahistidine وصبغة NTA-Atto 647 بنسبة حجمية 1: 1 واسمح للخليط بالجلوس في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي لخليط الصبغة والبروتين وتخزين المحلول عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى بضع ساعات قبل الاستخدام.ثم ، قم بإعداد العينة ، وخذ الرباط المصبوغ وفضح التحليل. بالنسبة للرحلان الحراري المجهري للعينة ، افتح الجهاز وحرك الرف الشعري للخارج. قم بتحميل الشعيرات الدموية للعينة في الحامل بأعلى تركيز في الموضع الأول وحدد القناة الحمراء في برنامج التحكم.ثم قم بتحميل الرف في الجهاز. ثم حدد نطاقا من طاقة MST وابدأ قياس MST لمسح Cap Scan وقم بتقييم استجابة التحول. تظهر هنا آثار ثيرموفيرتيك من تجربة واحدة لمعايرة 1: 1 من DiC8 PA بدءا من 500 ميكرومول مقابل 50 نانومولار NTA-Atto 647 المسمى مجال Vam7.يمكن ملاحظة التألق الأولي ، والقفز الزمني ، والرحلان الحراري ، مما يسمح بحساب KD من أي واحد أو مجموعة من هذه القياسات. يمكن رسم منحنى التشبع من هذه النتائج ، على سبيل المثال ، للرحلان الحراري مع إخراج قفزة الوقت ، كما هو موضح في الرسم البياني. بشكل عام ، يتم تحديد نتائج MST باستخدام مقياس السجل ، مع مراعاة تركيز البروتين لتحديد تقارب الارتباط عن طريق اختيار نموذج KD وإدخال تركيز البروتين.عند تنفيذ هذا البروتوكول ، تأكد من أن المحلول في وسط الشعيرات الدموية وأنه لا توجد فقاعات هواء وأن الشعيرات الدموية لا تحتوي على غبار أو محلول على السطح الخارجي للشعيرات الدموية. يمكن استخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة أو رنين البلازمون السطحي للتحقق من صحة الدينار الكويتي التجريبي الذي تم الحصول عليه. وإذا كان هناك ربط تعاوني محتمل، فإن مركز التجارة الدولية سيكون الطريقة المنطقية التالية التي يتم تنفيذها، بالنظر إلى الموارد.وقد مكنت هذه التقنية الباحثين التقليديين في علم الأحياء من دمج تقنيات الفحص البيوفيزيائي في أبحاثهم لتحديد علاقات المسار. أحد الأمثلة على هذه التقنية هو الليزيز الخلوي مع البروتين المستهدف المعبر عنه داخليا ، حيث تعد علامة GFP طريقة جديدة لإجراء فحص تقليدي منسدل.

use-of-microscale-thermophoresis-to-measure-protein-lipid-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

رسم خريطة الموقع ملزم لأبتمر على ATP عن طريق الميكروسكيل Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

الببتيدات اختراق الخلية بيوتينيلاتيد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

قياس تفاعلات البروتينات كروي والخيطية مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) وعبارة ثيرموفوريسيس (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

الطيفية الامتصاص الذري لقياس برك الزنك داخل خلايا الثدييات

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

استخدام عنصر Alu الذي يحتوي على جينات صغيرة لتحليل الحمض النووي الريبي الدائري

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

مُقَسَم غير كهربي لقياس فوسفورية البولي نووكليوتيد من ركائز النيوكليوتيدات الصغيرة

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

التحليل الطيفي للقرص المضغوط لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي والبروتين

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

تتبع النظائر المستقرة وتحليل LC-MS لقياس أنشطة DHODH و SDH

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

تسليط الضوء على المؤلف: المقايسات المستقلة عن الأكسجين لقياس وظيفة الميتوكوندريا في الثدييات  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

المقايسات المستقلة عن الأكسجين لقياس وظيفة الميتوكوندريا في الثدييات

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...