Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من خلال منحة من المؤسسة الوطنية للعلوم (MCB 1818310) إلى سلاح الجو الملكي البريطاني. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المرفق الأساسي للبيولوجيا الكيميائية / وحدة علم البلورات البروتينية في مركز H. Lee Moffitt للسرطان (NIH / NCI: P30-CA076292).

1. إعداد المواد
<ol><li>تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): 137 mM NaCl ، 2.5 mM KCl ، 10 mM NaH2PO4 ، و 2 mM KH2PO4 ، الرقم الهيدروجيني 7.41.</li>
	<li>تحضير صبغة NTA-Atto 647 N. قم بتخفيف صبغة NTA-Atto 647 N إلى 100 نانومتر من محلول DMSO بنسبة 100٪ إلى PBS بدون Tween.</li>
	<li>Express Vam7-His8 – البروتين كبروتين اندم...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

وفر تحديد Vam7-His8binding إلى DiC8-PA KD مناسبا قويا للتفاعل المعطى ، وهو تقارب أقل قليلا من KD المقاس من Vam7-His8 إلى الجسيمات الشحمية PA (غير المنشورة). ويرجع هذا الاختلاف على الأرجح إلى عدم وجود غشاء، مما يؤدي عموما إلى انخفاض التقارب مع تفاعلات ربط الدهون الخاصة بالغشاء، ...

الرحلان الحراري المجهري هو تقنية جديدة نسبيا في تحديد ثوابت فك الارتباط (KD) وكذلك ثوابت التثبيط (IC50) بين الأربطة ذات الصلة كيميائيا حيويا. تقدم شركة التجزئة التجارية الرائدة في مجال MST (على سبيل المثال ، NanoTemper) تقنيتين شائعتين من تقنيات MST: 1) MST خالية من الملصقات تتطلب علامة فلورسنت ، و 2) الرحلان الحراري المسمى باستخدام التألق المتأصل للبروتينات التي تعتمد على عدد المخلفات العطرية الموجودة في كل بروتين 1. من عيوب الرحلان الحراري الخالي من الملصقات أنه في معظم الحالات ، لا يسمح بقياس تفاعلات البروتين والبروتين. ومع ذلك ، قد يكون من الممكن هندسة البروتينات بدون أحماض أمينية عطرية مثل التربتوفان لاستخدامها في الرحلان الحراري الخالي من الملصقات 2.
يقيس MST حركة الجسيمات استجابة لتحريض حقول درجة الحرارة المجهرية التي بدأها ليزر الأشعة تحت الحمراء في التقنيات المتاحة حاليا1. يمكن استخدام MST لقياس التفاعلات بين البروتين والبروتين ، والتفاعلات بين البروتين والدهون ، وجزيء البروتين الصغير ، وتجارب المنافسة ، وحتى التفاعلات بين الجزيئات الصغيرة طالما يمكن للمرء أن ينتج ما يكفي من فصل الإشارة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح MST بقياس التفاعلات القائمة على البروتين الغشائي المضمنة في الجسيمات الشحمية أو الأقراص النانوية. يستفيد الرحلان الحراري المسمى من استخدام العلامات الموسومة بالفلورسنت مما يسمح بفصل الإشارة الذي يمكن التحكم فيه كيميائيا بين الرباط والتحليل. يمكن الحصول على قيم KD باستخدام الرحلان الحراري للتفاعلات التي تنطوي على ربط البروتين بتركيزات نانومولية منخفضة ، والتي تكون في معظم الحالات تركيزا أقل بكثير من البروتين مما هو مطلوب لقياس السعرات الحرارية المتساوية الحرارة (ITC)3. بالإضافة إلى ذلك ، ليس لدى MST متطلبات تخزين مؤقت صارمة كما هو مطلوب لرنين البلازمون السطحي (SPR)4 ويمكن حتى استخدام الرحلان الحراري المسمى لقياس ثوابت ربط البروتينات ذات الأهمية من محاليل البروتين غير النقية بالكامل 5 مع علامات الفلورسنت المدرجة وراثيا 6. عيب MST هو أنه لا يمكن الحصول على المعلمات الحركية بسهولة ل MST كما هو الحال في SPR2.
تعتمد قياسات الرحلان الحراري على اختلاف درجة الحرارة المحلية للمحلول. يمكن توليد هذه الحرارة من ليزر الأشعة تحت الحمراء. يحتوي جهاز MST على كاشف تألق مقترن بشعاع الأشعة تحت الحمراء (IR) ويمكنه التقاط التغيرات في التألق من تغيرات التركيز المحلي لجزيئات الفلورسنت عند النقطة التي يتم فيها استهداف ليزر الأشعة تحت الحمراء. يستخدم جهاز MST ليزر مستهدف بالأشعة تحت الحمراء مقترنا مباشرة بكاشف التألق الذي يركز على نفس النقطة التي يتم فيها توليد الحرارة في المحلول. وهذا يسمح بالكشف القوي عن التغيرات في درجة الحرارة المقابلة لنضوب الجزيئات عند نقطة الحرارة الناتجة عن ليزر الأشعة تحت الحمراء. يتناقص التألق المقاس بشكل عام بالقرب من ليزر الأشعة تحت الحمراء استجابة لزيادة درجة الحرارة. يمكن أن تكون الاختلافات التي تم قياسها نتيجة لذلك بسبب عوامل متعددة بما في ذلك الشحنة أو الحجم أو إنتروبيا الحل. يتم قياس هذه الاختلافات على أنها تغيرات في التألق استجابة لتحريض الحرارة أو حركة الجزيئات من الأجزاء الساخنة إلى الباردة من الشعيرات الدموية.
عند تحميل الشعيرات الدموية بمحلول معين ، من المهم ترك الهواء في أي من طرفي الشعيرات الدموية وعدم تحميل الشعيرات الدموية بالكامل بالكامل. الشعيرات الدموية التجارية تحمل حوالي 10 ميكرولتر من المحلول. يمكن للمرء تحقيق قياسات دقيقة باستخدام 5 ميكرولتر من المحلول طالما يتم التلاعب بالمحلول إلى مركز الشعيرات الدموية ، ولا توجد فقاعات هواء (يحتمل أن تكون degas قبل تحميل الشعيرات الدموية) ، والمرء حريص على تحميل الرف لعدم تزاحم المحلول من مركز الشعيرات الدموية ، حيث يتم استهداف ليزر الأشعة تحت الحمراء. إذا لم يتلامس الليزر بشكل كامل مع المحلول ، فمن المرجح أن تكون النتيجة واحدة من ثلاثة مخرجات غير قابلة للاستخدام لهذا التركيز: 1) عدم وجود أو اكتشاف تألق منخفض ، 2) اكتشاف تألق أعلى (يحتمل أن يكون مع ذروة خشنة) ، أو 3) اكتشاف التألق ضمن قيم أخرى من المعايرة بالتحليل الحجمي ، ولكن مع ذروة خشنة وغير مستديرة.
بالنسبة للرحلان الحراري المسمى ، من الأفضل أن يكون لديك إشارة تألق أعلى من 200 وحدة تألق وأقل من 2000 وحدة تألق7. يستخدم جهاز MST مجموعة من كثافات LED من 0 إلى 100 ، والتي يمكن اختيارها لتحقيق إشارة أعلى من 200 أو أقل من 2000. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام تركيزات مختلفة من الليغاند المسمى لتعديل إشارة التألق إلى المستوى الأمثل. من المهم إجراء فحص للغطاء باستخدام قياس MST معين كمرجع عند تحليل البيانات ، حيث يمكن أن يؤدي فحص الغطاء الضعيف في كثير من الأحيان إلى نقطة قد يتم تحديدها لاحقا على أنها شاذة. يجب أن يستغرق كل تشغيل حوالي 30 دقيقة إذا تم قياس طاقة MST واحدة باستخدام فحص الغطاء. تسمح الأجهزة التجارية بإجراء تغييرات في طاقة MST. في إصدارات البرامج القديمة ، يمكن تعيين هذا من 0 إلى 100 ؛ وفي الإصدارات الأحدث ، يمكن للمرء تحديد MST منخفض أو متوسط أو مرتفع. لتحقيق آثار قوية ، قد يحتاج الباحث إلى تجربة كل من هذه وتحديد إعداد MST الذي ينتج عنه أقوى البيانات لتفاعل معين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

تعد القدرة على تحديد التقارب المرتبط للدهون بالبروتينات جزءا أساسيا من فهم التفاعلات بين البروتين والدهون في الاتجار بالأغشية ونقل الإشارات وإعادة تشكيل الهيكل الخلوي. وتشمل الأدوات الكلاسيكية لقياس هذه التفاعلات رنين البلازمون السطحي (SPR) وقياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC). في حين أن هذه الأساليب قوية ، إلا أنها تنطوي على انتكاسات. يتطلب مركز التجارة الدولية كميات كبيرة من البروتين النقي وكذلك الدهون ، والتي يمكن أن تكون مكلفة ويصعب إنتاجها. وعلاوة على ذلك، فإن مركز التجارة الدولية وكذلك SPR يستهلكان وقتا طويلا جدا، مما قد يضيف بشكل كبير إلى تكلفة إجراء هذه التجارب. إحدى الطرق لتجاوز هذه القيود هي استخدام تقنية جديدة نسبيا للرحلان الحراري المجهري (MST). MST سريع وفعال من حيث التكلفة باستخدام كميات صغيرة من العينة للحصول على منحنى تشبع لحدث ربط معين. يوجد حاليا نوعان من أنظمة MST المتاحة. يتطلب نوع واحد من MST وضع العلامات باستخدام الفلوروفور في الطيف الأزرق أو الأحمر. يعتمد النظام الثاني على التألق الجوهري للأحماض الأمينية العطرية في نطاق الأشعة فوق البنفسجية. يكتشف كلا النظامين حركة الجزيئات استجابة للتحريض الموضعي للحرارة من ليزر الأشعة تحت الحمراء. كل نهج له مزاياه وعيوبه. يمكن أن يستخدم MST الخالي من الملصقات بروتينات أصلية غير موسومة ؛ ومع ذلك ، فإن العديد من التحليلات ، بما في ذلك المستحضرات الصيدلانية ، الفلوريس في نطاق الأشعة فوق البنفسجية ، والتي يمكن أن تتداخل مع تحديد قيم KD الدقيقة. وبالمقارنة، يسمح MST المسمى بتنوع أكبر في التفاعلات الزوجية القابلة للقياس باستخدام مجسات تحمل علامات فلورسنت متصلة بالأربطة ذات الامتصاص القابل للقياس في النطاق المرئي بدلا من الأشعة فوق البنفسجية، مما يحد من إمكانية تداخل الإشارات من التحليلات.

هذا هو إخراج عينة باستخدام تحليل التقارب. تم استخدام MST المسمى لتحديد ثابت ربط Vam7-His8 إلى ثنائي الأوكتانويل القابل للذوبان (DiC8) PA لإحدى ركائزه الطبيعية9. يعرض الشكل 1 الآثار الحرارية من تجربة واحدة لمعايرة 1: 1 من DiC8 PA بدءا من 500 ميكرومتر مقابل 50 نانومتر من Vam7-His8. يتم...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

يحصل الرحلان الحراري المجهري على ثوابت ربط بسرعة بتكلفة مادية منخفضة. إما الرحلان الحراري المجهري المسمى أو الخالي من التسمية متاح تجاريا. ومع ذلك ، فإن الرحلان الحراري الخالي من الملصقات غير قادر على تنوع قياسات التفاعل التي يمكن إجراؤها باستخدام ملصقات الفلورسنت. نحن نقدم بروتوكولا لقياسات الرحلان الحراري الموسومة.

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

يحصل الرحلان الحراري المجهري المسمى على ثوابت الانفصال ، أو KDs ، من التفاعلات الكيميائية الحيوية المتنوعة بكفاءة. يعطي هذا البروتوكول والفيديو المصاحب التقارب التقريبي ل Vam7 ، وهو بروتين SNARE الوحيد القابل للذوبان في الخميرة ، إلى حمض الفوسفاتيديك. هذه هي الطريقة التي يرتبط بها Vam7 بغشاءين قبل التفاعل مع البروتينات الأخرى.تحصل هذه الطريقة على KDs بسرعة للتفاعلات الكيميائية الحيوية المتنوعة بتكلفة منخفضة ، مع قابلية عالية للتكرار وبأقل تكلفة للبروتين. هذه التقنية مناسبة للمرحلة الأولى من التطوير الصيدلاني ، مما يسمح بالحصول على KDs بسهولة لتحديد مركبات الرصاص المحتملة. قبل البدء في التحليل ، قم بتشغيل مفتاح الطاقة الموجود في الجزء الخلفي من جهاز MST وافتح برنامج التحكم.تأكد من توصيل الكمبيوتر بالجهاز وفي حالة الاتصال وقم بتعيين MST قبل 3 ثوان ، و MST إلى 30 ثانية ، و Fluorescence Recovery إلى بعد 1 ثانية. لكل أنبوب شعري، أدخل اسم الرباط المستهدف، واسم تحليل الليكاند، وتركيز الهدف، وأعلى تركيز معايرة بالتحليل الحجمي باستخدام نسبة المعايرة بالتحليل الحجمي للتعبئة التلقائية. حدد نطاقا من قوى MST وأدخل قيما لكل طاقة لاختبار أقوى ملاءمة للربط.لإعداد عينات MST المصنفة ، قم بتخفيف محلول Vam7-octahistidine إلى تركيز 200 نانومولار وصبغة NTA-Atto 647 إلى تركيز 100 نانومولار ، كلاهما في PBS. امزج Vam7-octahistidine وصبغة NTA-Atto 647 بنسبة حجمية 1: 1 واسمح للخليط بالجلوس في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي لخليط الصبغة والبروتين وتخزين المحلول عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى بضع ساعات قبل الاستخدام.ثم ، قم بإعداد العينة ، وخذ الرباط المصبوغ وفضح التحليل. بالنسبة للرحلان الحراري المجهري للعينة ، افتح الجهاز وحرك الرف الشعري للخارج. قم بتحميل الشعيرات الدموية للعينة في الحامل بأعلى تركيز في الموضع الأول وحدد القناة الحمراء في برنامج التحكم.ثم قم بتحميل الرف في الجهاز. ثم حدد نطاقا من طاقة MST وابدأ قياس MST لمسح Cap Scan وقم بتقييم استجابة التحول. تظهر هنا آثار ثيرموفيرتيك من تجربة واحدة لمعايرة 1: 1 من DiC8 PA بدءا من 500 ميكرومول مقابل 50 نانومولار NTA-Atto 647 المسمى مجال Vam7.يمكن ملاحظة التألق الأولي ، والقفز الزمني ، والرحلان الحراري ، مما يسمح بحساب KD من أي واحد أو مجموعة من هذه القياسات. يمكن رسم منحنى التشبع من هذه النتائج ، على سبيل المثال ، للرحلان الحراري مع إخراج قفزة الوقت ، كما هو موضح في الرسم البياني. بشكل عام ، يتم تحديد نتائج MST باستخدام مقياس السجل ، مع مراعاة تركيز البروتين لتحديد تقارب الارتباط عن طريق اختيار نموذج KD وإدخال تركيز البروتين.عند تنفيذ هذا البروتوكول ، تأكد من أن المحلول في وسط الشعيرات الدموية وأنه لا توجد فقاعات هواء وأن الشعيرات الدموية لا تحتوي على غبار أو محلول على السطح الخارجي للشعيرات الدموية. يمكن استخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة أو رنين البلازمون السطحي للتحقق من صحة الدينار الكويتي التجريبي الذي تم الحصول عليه. وإذا كان هناك ربط تعاوني محتمل، فإن مركز التجارة الدولية سيكون الطريقة المنطقية التالية التي يتم تنفيذها، بالنظر إلى الموارد.وقد مكنت هذه التقنية الباحثين التقليديين في علم الأحياء من دمج تقنيات الفحص البيوفيزيائي في أبحاثهم لتحديد علاقات المسار. أحد الأمثلة على هذه التقنية هو الليزيز الخلوي مع البروتين المستهدف المعبر عنه داخليا ، حيث تعد علامة GFP طريقة جديدة لإجراء فحص تقليدي منسدل.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

رسم خريطة الموقع ملزم لأبتمر على ATP عن طريق الميكروسكيل Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

الببتيدات اختراق الخلية بيوتينيلاتيد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

قياس تفاعلات البروتينات كروي والخيطية مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) وعبارة ثيرموفوريسيس (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

الطيفية الامتصاص الذري لقياس برك الزنك داخل خلايا الثدييات

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

استخدام عنصر Alu الذي يحتوي على جينات صغيرة لتحليل الحمض النووي الريبي الدائري

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

مُقَسَم غير كهربي لقياس فوسفورية البولي نووكليوتيد من ركائز النيوكليوتيدات الصغيرة

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

التحليل الطيفي للقرص المضغوط لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي والبروتين

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...